黃鈺淇， 李里， 鐘維， 朱磊， 林靜霞， 張嬌， 陳永鋒1，

(1.廣東醫(yī)科大學，廣東 湛江 524023；2.南方醫(yī)科大學皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091)

sprouty蛋白是Hacohen等在1998年果蠅基因譜的研究中發(fā)現的一種蛋白，隨后在哺乳動物中發(fā)現類似物，分別命名為sprouty1、sprouty2、sprouty3、sprouty4。sprouty4蛋白(sprouty4 protein, SPRY4)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路的負性調節(jié)蛋白, 該蛋白的存在使這條信號通路被阻斷，從而起到抑制細胞過度增殖、遷移，調節(jié)細胞分化的作用[1]。皮膚是人體的天然免疫屏障，角質形成細胞(keratinocytes,KC)是其中的重要成分。KC是一種不斷增殖、分化和更新的細胞，其增殖和分化過程受到多種因素影響。目前國內外未見有關SPRY4對KC功能影響的報道。本研究探討SPRY4蛋白對HaCaT細胞的增殖及分化的影響，以為SPRY4調節(jié)KC研究提供前期基礎。

1 材料與方法

1.1 標本來源

人永生化表皮細胞株HaCaT細胞(BNCC100433)購自北納創(chuàng)聯生物科技有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

上、下游引物(上海生工)；異丙醇(廣州化學試劑廠)；氯仿(廣州化學試劑廠)；DEPC水(上海生工)；無水乙醇(廣州化學試劑廠)；Trizol試劑(Invitrogen公司)；SYBRPrimer Ex TaqTMⅡ(TaKara公司)；PrimerScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time,TaKara公司)；CCK-8試劑盒(同仁化學)；FECTTM CP Transfection(銳博生物)；RNA oligo(上海生工)。Bio-rad PCR儀(美國Bio-rad公司)；NanoDrop 分光光度計(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 方法

1.3.1 SPRY4基因敲降 實驗組采用合成即用型化學合成雙鏈小分子RNA(short interfering RNA，siRNA)對HaCaT細胞中的SPRY4基因進行敲降。將HaCaT細胞用血球計數板計數后按4×105個/孔鋪于6孔板，置于培養(yǎng)箱過夜使細胞生長密度達到50%以上；按說明書將Lipofectamine2000制備成轉染復合物混合液，按比例混合無血清的DMEM后加入培養(yǎng)基中；置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。對照組HaCaT細胞不加任何處理。

1.3.2 RT-qPCR驗證SPRY4蛋白敲降 于敲降后48 h后RT-qPCR法檢測細胞中SPRY4 mRNA的表達，RT-qPCR操作按照試劑盒說明書進行。計算兩組細胞中SPRY4 mRNA的相對表達量，同時通過公式計算出各組間SPRY4表達的敲降率，敲降率=1-實驗組mRNA平均表達量/對照組mRNA平均表達量×100%。選擇敲降效果最佳的一組，按照基本相同的實驗條件進行正式實驗。

1.3.3 RT-qPCR檢測兩組分化標志物Involucrin、CK1、CK10 mRNA水平 重復上述操作對HaCaT細胞中的SPRY4進行敲降，驗證敲降成功后，行RT-qPCR檢測siRNA轉染HaCaT細胞48 h后Involucrin、CK1、CK10 mRNA水平。PCR反應采用20 μL反應體系，在無RNA酶八聯管中分別加入10 μL SYBR Prime Ex TaqTM、1 μL cDNA、7 μL DEPC水、前后引物各1 μL(表1)，實驗條件為：預變性：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s,共45個循環(huán)。比較兩組各分化標志物的表達差異。

表1 各組引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3.4 CCK-8計數法檢測HaCaT細胞增殖 細胞消化重懸后計數，以5 000個/孔鋪96孔板，每孔約100 μL細胞懸液；將培養(yǎng)板置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱過夜；按照實驗設計要求轉染siRNA后置于培養(yǎng)箱48 h；分別于0、24、48、72 h每孔加入約10 μL CCK-8試劑，嚴格避光置于培養(yǎng)箱孵育4 h；使用酶標儀單波長測定OD值(檢測波長480 nm)。比較實驗組及對照組HaCaT細胞中SPRY4蛋白被干擾后對細胞增殖的影響。

1.3.5 統計學處理 記錄各個樣本的循環(huán)閾值(cycle threshold valve, Ct),三個副孔間取平均值，ΔCt實驗組=Ctsi-SPRY4-CtGAPDH，ΔCt對照組=Ct空白對照NC-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。最后的數據統計分析用2-ΔΔCt值，表示實驗組與對照組兩組間的相對倍數關系即表達量。實驗組與對照組各指標mRNA水平相對表達量比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SPRY4蛋白對HaCaT細胞分化的影響

