柯迎妹 周樹(shù)波 葛 鋒,2 虞 泓

(1. 昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500；2. 昆明市蟲(chóng)草生物資源開(kāi)發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650100；3. 云南大學(xué)中草藥生物資源研究所云百草實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650091)

蘭坪蟲(chóng)草(Ophiocordycepslanpingensis)為近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的蟲(chóng)草新種，主要成分為蟲(chóng)草多糖、核苷類、甾醇類、氨基酸等[1]，具有顯著的抗疲勞活性[2]，對(duì)小鼠腎功能衰竭和肺纖維化有明顯緩解作用[3-4]。臨床上，諸如慢性腎功能衰竭、肺纖維化等疾病均與免疫系統(tǒng)失調(diào)相關(guān)[5-6]。近年來(lái)，作為免疫調(diào)節(jié)劑，多糖在治療疾病和調(diào)節(jié)免疫力方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[7-8]。其活性與其固有的理化性質(zhì)相關(guān)，包括分子量、官能團(tuán)以及單糖組分等[9]。

試驗(yàn)擬從蘭坪蟲(chóng)草菌粉中提取多糖，分析其分子量、單糖組分及官能團(tuán)特征，并參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中提高免疫力功能的檢測(cè)方法，明確蘭坪蟲(chóng)草多糖(OLP)增強(qiáng)免疫力功能的作用，為蘭坪蟲(chóng)草的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘭坪蟲(chóng)草菌種：經(jīng)云南大學(xué)虞泓教授鑒定為線蟲(chóng)草科線蟲(chóng)草屬，使用部位為蘭坪蟲(chóng)草菌絲體，云南大學(xué)中草藥生物資源研究所云百草實(shí)驗(yàn)室；

BALB/c小鼠：SPF級(jí)，體重18～20 g，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(遼)2015-0001，遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司；

三氟乙酸(TEA)、氯仿：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

環(huán)磷酰胺：分析純，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；

刀豆蛋白(ConA)：美國(guó)Sigma公司；

綿羊紅細(xì)胞(SRBC)：中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；

印度墨汁：北京篤信精細(xì)制劑廠；

Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：日本Takara生物技術(shù)公司；

細(xì)胞周期試劑盒：北京Solarbio生物科技有限公司；

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物：生工生物工程上海股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

低速恒溫離心機(jī)：ST16R型，美國(guó)ThermoFisher Scientific公司；

超聲微波組合反應(yīng)裝置：XO-SM100型，南京先歐儀器制造有限公司；

凝膠色譜儀：PL-GPC 50型，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

氣質(zhì)聯(lián)用儀：GC7890型，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：8700型，美國(guó)ThermoFisher Scientific公司；

酶標(biāo)儀：MMC-GZ-010型，美國(guó)ThermoFisher Scientific公司；

紫外分光光度計(jì)：ΜLtrospec 2100 pro型，美國(guó)Amersham Biosciences公司；

二氧化碳培養(yǎng)箱：E191IR型，美國(guó)金西盟公司；

血液分析儀：LH750型，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；

病理學(xué)切片機(jī)：HM325型，美國(guó)ThermoFisher Scientific公司；

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：LightCycler 96型，瑞士Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 蘭坪蟲(chóng)草多糖的提取 將蘭坪蟲(chóng)草菌粉與超純水按料液比1∶10 (g/mL)混合，沸水浸提2 h，然后進(jìn)行超聲波提取(160 W，45 ℃，30 min)，2 500 r/min離心15 min，上清液旋蒸至原體積的25%，用無(wú)水乙醇以體積比1∶4進(jìn)行醇沉過(guò)夜，4 000 r/min離心10 min，取沉淀溶于適量體積的超純水，通過(guò)Savage方法[10]去除蛋白，并透析2 d，冷凍干燥即得蘭坪蟲(chóng)草多糖。

1.3.2 蘭坪蟲(chóng)草多糖的測(cè)定

(1) 分子量：采用凝膠滲透色譜法。色譜柱：phenomenex PolySep-GFC-P 4000，7.80 mm×300 mm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫35 ℃。

(2) 單糖組成及含量：采用GC-MS法。色譜柱為HP-5氣相色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣量1 μL；初始溫度110 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升溫至160 ℃，再以2 ℃/min升溫至230 ℃，最后以5 ℃/min升溫至250 ℃，保持2 min。

