閆倩倩 李 彬 廖梅杰 王印庚 張 正 于永翔 榮小軍 李德軍

山東主要刺參養(yǎng)殖區(qū)幼參腸道抗生素耐藥菌及耐藥基因分布特征*

閆倩倩1,2李 彬2,3廖梅杰2,3①王印庚2,3張 正2,3于永翔2,3榮小軍2,3李德軍4

(1. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院 上海 201306；2. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071； 3. 青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071； 4. 青島市西海岸新區(qū)漁業(yè)技術(shù)推廣站 青島 266400)

為解析目前刺參()苗種攜帶耐藥菌及耐藥基因現(xiàn)狀，本研究從煙臺、威海、青島3個刺參主要養(yǎng)殖區(qū)的6家養(yǎng)殖場采集了幼參，對其腸道內(nèi)容物中常用抗生素的耐藥菌數(shù)量、占比和種類進行檢測。利用熒光定量PCR技術(shù)，對樣本中4類抗生素的7種耐藥基因分布情況進行分析。結(jié)果顯示，所檢測的6個采樣點中均有6種抗生素耐藥菌的檢出，從耐藥菌占比來看，耐藥菌占比最高的種類是乙酰甲喹、萘啶酸和四環(huán)素耐藥菌，占比分別為0.05%~40.06%、2.16%~39.94%和0.06%~23.15%，氟苯尼考、慶大霉素和鏈霉素耐藥菌的占比均不高，占比范圍為0.01%~4.15%。由所分離到的98株耐藥菌的鑒定結(jié)果可以看出，可培養(yǎng)的抗生素耐藥菌分為4門5綱30屬，主要集中在弧菌屬、芽孢桿菌屬和嗜冷桿菌屬，占檢出率的15.30%、13.27%和12.25%?；趯偎降牟煌股啬退幘N類的分布統(tǒng)計結(jié)果顯示，各采樣點耐藥菌種類差異較大，而且弧菌屬、芽孢桿菌屬和嗜冷桿菌屬中均存在同一菌屬中有耐多種抗生素的情況。對6個樣本7種抗生素耐藥基因的豐度檢測結(jié)果顯示，同一類抗生素的不同耐藥基因的含量差異顯著，除氨基糖苷類抗生素耐藥基因的相對拷貝數(shù)比例和鏈霉素以及慶大霉素耐藥菌占比之間存在顯著相關(guān)性(<0.05)外，其他抗生素耐藥基因的豐度與耐藥菌占比之間相關(guān)性不顯著(>0.05)。研究表明，苗期刺參中存在一定的攜帶耐藥菌和耐藥基因的風險。

刺參；腸道；耐藥菌；耐藥基因；熒光定量PCR

隨著環(huán)保風暴和民眾食品質(zhì)量安全意識的提高，對耐藥菌及耐藥基因的研究逐步成為熱點。目前，國內(nèi)外耐藥菌和耐藥基因的相關(guān)研究主要集中在畜禽類糞便(Mu,2015; 張昊等,2018; Brooks,2014)和環(huán)境介質(zhì)等方面(Lin, 2011; Ji, 2012)，針對海水養(yǎng)殖環(huán)境下，養(yǎng)殖動物體內(nèi)的耐藥菌及耐藥基因(Antimicrobial resistant genes, ARGs)方面的研究較少，而在刺參()方面的相關(guān)研究還屬于空白。近年來，刺參養(yǎng)殖在我國北方沿海地區(qū)發(fā)展迅速，并成為沿海地區(qū)重要的支柱性產(chǎn)業(yè)，為沿海漁業(yè)經(jīng)濟發(fā)展提供了重要途徑。但是隨著產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，由于養(yǎng)殖過程中的不規(guī)范操作以及近岸環(huán)境污染等原因，導致疾病頻發(fā)，病害成為海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要瓶頸。使用抗生素成為養(yǎng)殖者進行病害防控的重要手段，而抗生素的大量使用不僅嚴重影響?zhàn)B殖生物的質(zhì)量和安全，也極大地破壞了鄰近海區(qū)的生態(tài)環(huán)境，導致水質(zhì)環(huán)境惡化、藥物殘留、細菌耐藥以及微生態(tài)結(jié)構(gòu)失衡(黨宏月等, 2006; 趙小慧等, 2019; Niu, 2016; Zhang, 2012)。據(jù)統(tǒng)計，2012年我國抗生素年產(chǎn)量約21萬t，其中，有46.1%的抗生素用于禽畜及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)；2013年這一比例上升至52%，且由于吸收和代謝不完全等釋放到河流水體中的抗生素達到了5.38萬t (Zhang, 2015)。此外，食品源動物體內(nèi)殘留的抗生素經(jīng)食物鏈的富集作用也嚴重威脅人類的健康與安全。2016年刺參抗生素事件曾引發(fā)廣泛的社會關(guān)注。除了對于耐藥菌株的關(guān)注外，由于耐藥基因具有持久性存在和可轉(zhuǎn)移性的特性(Tamminen, 2011)，耐藥基因可通過質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移到其他非致病菌或條件致病菌中(張騫月等, 2015)，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和人類健康也存在潛在的威脅(羅義等, 2008; 王瑞旋等, 2010)，因此，亟需對養(yǎng)殖刺參環(huán)境及腸道的耐藥菌現(xiàn)狀進行監(jiān)測。