RT-qPCR法證實，與空白對照組相比，實驗組的HaCaT細胞SPRY4 mRNA表達降低，敲降率為94.75%，表明實驗組SPRY4基因敲降成功。進一步檢測分化標志物Involucrin、CK1、CK10 mRNA水平，結果顯示，siRNA轉染HaCaT細胞48 h后，與對照組相比，實驗組HaCaT細胞Involucrin、CK1、CK10 mRNA表達量降低(圖1)，其中實驗組與對照組SPRY4 mRNA水平比較，t=119.3，P<0.000 1; Involucrin mRNA水平比較，t=32.96，P=0.000 9；CK1比較，t=30.32，P=0.001 1；CK10比較，t=119.3，P<0.000 1；提示隨著SPRY4的表達降低，HaCaT細胞分化能力減弱。

圖1 siRNA轉染HaCaT細胞48 h后Involucrin、CK1、CK10 mRNA表達Fig.1 mRNA expression of Involucrin, CK1 and CK10 after transfection of siRNA into HaCaT cells for 48 h.

2.2 SPRY4蛋白對HaCaT細胞增殖的影響

CCK-8法檢測結果顯示，與空白對照組相比，干擾48 h實驗組與對照組OD值差異最大，說明實驗組由于SPRY4被敲降導致細胞數目不斷增多，且增殖速率超過細胞正常生長速率，提示SPRY4的表達降低能夠促進角質形成細胞的增殖(圖2)。

圖2 CCK-8實驗檢測實驗組和對照組細胞增殖的變化Fig.2 The changes in cell proliferation in the experimental group and the controls.

3 討論

銀屑病是由細胞免疫系統激活，多因素多通路作用引起的以角質形成細胞異常增殖為特點的慢性皮膚病。銀屑病和角質形成細胞之間的關系密切，雖然近年來有大量的實驗和臨床研究，但影響角質形成細胞增殖的因素及其與銀屑病發(fā)病機制的關系仍不明確。SPRY4蛋白是MAPK信號通路的負性調節(jié)蛋白，MAPK是一種絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶[2]，研究表明，銀屑病患者皮損處MAPK活性明顯升高，MAPK信號轉導通路在銀屑病的發(fā)病中起重要作用[3]。被激活的MAPK磷酸化，通過與血管內皮生長因子作用促進血管形成，在表皮中促進細胞生長、增殖、調節(jié)免疫應答而參與銀屑病的發(fā)病過程。

SPRY蛋白作為腫瘤的負性調節(jié)蛋白可以在細胞水平上通過調節(jié)MAPK/ERK和其他途徑來調控增殖、分化、運動和存活。在功能缺失和表達減少時，細胞增殖異常導致腫瘤的發(fā)生[4]。有文獻報道SPRY4蛋白在乳腺癌衍生細胞系[5]、膠質母細胞瘤[6]、肝門周圍膽管癌[7]等腫瘤中可以干擾細胞的增殖和遷移，并且成為評估預后的因素和潛在的治療靶標。SPRY4蛋白在角質形成細胞與銀屑病發(fā)病機制中可能存在重要作用，但仍需進一步證實。

本研究顯示,采用siRNA基因敲降技術抑制HaCaT細胞中SPRY4的表達能夠促進HaCaT細胞增殖，由此證明SPRY4對KC增殖功能具有一定的影響。Involucrin是交聯包膜的蛋白前體,它可作為表皮角質細胞早期分化的標記;CK是表皮KC的主要結構蛋白和分化的早期標志物，隨著基底細胞分化,CK的表達可轉變?yōu)镃K1及CK10[8]。因此，采用相同實驗參數對HaCaT細胞分化指標Involucrin、CK1與CK10進行驗證，發(fā)現SPRY4表達降低的情況下，HaCaT細胞分化功能被同向抑制。

綜上所述，本實驗在細胞層面初步證實了SPRY4蛋白與角質形成細胞之間存在相關性，為后續(xù)開展銀屑病的通路和治療靶點研究提供了前期實驗基礎和研究思路。未來需進一步研究SPRY4蛋白是否通過MAPK通路在角質形成細胞中對銀屑病發(fā)揮調控作用，并開展動物實驗研究SPRY4蛋白在咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病模型中對KC的增殖、分化的影響，為銀屑病的治療靶點提供新思路。