劉小鳳， 杜鵬， 鄭和平， 吳興中， 沈守星， 魏秋姣

(1.珠海市慢性病防治中心，廣東 珠海 519000；2.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091)

淋病是由淋球菌(Neisseriagonorrhoeae)引起的常見性傳播疾病。WHO估計2016年在15～49歲的人群中，淋病新發(fā)數(shù)為8 700萬，女性的感染率為0.9%，男性為0.7%[1]。2018年我國淋病報告發(fā)病數(shù)位居乙類傳染病的第4位[2]，廣東為高發(fā)省份。珠海毗鄰港澳，人口流動頻繁，2014-2017年珠海地區(qū)淋病發(fā)病率逐年上升,其中2017年較2016年上升53.11%,2018年有所下降[3],控制淋病蔓延成為防控的重點。國際上普遍采用淋球菌多抗原序列分型(Neisseriagonorrhoeaemulitantigen sequence typing,NG-MAST)對淋球菌進行基因分型，該方法對淋球菌的分子流行病學(xué)以及基因的遺傳和變異的研究提供很大的幫助[4-5]。本研究對珠海市2018-2019年全市性病監(jiān)測哨點收集的淋球菌菌株進行了NG-MAST基因分型，初步了解其流行特點，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株收集

利用珠海市淋球菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，于2018-2019年在全市16家性病監(jiān)測哨點收集淋球菌菌株,共172株，所有菌株經(jīng)革蘭氏染色、分離培養(yǎng)、糖發(fā)酵以及氧化酶鑒定確定為淋球菌。

1.2 試劑與儀器

裂解液(達安公司)，PCR擴增試劑(TAKARA)。淋球菌培養(yǎng)皿(梅里埃公司)，PCR儀(ABI公司)，凝膠電泳儀(伯樂公司)。

1.3 淋球菌DNA的提取

將收集的淋球菌接種于GC培養(yǎng)皿，5%濃度CO2、36 ℃培養(yǎng)18～20 h。培養(yǎng)結(jié)束后挑取若干菌落于200 mL生理鹽水中，13 000 rpm離心5 min，去上清，加入50 μL裂解液，100 ℃ 10 min后13 000 rpm 離心5 min，-20 ℃保存。

1.4 基因擴增與測序

淋球菌porB和tbpB基因片段擴增的引物和反應(yīng)條件參照文獻[6]進行，擴增結(jié)束后采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的條帶。擴增產(chǎn)物送華大公司進行測序。

1.5 NG-MAST分型

porB基因序列以已知序列(GenBank號：M21289)為參考，截取第455位堿基開始的490 bp長的片段，tbpB基因序列以已知序列(GenBank號：U65222)為參考，截取第1 118位堿基開始的390 bp長的片段。將截取后的片段在www.ng-mast.net網(wǎng)站進行比對，最后綜合各片段的型別在該網(wǎng)站獲得該菌株型別。

1.6 系統(tǒng)進化樹的繪制

采用MEGA6軟件以NJ法繪制porB、tbpB、porB和tbpB整合基因片段的系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 porB、tbpB、NG-MAST型別分布

172株菌株中,共獲得82種porB基因型別、44種tbpB基因型別。porB和tbpB基因型別最多的前幾位依次分別為por2978、por1135、por3215、por1132、por4843和tbp10、 tbp21、tbp110、tbp752、tbp470和tbp566，porB其他基因型別有77種，tbpB其他基因型別有38種。NG-MAST型別共79種，最多的為新型基因型別，其次為ST9659、ST5308、ST8140和ST2268，其他基因型別有74種。詳見表1。

表1 porB、tbpB、NG-MAST型別分布Tab.1 The type distribution of porB，tbpB and NG-MAST

2.2 porB基因型與tbpB基因型的相關(guān)性

對porB基因型相對應(yīng)的tbpB基因型進行分析，發(fā)現(xiàn)兩者具有較好的相關(guān)性，por2978對應(yīng)的優(yōu)勢基因型為tbp21，por3215和por4843對應(yīng)的優(yōu)勢基因型為tbpB10。

2.3 porB、tbpB、NG-MAST系統(tǒng)進化樹

如圖1所示，三個基因系統(tǒng)進化樹顯示各基因具有高度多態(tài)性，porB基因可大概分為3組，大部分Bootstrap值大于50。tbpB基因可大概分為5組，由于基因片段長度短，序列具有高度同源性，特別是10基因型別，Bootstrap小于50。NG-MAST的系統(tǒng)進化樹可大概分為3組，大部分Bootstrap值大于50。

圖1 porB、tbpB、NG-MAST系統(tǒng)進化樹Fig.1 The system evolution tree of porB,tbpB and NG-MAST.