刺參的養(yǎng)殖主要分為保苗期和池塘養(yǎng)成期2個時期，保苗期具有生長環(huán)境可控的特點，是刺參整個生長周期中的用藥高峰期。目前，刺參苗種培育區(qū)主要包括遼寧和山東2個省區(qū)，其中，山東省苗種產(chǎn)量占全國苗種供應量的60%以上(中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒, 2018)。研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前刺參養(yǎng)殖常用抗生素包括四環(huán)素、萘啶酸、氟苯尼考、乙酰甲喹、慶大霉素和鏈霉素。鑒于此，本研究選取山東省3個主要的刺參主養(yǎng)區(qū)的6家育苗場，開展6個采樣點刺參苗種腸道中耐藥菌數(shù)量、種類及耐藥基因豐度的檢測，以期為解析刺參苗期抗生素耐藥菌及耐藥基因的現(xiàn)狀和防控刺參養(yǎng)殖過程中耐藥細菌的產(chǎn)生提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018年1~4月，在山東省沿海3個刺參主養(yǎng)區(qū) (青島、煙臺和威海)選取6個育苗場采集10月齡的幼參，采樣位點信息見圖1。每個采樣點各隨機采集 50頭刺參帶回實驗室，參苗規(guī)格為(12.35±5.60) g/頭，活體解剖后，獲取其腸道內(nèi)容物，混勻后立即進行細菌培養(yǎng)，其余樣品于–20℃保存。

圖1 采樣點的地理位置

1.2 總可培養(yǎng)細菌和抗生素耐藥菌的培養(yǎng)及所占比例測定

取1 g腸道內(nèi)容物樣品加入1.5%的滅菌NaCl溶液制成10 ml懸液，然后10倍梯度稀釋后分別涂布于滅菌的不含抗生素的2216E平板和分別含單種抗生素的2216E平板上，各種抗生素的濃度參考CLSI (2016)標準(Patel, 2016)和畜禽及水產(chǎn)動物耐藥菌篩選的終濃度進行設(shè)定(李壹等, 2016; 譚愛萍等,2019)，分別為四環(huán)素(50 μg/ml)、萘啶酸(50 μg/ml)、乙酰甲喹(50 μg/ml)、氟苯尼考(50 μg/ml)、慶大霉素(32 μg/ml)和鏈霉素(50 μg/ml)。28℃培養(yǎng)24 h后，根據(jù)相應平板上的菌落數(shù)計算可培養(yǎng)細菌總量及耐藥菌數(shù)量，按照以下公式計算相應抗生素耐藥菌所占比例。

