邵李娜，Abakari Godwin，羅國(guó)芝,2,3，譚洪新,2,3，楊逸遵

(1.上海海洋大學(xué)上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)際級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306)

斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)食性雜、生長(zhǎng)快、抵抗力強(qiáng)，對(duì)水中懸浮顆粒物有較強(qiáng)的耐受性，可應(yīng)用于生物絮團(tuán)技術(shù)(biofloc technology,BFT)養(yǎng)殖[1,2]。BFT技術(shù)通過絮團(tuán)中的微生物將殘餌、糞便中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)，避免水體中氨氮的積累進(jìn)而實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖水質(zhì)的原位控制術(shù)、并能利用絮團(tuán)促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)[3]。硝化過程被證明是BFT系統(tǒng)中氨氮的主要轉(zhuǎn)化途徑之一，原理是氨氧化微生物( ammonia oxidizing archaea,AOA[4]；ammonia oxidizing bacteria,AOB[5])在氨單加氧酶(ammonia monooxygenase,AMO)催化下將氨氧化成羥氨之后,在羥氨氧化還原酶(hydroxylamine oxidereductase,HAO)作用下被氧化為亞硝酸 ，最后亞硝酸氧化細(xì)菌( nitrite oxidizing bacteria,NOB)通過亞硝酸氧化還原酶(nitrite oxidereductase,NOR)將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽[6]，或是由全程氨氧化微生物主導(dǎo)的單步硝化作用[7-8]。其中，AMO、HAO和NOR則是硝化過程中重要生物酶，催化著硝化反應(yīng)的進(jìn)行，并對(duì)其起到一定的制約作用。

生物絮團(tuán)系統(tǒng)需要添加碳源以維持異養(yǎng)細(xì)菌的生長(zhǎng)，傳統(tǒng)碳源如葡萄糖、糖蜜、甘油等降解迅速，需要頻繁添加，易添加不足或過量。生物可降解塑料如3-羥基丁酸-co-3-羥基戊酸共聚物(poly 3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate,PHBV)、聚-β-羥丁酸(poly-β-hydroxybutyrate,PHB)、聚己內(nèi)酯(polycaprolactone,PCL)等生物可降解聚合物可緩慢釋放有機(jī)物[9,10]，被證明能夠?yàn)锽FT養(yǎng)殖過程提供穩(wěn)定的有機(jī)碳源[9]。研究表明， BFT中添加PHB，可促進(jìn)羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)[11]、羅非魚(Oreochromismossanbicus)[12]、南美白對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[13]等的生長(zhǎng)，并提高其抗病力，Qiao等[14]也發(fā)現(xiàn)PHB在腸道微生物作用下，可提高養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫力和抗病力。在BFT系統(tǒng)中將生物可降解聚合物作為碳源對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物確有裨益，但其對(duì)于硝化過程中硝化酶的影響卻未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過在生物絮團(tuán)中添加PHBV，研究其對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰生長(zhǎng)、水質(zhì)、硝化反應(yīng)速率及其過程中各硝化酶的含量與分布影響，旨在從硝化反應(yīng)各階段的酶的角度，揭示添加PHBV對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰生長(zhǎng)、水質(zhì)及硝化反應(yīng)的影響，進(jìn)一步闡明硝化酶與硝化反應(yīng)的關(guān)系，為BFT中緩釋碳源的添加以及硝化反應(yīng)的優(yōu)化提供理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)斑點(diǎn)叉尾鮰苗購(gòu)于廣東粵強(qiáng)豐水產(chǎn)有限公司，魚苗健康有活力，體重為(9.25±2.53)g,體長(zhǎng)為(8.63±0.8)cm,暫養(yǎng)2周。飼料購(gòu)于通威飼料有限公司，為膨化配合飼料，其營(yíng)養(yǎng)成分為:粗蛋白≥32.0% ，粗纖維≤13.0%，粗脂肪≥4.0%，粗灰分≤15.0%，水分≤12.5%。PHBV顆粒購(gòu)于東莞市凱茜利塑膠原料有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)共6個(gè)養(yǎng)殖桶，有效水體300 L，期間以一臺(tái)羅茨鼓風(fēng)機(jī)(750 W)供給曝氣，維持溶解氧>5 mg/L。實(shí)驗(yàn)分為兩組，每組三個(gè)重復(fù)，第一組不添加PHBV，為對(duì)照組(CL組)，第二組掛袋PHBV 顆粒(300 g)，為實(shí)驗(yàn)組(PHBV組)。實(shí)驗(yàn)開始前，以福建高農(nóng)有限公司出產(chǎn)的鰻鱺飼料(粗蛋白≥ 48%、粗灰分≤ 17%、粗脂肪≥ 4%、水分≤ 10%)為氮源，葡萄糖作為碳源，進(jìn)行生物絮團(tuán)的預(yù)培養(yǎng)，每2 d檢測(cè)總氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽、溶解有機(jī)碳，培養(yǎng)周期為42 d，使初始總固體懸浮物(total suspended solid,TSS)為200 mg/L。培養(yǎng)結(jié)束后，每個(gè)桶放入30尾斑點(diǎn)叉尾鮰魚苗，養(yǎng)殖周期為29 d。每天投喂4次，投喂率為體重的5%。每4 d檢測(cè)水質(zhì)及絮團(tuán)相關(guān)指標(biāo)，養(yǎng)殖期間不換水，不排出絮體，僅補(bǔ)充取樣和蒸發(fā)而損耗的水，并及時(shí)添加小蘇打以穩(wěn)定pH。