3 討論

目前淋球菌基因分型的方法主要有3種：多位點序列分型(multilocussequence typing,MLST)、抗菌素耐藥性序列分型(sequence typing for antimicrobial resistance,STAR)和MAST。MLST主要用于乳糖奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌的鑒別，STAR主要用于多重耐藥淋病奈瑟菌的監(jiān)測，且MLST、STAR法分析7個位點的操作相對復(fù)雜，耗時長。MAST只需要擴增porB和tbpB兩個基因，操作簡便，同時具有較好的區(qū)分能力，MAST 基因分型可用于分析不同地區(qū)臨床分離株的遺傳相關(guān)性，對某種基因型在世界各地的流行分布情況進行監(jiān)控，主要用于多地區(qū)淋球菌的流行病學(xué)和抗生素耐受的研究[7]。

本研究收集了172株淋球菌，共獲得82種porB基因型別，前三位分別為por2978(13株，占7.6%)、por1135(11株，占6.4%)、por3215(9株，占5.2%)，其它基因型別77種，共127株(73.8%)，其中絕大部分1種基因型只有1株(46/82,61%)或2株(19/82,23.2%)菌株，珠海地區(qū)沒有明顯的porB基因型優(yōu)勢菌株。據(jù)報道山西太原地區(qū)porB的流行基因型為por1132、por2001、por6993[8]，湖南長沙地區(qū)的為por3466、por2978、por4197和por90[9]，廣東地區(qū)未見報道，表明porB基因型具有地區(qū)差異。tbpB基因型別有44種，相對于porB，分布更為集中，前三位分別為tbp10(37株，21.5%)、tbp21(26株，15.1%)、tbp110(13株，7.6%)，其它基因型別38種，共77株(44.7%),其原因可能是由于tbp基因的同源性較高，分辨力不如porB基因。黃美容等[10]對遵義地區(qū)65株淋球菌菌株進行NG-MAST分型，發(fā)現(xiàn)tbp33、tbp4、tbp21為優(yōu)勢基因型，而廣東地區(qū)暫未發(fā)現(xiàn)tbpB優(yōu)勢基因型的報道。綜合兩者的序列，研究得到79種淋球菌的NG-MAST型別，ST最多的基因型依次為ST9659(9株，5.2%)、ST5308(6株，3.5%)、ST8140(6株，3.5%)，沒有明顯的優(yōu)勢基因型。本研究的ST基因型與其它研究有很大的差異，如廣東地區(qū)為ST568、ST270、ST421[11]，廣州地區(qū)為ST1768、ST2083、ST10229[12]，福建三明市和泉州市ST優(yōu)勢菌株為ST1927和ST1866[13]，浙江蕭山市優(yōu)勢基因型是ST18661和ST1927和ST3102[14]。本研究中ST型別單一菌株較多，同時新的基因型別占了33.7%，與Qin等[15]對廣東地區(qū)淋球菌NG-MAST分型發(fā)現(xiàn)新基因型占38%的研究結(jié)果相似，說明 ST基因庫中來自我國的數(shù)據(jù)比較少，需要我國研究者進一步完善。研究顯示porB基因型與tbpB基因型具有較好的相關(guān)性，por2978對應(yīng)的tbp21，por3215和por4843對應(yīng)的tbpB10，是珠海地區(qū)的常見基因型，需要特別關(guān)注。

從基因系統(tǒng)進化樹可以看出，porB、tbpB和MAST型別均具有高度的多態(tài)性。在porb基因型進化樹中，雖然por2978和por1135在同一大簇中，但進化關(guān)系相對較遠。由于tbpB基因片段較短，同源性較高，同一基因型內(nèi)菌株進化關(guān)系不易區(qū)分，占比居前的tbp10、tbp21、tbp110位于不同大簇內(nèi)。NG-MAST系統(tǒng)進化樹可大致分為3個大簇，其中ST5308、ST8140位于同一個大簇，具有一定的生物進化關(guān)系。珠海地區(qū)淋球菌的遺傳背景具有高度的多態(tài)性，可能原因有：①研究的菌株數(shù)量不足；②性伴的菌株沒有收集到；③菌株的選擇壓力過大，基因重組頻繁；④人口流動頻繁，存在較多的ST型別。

各地區(qū)流行菌株遺傳背景的多態(tài)性與新基因型的流行表明了淋球菌NG-MAST分型對淋球菌防治的重要性，需重點關(guān)注珠海淋球菌的優(yōu)勢菌株。由于本研究缺少流行病學(xué)數(shù)據(jù)，無法建立淋球菌的性網(wǎng)絡(luò)，接下來需完善流行病學(xué)調(diào)查資料，并將NG-MAST分型與菌株的耐藥性相結(jié)合，以進一步為淋病的防治提供幫助。