(3) 官能團(tuán)特征分析：采用傅里葉變換紅外光譜法(FT-IR)，掃描頻率4 000～400 cm-1。

1.3.3 動(dòng)物造模、分組及給藥 試驗(yàn)前24 h對(duì)小鼠禁水，不禁食。次日將小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為空白組、模型組、蘭坪蟲(chóng)草多糖低劑量組(0.3 g/kg，OLPL組)、蘭坪蟲(chóng)草多糖中劑量組(0.5 g/kg，OLPM組)、蘭坪蟲(chóng)草多糖高劑量組(1.0 g/kg，OLPH組)。除空白組外，其他小鼠根據(jù)體重每天腹腔注射環(huán)磷酰胺(40 mg/kg)，連續(xù)4 d，建立小鼠免疫抑制模型。造模后，使用相應(yīng)的藥物對(duì)各組小鼠進(jìn)行灌胃，空白組和模型組給予等體積的生理鹽水。試驗(yàn)小鼠每天灌胃一次，連續(xù)30 d。

1.3.4 脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)的測(cè)定 給藥結(jié)束后，處死小鼠，取小鼠脾臟和胸腺，稱重。脾臟或胸腺質(zhì)量和體質(zhì)量比值即為脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。

1.3.5 脾臟組織病理學(xué)檢測(cè) 將脾臟組織固定于10%的中性福爾馬林，乙醇梯度脫水，二甲苯顯色透明，石蠟包埋并切片(厚度4 μm)，然后對(duì)組織切片進(jìn)行蘇木精—伊紅(H&E)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.6 碳粒廓清試驗(yàn) 末次給藥后，將印度墨汁(10 mL/kg)按體重注入小鼠尾靜脈，并計(jì)時(shí)。分別于第2，10 min時(shí)從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，立即加入 0.1%的Na2CO3溶液2 mL。測(cè)定600 nm處光密度值，以Na2CO3溶液為空白對(duì)照。稱量脾臟、肝臟質(zhì)量，按式(1)、(2)計(jì)算吞噬指數(shù)。

(1)

(2)

式中：

α——吞噬指數(shù)；

m1——小鼠體質(zhì)量，g；

m2——肝質(zhì)量，g；

m3——脾質(zhì)量，g；

K——廓清指數(shù)；

OD1——2 min時(shí)的光密度值；

OD2——10 min時(shí)的光密度值；

t1——2 min；

t2——10 min。

1.3.7 抗體生成細(xì)胞檢測(cè) 采用Jerne改良玻片法[11]進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)，抗體生成細(xì)胞數(shù)用溶血空斑數(shù)/106脾細(xì)胞表示。

1.3.8 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 采用MTT法[12]。

1.3.9 細(xì)胞周期的測(cè)定 末次給藥后處死小鼠，無(wú)菌取脾，制備脾淋巴細(xì)胞懸液，加入24孔培養(yǎng)板中，每孔500 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h，取每孔細(xì)胞于4 ℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入1 mL預(yù)冷的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)，輕輕吹打均勻后，繼續(xù)離心5 min，棄上清，重復(fù)上述操作兩次。加入70%冰乙醇1 mL混勻，于4 ℃冰箱過(guò)夜。根據(jù)細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制染色液，4 ℃冰箱保存。取樣品0.5 mL，輕輕吹打，37 ℃避光培養(yǎng)30 min，過(guò)200目尼龍膜，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)1×104細(xì)胞。

1.3.10 細(xì)胞因子基因表達(dá)水平檢測(cè) 使用Trizol試劑盒提取小鼠脾組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)擴(kuò)增程序：95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s；共42個(gè)循環(huán)。引物序列如表1所示。每個(gè)樣品重復(fù)3次，以β-actin作內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算IL-2和IL-10的基因表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)表征

試驗(yàn)測(cè)得OLP分子量為3.2×105Da。由圖1、表2可知，木糖、阿拉伯糖、核糖、鼠李糖、巖藻糖、果糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸的保留時(shí)間分別為20.006，20.520，21.083，22.995，23.449，29.121，29.736，29.983，30.345，31.956 min，OLP主要由甘露糖、半乳糖、葡萄糖組成，且摩爾比為13.38∶5.31∶81.31。