1.3 各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)方法及公式

1.3.1 水質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)方法

1.3.2 生長(zhǎng)指標(biāo)計(jì)算公式

成活率(SR)=(N2/N1)×100%

(1)

增重率(WGR)=(W2-W1)/W1×100%

(2)

特定生長(zhǎng)率(SGR)=(lnW2-lnW1)/t×100%

(3)

餌料系數(shù)(FCR)=F/(W2-W1)

(4)

式中，N1：實(shí)驗(yàn)開始魚的數(shù)量；N2：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)魚的數(shù)量；W1：實(shí)驗(yàn)開始時(shí)魚的體重(g)；W2：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)魚的體重(g)；t：養(yǎng)殖天數(shù)(d)；F：飼料投喂量(g)。

1.3.3 絮團(tuán)采樣及檢測(cè)方法

全菌絮團(tuán)采樣時(shí)，每組于3個(gè)反應(yīng)器各取50 mL，混合后經(jīng)高溫滅菌的0.22 μm醋酸纖維濾膜過濾；固著菌絮團(tuán)采樣時(shí)需靜置5～10 min，等絮團(tuán)沉降完全后，將上清液棄置，僅過濾沉降后的絮團(tuán)，將濾膜折疊放入滅菌離心管，置于-20 ℃冰箱存放待測(cè)。

全菌絮團(tuán)及固著菌絮團(tuán)的 AMO、HAO及NOR含量的測(cè)定均采用ELISA試劑盒(上海茁彩生物科技有限公司)測(cè)定，游離菌的AMO、HAO及NOR含量為兩者之差。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA 單因素方差分析，兩組間數(shù)據(jù)結(jié)合獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行均值差異性分析，酶含量數(shù)據(jù)結(jié)合Duncan 氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)及水質(zhì)指標(biāo)

表1 養(yǎng)殖期間斑點(diǎn)叉尾鮰生長(zhǎng)指標(biāo)Tab.1 Growth performance of I.punctatus during cultivation

圖1 養(yǎng)殖過程中及的變化趨勢(shì)Fig.1 Trend of during cultivation

2.2 連續(xù)監(jiān)測(cè)中三態(tài)氮的變化

圖2 養(yǎng)殖過程中TN、TP、DOC及DOC/TAN的變化趨勢(shì)Fig.2 Trend of TN、TP、DOC and DOC/TAN during cultivation

