李云琴， 原曉龍， 李 江， 王 毅， 陳 偉

(1.云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室，云南昆明650201；2.國家林草局云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育重點實驗室，云南昆明650201)

思茅松(Pinus kesiya var.langbianensis)為松科(Pinaceae)松屬植物，是云南重要的產(chǎn)脂資源樹種[1]。松脂包含松節(jié)油和松香，思茅松松香年產(chǎn)量超過2.5×105t，松節(jié)油產(chǎn)量超過6×104t。松脂是一種萜類混合物，而萜類化合物(類異戊二烯)在自然界中廣泛存在。根據(jù)異戊二烯的單元可將萜類化合物分為單萜、倍半萜、二萜和三萜等[2]，松節(jié)油就屬于單萜和倍半萜類，松香屬于二萜類。萜類化合物是很多植物化感作用的關(guān)鍵物質(zhì)，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥生產(chǎn)等領(lǐng)域也被廣泛應(yīng)用。

萜類物質(zhì)在植物中主要由甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway，MVA)和甲基赤蘚醇4-磷酸途徑(methylerythritol 4-phosphate pathway，MEP)2條途徑合成[3]。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A合酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase，HMGS)屬于MVA途徑中的第1個催化酶，可以催化1個乙酰輔酶A與乙酰乙酰輔酶A縮合成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A，然后在3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR)的催化下形成異戊烯基焦磷酸(isopentenyl diphosphate)[4]，從而為單萜、二萜等萜類化合物的合成提供前體異戊烯基焦磷酸。目前，HMGS基因已在20余種植物中被克隆，如擬南芥(Arabidopsis thaliana)[5]、樟子松(Pinus sylvestris var.mongolica)[6]、茶樹(Camellia sinensis)[7]等，但尚未見思茅松的相關(guān)報道。因此，從思茅松的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘并克隆得到思茅松HMGS基因的全長序列，通過生物信息學分析預(yù)測該基因，采用轉(zhuǎn)錄模式分析該基因在不同處理和組織中相對表達量。以期為進一步探討HMGS基因在高產(chǎn)脂思茅松二萜類物質(zhì)生物合成中的作用，從而為揭示思茅松高產(chǎn)脂的分子機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

從云南普洱市景谷縣半坡鄉(xiāng)(23°47′47.8″N， 100°27′55.8″E)采集思茅松(0.5 kg＜年產(chǎn)脂量≤30.0 kg)作為高低產(chǎn)脂樣品，高產(chǎn)脂思茅松樣品用于轉(zhuǎn)錄組測序；低產(chǎn)脂個體用于與高產(chǎn)脂個體一同分析基因表達量。樹脂的測定參照文獻[8-9]，用 “V”型下降采脂法。采用物理割傷的方式處理高低產(chǎn)脂的思茅松樹皮，采集處理后0、6和12 h的各組織樣品，并迅速放入液氮中保存帶回實驗室。

1.2 轉(zhuǎn)錄組分析組裝與RNA提取

在對cDNA文庫進行測序之后，通過修剪原始讀取以刪除適配器序列、Q值小于20或不明確堿基(N)的低質(zhì)量讀取來生成高質(zhì)量的干凈讀??；然后使用Trinity平臺(http:∥trinityrnaseq.sf.net.)重新組裝干凈的讀數(shù)；所有的基因被用作檢索Nr、eggNOG、GO、KO和Swissprot數(shù)據(jù)庫(E值＜10-5)的查詢，并用Blast 2 GO軟件進行GO分析(E值＜10-5)；利用KEGG圖譜預(yù)測代謝途徑[9]。

采集高、低脂產(chǎn)量思茅松樹皮，立即液氮冷凍。按照植物總RNA提取試劑盒(康維世紀)說明書分別提取各樣品的RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和質(zhì)量，用Thermo USA的分光光度計檢測濃度。選擇較為完整且濃度適宜的RNA按照RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒(Thermo Scientific)的說明書合成cDNA第一鏈，并將cDNA放入-20℃冰箱中。

1.3 思茅松HMGS基因克隆

以HMGS基因序列為依據(jù)，設(shè)計含有起始密碼子的(PkHMGSF:5′-ATGGCATCTCGTCCAGAGAA-3′)和含有終止密碼子的(PkHMGSR:5′-TTACAATTCATCATGGGTGG-3′)特異引物。以高產(chǎn)脂思茅松樹皮cDNA為模板，PkHMGSF和PkHMGSR為引物，EasyPfu DNA聚合酶進行聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增得到思茅松HMGS全基因片段，命名為PkHMGS。經(jīng)電泳檢測后將目的片段連接到pGEMT載體上，經(jīng)菌落PCR檢測，選擇陽性克隆送往上海生工進行測序。