表1 qRT-PCR引物序列信息

圖1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品和蘭坪蟲(chóng)草多糖的GC-MS色譜圖

表2 蘭坪蟲(chóng)草多糖的單糖組分及含量

由圖2可知，O—H/N—H的伸縮振動(dòng)在3 431.59/3 386.17 cm-1處有兩個(gè)連續(xù)的強(qiáng)且寬的吸收帶，C—H和C—O—C的伸縮振動(dòng)峰分別為2 929.43，1 024.07 cm-1，這些區(qū)域的吸收峰為糖類特征峰[13-14]。1 650.59 cm-1處的吸收峰是糖分子中羰基CO的伸縮振動(dòng)峰，即多糖中含有糖醛酸，為酸性多糖；1 419～1 200 cm-1處是羧基的C—O伸縮振動(dòng)引起的吸收峰；1 200～1 000 cm-1處的吸收峰表示蘭坪蟲(chóng)草多糖的糖環(huán)構(gòu)型可能為吡喃環(huán)[15]；950～800 cm-1處為異頭質(zhì)子的C—H彎曲振動(dòng)峰，其中865.01 cm-1處的異頭C—H振動(dòng)峰說(shuō)明具有α-半乳糖，810.43 cm-1處的峰則進(jìn)一步證實(shí)α-甘露糖是蘭坪蟲(chóng)草多糖的單糖成分之一[16]。

圖2 蘭坪蟲(chóng)草多糖的FT-IR圖

2.2 對(duì)小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響

脾臟和胸腺作為外周免疫器官和中樞免疫器官，是參與免疫反應(yīng)的主要場(chǎng)所。免疫器官指數(shù)的變化可以初步反映藥物對(duì)免疫器官以及免疫調(diào)節(jié)是否具有影響[17]。由表3可知，模型組小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著低于空白組(P<0.05)，表明模型組小鼠免疫器官受損；蘭坪蟲(chóng)草多糖給藥組小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均高于模型組，其中OLPH組的升高趨勢(shì)明顯(P<0.05)。故蘭坪蟲(chóng)草多糖可以提高免疫抑制小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，改善環(huán)磷酰胺引起的小鼠免疫器官萎縮，從而提高小鼠的免疫功能。

表3 蘭坪蟲(chóng)草多糖對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響?

2.3 對(duì)小鼠脾臟組織的影響

由圖3可知，空白組小鼠脾臟白髓(WP)與紅髓(RP)邊緣分界清晰，白髓由脾小體和動(dòng)脈周圍淋巴鞘組成，淋巴細(xì)胞密集，紅髓部分的脾索和脾竇結(jié)構(gòu)清晰。模型組的脾小體萎縮、形狀不規(guī)則，淋巴細(xì)胞離散且排列疏松，紅髓充血明顯。蘭坪蟲(chóng)草多糖給藥組小鼠脾臟的淋巴細(xì)胞數(shù)量呈劑量依賴性增加，脾小體結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，紅髓區(qū)域充血現(xiàn)象得到改善。說(shuō)明蘭坪蟲(chóng)草多糖可能通過(guò)增加淋巴細(xì)胞數(shù)量，逐步恢復(fù)脾小體結(jié)構(gòu)，改善紅髓區(qū)域充血來(lái)提高機(jī)體免疫力。

WP. 脾臟白髓 RP. 脾臟紅髓

2.4 對(duì)小鼠碳粒廓清的影響

由表4可知，與空白組相比，模型組小鼠吞噬廓清異體顆粒的能力顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，蘭坪蟲(chóng)草多糖治療組小鼠吞噬廓清異體顆粒的能力依賴劑量有效提高。說(shuō)明蘭坪蟲(chóng)草多糖能增強(qiáng)免疫低下小鼠單核—巨噬細(xì)胞的吞噬能力，改善小鼠的非特異性免疫，從而調(diào)節(jié)免疫功能。

表4 蘭坪蟲(chóng)草多糖對(duì)小鼠碳粒廓清的影響?

2.5 對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞的影響

抗體生成細(xì)胞試驗(yàn)用于體外測(cè)定生成IgM、IgG等抗體的細(xì)胞數(shù)，小鼠被綿羊紅細(xì)胞免疫后，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，與適量的SRBC混合后，在補(bǔ)體的參與下可以溶解抗體分泌細(xì)胞周圍的綿羊紅細(xì)胞，生成空斑，空斑數(shù)量反映了機(jī)體的體液免疫功能[18]。由表5可知，與空白組相比，模型組溶血空斑數(shù)顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，蘭坪蟲(chóng)草多糖給藥組的溶血空斑數(shù)隨給藥劑量的增加逐漸升高，OLPM組和OLPH組的增加效果顯著(P<0.01)。說(shuō)明蘭坪蟲(chóng)草多糖可以促使小鼠抗體生成細(xì)胞的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)抗體的釋放，在一定程度上增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫功能。

表5 蘭坪蟲(chóng)草多糖對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞的影響?