圖3 養(yǎng)殖過程中絮團(tuán)指標(biāo)TSS及FV的變化趨勢(shì)Fig.3 Trend of floc index TSS and FV during cultivation

2.3 連續(xù)監(jiān)測(cè)中硝化酶的變化

圖4 降解10 mg/L NH4Cl三態(tài)氮的變化趨勢(shì)Fig.4 Trend of three-state nitrogen while degradating 10 mg/L NH4Cl

圖5 TAN最高最高(B1/B2)及最高(C)時(shí)刻BFT中固著及游離硝化菌中AMO、HAO、NOR的含量Fig.5 Content of AMO,HAO and NOR of fixed and free nitrifying bacteria in BFT at the time of TAN maximum maximum(B1/B2)and maximum(C)

從固著菌及游離菌來看，PHBV組固著菌中的AMO、HAO、NOR均顯著多于CL組，AMO含量CL組的固著菌無顯著差異，PHBV組則在B2時(shí)顯著大于A、C；HAO含量CL組的固著菌在B1時(shí)刻顯著小于其他兩時(shí)刻，PHBV組則在A時(shí)顯著大于其他兩時(shí)刻；NOR含量CL組的固著菌在B1時(shí)顯著大于A、C，而PHBV組均無顯著差異。除CL組C時(shí)刻N(yùn)OR含量外，兩組固著在生物絮團(tuán)上的硝化細(xì)菌均顯著多于游離于水體的細(xì)菌。PHBV組游離菌中AMO、HAO及NOR的含量與PHBV組并無顯著差異，并未因三者總含量較少而減少，反而提高了CL組整個(gè)水體中游離硝化菌的占比。

3 討論

3.1 PHBV對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰生長(zhǎng)及養(yǎng)殖水質(zhì)的影響

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過29 d的養(yǎng)殖周期，兩組的成活率、增重率、特定增長(zhǎng)率以及飼料系數(shù)均無顯著差異，與Chen等[17]發(fā)現(xiàn)PCL作碳源可促進(jìn)革胡子鯰魚(Clariasgariepinus)生長(zhǎng)的結(jié)果不符，可能是養(yǎng)殖周期短的原因。

3.2 PHBV對(duì)硝化反應(yīng)三態(tài)氮變動(dòng)的影響

3.3 PHBV對(duì)硝化反應(yīng)硝化酶的影響

氨氧化階段是硝化反應(yīng)的第一階段，因氨氧化微生物中的AMO只能氧化非離子氨(NH3)，使其成為硝化作用的限速階段[27-29]。因此雖然本實(shí)驗(yàn)中PHBV組的AMO、HAO、NOR含量均顯著大于CL組，但限制硝化反應(yīng)速率的只有AMO含量，與HAO、NOR含量關(guān)系不大。有研究發(fā)現(xiàn)土壤中的硝化速率與AOB的含量成正比，而與 AOA之間的關(guān)系并不明顯[30,31]，因本實(shí)驗(yàn)無法根據(jù)AMO含量判斷AOA與AOB的具體數(shù)量，因此可能PHBV組AOA的比例較高，導(dǎo)致其AMO含量雖顯著大于CL組，但其硝化速率也并未提高。表明硝化反應(yīng)速率與酶含量并不成正比，即使有著相同酶含量，不同種類的細(xì)菌對(duì)于硝化反應(yīng)的作用也不同，體現(xiàn)了水體微生物的多樣性及復(fù)雜性。

水體中固著在絮團(tuán)上的硝化酶含量要顯著多于游離于水體的，表明硝化細(xì)菌更傾向于固著于載體工作，此結(jié)論與李秋芳等[32]發(fā)現(xiàn)RAS中硝化細(xì)菌是生物膜上的優(yōu)勢(shì)菌的結(jié)論相符。有趣的是，游離硝化菌的酶含量在各時(shí)刻卻較為穩(wěn)定，不會(huì)因總酶量的減少而按比例降低。

4 結(jié)論