1.4 思茅松HMGS基因蛋白生物信息學分析

用NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)在線軟件ORFFinder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)推測PkHMGS基因的cDNA序列的蛋白序列，用ProtParam(https:∥web.expasy.org/protparam/)預(yù)測PkHMGS蛋白的理化性質(zhì)。在NCBI中搜索并選擇與PkHMGS蛋白序列同源性較高的其他植物的HMGS蛋白序列，經(jīng)過與思茅松的HMGS蛋白進行多重比對后，用軟件MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.5 思茅松HMGS基因不同組織的表達分析

分別取2μg高低產(chǎn)脂思茅松個體的小枝、樹皮和松針的RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA第一條鏈。用小枝、不同處理的樹皮和松針的cDNA為模板，以特異引物TPkHMGSF和TPkHMGSR進行熒光定量PCR(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)分析，并以阿爾法延長因子基因作為內(nèi)參基因。具體反應(yīng)體系如下:分別向PCR管中加入12.5μL 2×SYBR Green master mix、引物各0.5μL、1μL cDNA、10.5μL的ddH2O。用ABI 7300 Real Time PCR System檢測PkHMGS基因在不同組織中的表達情況，共進行3個生物學重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取與基因克隆

按照植物總RNA提取試劑盒的說明提取各樣品RNA，以含有起始密碼子的PkHMGSF和終止密碼子的PkHMGSR為引物，以高產(chǎn)脂思茅松韌皮部的cDNA為模板，用EasyPfuDNA聚合酶進行PCR擴增獲得目的基因全長。連接后陽性克隆的測序結(jié)果顯示，思茅松HMGS基因開放閱讀框全長1 425 bp(圖1)。

2.2 思茅松HMGS蛋白序列分析

利用ORF Finder以及Prot Param軟件分析PkHMGS基因的蛋白序列，結(jié)果表明PkHMGS基因共編碼474個氨基酸，其相對分子質(zhì)量為53 028.17，理論等電點為5.61。在Blast上用得到的474個氨基酸序列與已知的其他植物的HMGS蛋白序列進行相似性對比(圖 2)，結(jié)果顯示，PkHMGS擁有 HMGS所特有保守序列GNTEIEGVDSTNACYGGTA[10]；思茅松與樟子松(PinussylvestrisCAA65250.1)HMGS的蛋白序列同源性為99.79%，與曼地亞紅豆杉(Taxus×mediaAAT73206.1)HMGS同源性為85.29%，與銀杏(GinkgobilobaAUW64606.1)HMGS同源性為82.70%。

圖2 HMGS蛋白序列比對Figure 2 HMGSprotein sequence alignment

圖1 思茅松HMGS總RNA電泳圖Figure 1 RNA electropherogram of the HMGS gene from P.kesiya var.langbianensis

2.3 系統(tǒng)進化樹分析

在NCBI上獲得其他植物的HMGS蛋白序列，用MEGA 6.0構(gòu)建分子進化樹。結(jié)果表明，進化樹大致分為3個支系，思茅松與裸子植物樟子松(CAA65250.1)、曼地亞紅豆杉(AAT73206.1)、銀杏(AUW64606.1)聚為1個支系，而在裸子植物中，思茅松的HMGS與同為松屬的樟子松的HMGS親緣關(guān)系最近(圖3)，該基因的進化規(guī)律與植物的進化歷程一致。

圖3 思茅松與其他植物HMGS系統(tǒng)進化樹Figure 3 HMGSphylogenetic tree including P.kesiya var.langbianensis