2.6 對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

ConA誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的增殖是一種典型的細(xì)胞免疫，已被廣泛用作淋巴細(xì)胞反應(yīng)性研究中的免疫參數(shù)[19]。由表6可知，與空白組相比，模型組小鼠T淋巴細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，OLPM組和OLPH組小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖能力均顯著增高(P<0.01)，表明蘭坪蟲(chóng)草多糖可以改善環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠ConA誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)造成的抑制，具有明顯增強(qiáng)機(jī)體特異性細(xì)胞免疫功能的作用。

2.7 對(duì)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期是連續(xù)分裂的真核細(xì)胞的增殖周期，可分為分裂間期和分裂期，分裂間期包括G0、G1、S和G2期，其中在S期進(jìn)行染色體復(fù)制[20]。由表7可知，與空白組相比，模型組小鼠T淋巴細(xì)胞在S期的比例降低(P<0.05)，說(shuō)明環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞周期S期受到抑制，細(xì)胞增殖能力減弱。與模型組相比，蘭坪蟲(chóng)草多糖各組小鼠T淋巴細(xì)胞S期比例均有所增加，其中OLPH組的差異顯著(P<0.05)，表明蘭坪蟲(chóng)草多糖對(duì)T淋巴細(xì)胞周期有一定的影響，能緩解環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞進(jìn)入S期的抑制作用，促進(jìn)DNA合成和細(xì)胞增殖，進(jìn)一步說(shuō)明蘭坪蟲(chóng)草多糖對(duì)機(jī)體免疫力的提升可能是通過(guò)增加T淋巴細(xì)胞的數(shù)量來(lái)實(shí)現(xiàn)。

表6 蘭坪蟲(chóng)草多糖對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的影響?

表7 蘭坪蟲(chóng)草多糖對(duì)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞周期的影響?

2.8 對(duì)小鼠IL-2和IL-10基因表達(dá)的影響

IL-2是Thl型細(xì)胞因子，與T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞周期從G1期向S期過(guò)渡相關(guān)，可以促使T淋巴細(xì)胞增殖[21]。由表8可知，與空白組相比，模型組小鼠脾臟中IL-2基因表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，使用OLP后可以顯著增加IL-2基因的表達(dá)量(P<0.01)，蘭坪蟲(chóng)草多糖可有效提高免疫抑制小鼠細(xì)胞因子IL-2的基因表達(dá)水平。結(jié)合細(xì)胞周期的檢測(cè)結(jié)果可知，蘭坪蟲(chóng)草多糖可能通過(guò)增加IL-2的分泌影響T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞周期，促使DNA合成和細(xì)胞增殖。

IL-10由多種細(xì)胞產(chǎn)生，包括Th2細(xì)胞和Th3細(xì)胞，是一種與免疫相關(guān)的多效性細(xì)胞因子，具有免疫調(diào)節(jié)特性的CD41 T細(xì)胞可通過(guò)完全或部分依賴IL-10的機(jī)制起作用[22-23]。而蘭坪蟲(chóng)草多糖還可以增加IL-10的基因表達(dá)水平，OLPM組和OLPH組的IL-10基因表達(dá)量較模型組顯著升高。

表8 蘭坪蟲(chóng)草多糖對(duì)小鼠IL-2和IL-10基因表達(dá)的影響?

3 結(jié)論

從蘭坪蟲(chóng)草菌粉中提取多糖(OLP)，并對(duì)其進(jìn)行單糖組分和官能團(tuán)特征分析，表明OLP主要由甘露糖、半乳糖和葡萄糖構(gòu)成，其摩爾百分比為13.38∶5.31∶81.31，可能是含有糖醛酸和吡喃環(huán)的酸性多糖。對(duì)小鼠免疫力的影響研究表明，OLP可以改善免疫抑制模型小鼠免疫器官受損情況，提高非特異性免疫、體液免疫以及細(xì)胞免疫，初步明確蘭坪蟲(chóng)草多糖具有改善免疫力的功能。后續(xù)將對(duì)蘭坪蟲(chóng)草多糖調(diào)節(jié)免疫活性的機(jī)理進(jìn)行研究，為蘭坪蟲(chóng)草多糖作為保健食品佐劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。