2.4 思茅松HMGS基因在不同組織中的表達分析

以特異引物TPkHMGSF和TPkHMGSR檢測PkHMGS基因在高產(chǎn)脂和低產(chǎn)脂思茅松的樹皮、小枝、松針等組織中的表達量。由圖4可知，在思茅松各組織中，PkHMGS基因在松針中表達量最高，然后從高到低依次為人工創(chuàng)傷后6 h的低產(chǎn)脂思茅松樹皮，人工創(chuàng)傷后12 h的高產(chǎn)脂思茅松樹皮和高產(chǎn)脂的小枝，人工創(chuàng)傷后12 h的低產(chǎn)脂思茅松樹皮，低產(chǎn)脂樹皮，人工創(chuàng)傷后6 h的高產(chǎn)脂思茅松樹皮，低產(chǎn)脂小枝，高產(chǎn)脂樹皮。在高產(chǎn)脂思茅松的樹皮中，PkHMGS基因的人工割傷誘導(dǎo)表現(xiàn)為隨著割脂時間的延長(0～12 h)，表達量逐漸增高，在人工創(chuàng)傷后12 h的樹皮中表達量最高；在低產(chǎn)脂思茅松樹皮中，PkHMGS基因的人工割傷誘導(dǎo)表現(xiàn)為隨著割脂時間的延長(0～12 h)，表達量為先升后降。PkHMGS基因在高低產(chǎn)脂思茅松中的表達量總體表現(xiàn)為松針最高。PkHMGS基因在思茅松受到割脂物理傷害后樹皮中的表達量變化，表明其受到割脂物理傷害的誘導(dǎo)表達。

圖4 思茅松HMGS基因表達譜Figure 4 P.kesiya var.langbianensis HMGS gene expression profile

3 討論與結(jié)論

伴隨著分子生物學的發(fā)展，與萜類物質(zhì)生物合成途徑相關(guān)的酶基因不斷被克隆與研究。MVA途徑是進行萜類化合物合成的重要途徑，而HMGS催化乙酰輔酶A與乙酰乙酰輔酶A縮合生成羥甲基戊二酸輔酶A，再經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)生成異戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)，作為萜類化合物合成的通用前體[10-12]。HMGS是MVA途徑的重要催化酶，其表達強度和含量會影響萜類化合物的含量[7，13]。思茅松是云南重要的松脂資源樹種，松脂中的松香正是二萜類物質(zhì)。這些萜類化合物在植物中具有防御作用，還能調(diào)節(jié)植物的生長和發(fā)育[2，14-15]。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)獲得高產(chǎn)脂思茅松的HMGS序列，并利用RT-PCR技術(shù)首次在思茅松中克隆到一個具完整開放閱讀框的PkHMGS基因，該基因全長為1 425 bp，編碼474個氨基酸。與NCBI中已知植物的HMGS構(gòu)建分子進化樹分析顯示思茅松HMGS與裸子植物HMGS聚為1支，其中與樟子松親緣關(guān)系最近，蛋白序列的同源性為99.79%，符合遺傳進化規(guī)律。生物信息學分析結(jié)果表明，PkHMGS基因含有HMGS蛋白的典型保守序列GNTEIEGVDSTNACYGGTA，說明克隆到的PkHMGS基因?qū)儆?-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因。

不同植株中HMGS基因的組織表達特性不同[16]。熒光定量PCR顯示，PkHMGS基因在思茅松的樹皮、小枝、松針中均有表達，但是松針的表達量較高，以高產(chǎn)脂思茅松松針表達量最高。按照源庫理論(source-sink theory)[17]，“源”是有機物合成和輸出的組織或器官，“庫”則是同化物轉(zhuǎn)化或貯藏的組織或器官[18]，將松針作為源，樹皮作為庫，PkHMGS基因在松針中表達量較高的株系，在其貯藏組織的樹皮中基因表達量較高，最終松脂含量是否也較高，還需要做進一步研究。PkHMGS基因在樹皮中的表達明顯受到割脂物理傷害的刺激，說明割脂誘導(dǎo)可使思茅松的產(chǎn)脂活力增強，PkHMGS基因與松脂代謝相關(guān)。但當高產(chǎn)脂和低產(chǎn)脂思茅松植株受物理傷害的刺激程度和時間不同時，低產(chǎn)脂思茅松PkHMGS基因高量表達的時間比高產(chǎn)脂思茅松短，可能是因為低產(chǎn)脂思茅松樹脂道凝結(jié)快，而高產(chǎn)脂思茅松樹脂道凝結(jié)慢，因而低產(chǎn)脂的思茅松比高產(chǎn)脂的防御機制更強，傷口愈合更快，具體還需要做進一步研究。

有研究表明，HMGS基因可能與3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGR)基因共同協(xié)同調(diào)控整個MVA途徑[13，19-21]，HMGR基因表達量的上調(diào)能夠顯著增加植物的類異戊二烯物質(zhì)含量，同源及異源HMGR基因的過表達，能夠顯著促進受體植株中類異戊二烯物質(zhì)含量的增加[22]。對于PkHMGS下一步的研究也可以考慮利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行遺傳改良來培育高產(chǎn)脂思茅松植株。