耐藥細菌比例(%)=耐藥細菌數(shù)/可培養(yǎng)細菌總數(shù)× 100%

1.3 抗生素耐藥菌分離純化及鑒定

根據(jù)相應抗生素平板上菌落形態(tài)(菌落大小、邊緣形狀、顏色和透明度等)對所篩選得到的耐藥菌進行分類和優(yōu)勢度統(tǒng)計后，用接種環(huán)挑取優(yōu)勢菌的單菌落，在2216E固體培養(yǎng)基進行2次純化培養(yǎng)和保種。用細菌DNA提取試盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取所分離耐藥菌的細菌DNA，利用細菌16S rDNA通用引物(27F: 5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′, 1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增16S rDNA序列。PCR擴增反應體系為50 μl，擴增程序：94℃預變性5 min；30個循環(huán)：94℃變性60 s，55℃復性60 s，72℃延伸80 s；最后，72℃溫育10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送交生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化、雙向測序，測序結(jié)果在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(http://www.ezbiocloud.net)中比對，確定相應的菌株分類地位。

1.4 腸道中耐藥基因豐度檢測

取0.5 g腸道內(nèi)容物，用E.Z.N.A.TMSoil DNA Kit (OMEGA, 美國)提取總DNA，操作步驟參照試劑盒說明書，DNA的完整性和純度用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用Thermo Nanodrop 2000微量分光光度計(Thermo Scientific, 美國)測定濃度，檢測合格的DNA用于熒光定量PCR檢測。

針對四環(huán)素類、喹諾酮類、氯霉素類和氨基糖苷類這4類抗生素選取7種常見耐藥基因進行定量分析，引物信息見表1。利用PCR對目的片段進行擴增、純化后，連接到pMD18-T vector (TaKaRa)，之后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞進行克隆。利用Plasmid Mini Kit I Protocol (OMEGA, 美國)進行重組質(zhì)粒的提取，以所提取的質(zhì)粒為模板進行實時熒光定量PCR (qRT-PCR)擴增，構(gòu)建相應基因擴增的標準曲線，利用Eppendrof實時熒光定量PCR儀自帶的軟件程序計算各基因擴增的t值、擴增效率()及其相關(guān)系數(shù)(2)。采用qRT-PCR測定6個采樣點樣品中7種耐藥基因和內(nèi)參基因含量，每個樣品設(shè)置3個平行。qRT-PCR反應體系如下：10 μl SYBR Premix ExTMⅡ(2×) (TaKaRa)，上、下游引物(20 μmol/L)各0.8 μl，5 ng DNA模板(約5 ng)，總體積為20 μl。qRT-PCR反應程序：95℃ 1min；95℃10 s，m30 s，72℃ 30 s， 40個循環(huán)。反應結(jié)束后，測定熔解曲線。根據(jù)標準曲線計算各基因拷貝數(shù)的絕對含量，并以各耐藥基因的絕對拷貝數(shù)和16S rDNA絕對拷貝數(shù)的比值來計算各耐藥基因的相對豐度。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

利用SPSS 19.0軟件對四環(huán)素、萘啶酸、氟苯尼考、慶大霉素和鏈霉素5種抗生素耐藥菌所占比例與7種耐藥基因的相對拷貝數(shù)進行線性回歸分析，以< 0.05作為差異顯著水平，確定耐藥菌所占比例和相關(guān)耐藥基因相對拷貝數(shù)的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 可培養(yǎng)抗生素耐藥菌的數(shù)量分析

山東地區(qū)的3個刺參主養(yǎng)區(qū)6個采樣點刺參苗種腸道中可培養(yǎng)細菌與耐藥菌培養(yǎng)結(jié)果見表2。由結(jié)果可知，6個采樣點刺參苗種腸道中可培養(yǎng)細菌總數(shù)為1.37×105~6.21×106CFU/g。6種抗生素耐藥菌的數(shù)量分別為：四環(huán)素耐藥菌的數(shù)量為(3.00±0.50)×103~(1.15±0.30)×105CFU/g；萘啶酸耐藥菌的數(shù)量為(7.77±0.61)× 103~(1.04±0.21)×106CFU/g；氟苯尼考耐藥菌的數(shù)量為(2.33±0.59)×102~(5.17± 0.33)×104CFU/g；乙酰甲喹耐藥菌的數(shù)量為(1.63±0.29)×103~(4.31±0.23)×105CFU/g；慶大霉素藥菌的數(shù)量為(4.00±0.09)×102~(5.90±0.71)× 104CFU/g；鏈霉素耐藥菌的數(shù)量為(1.17±0.62)×103~ (1.13±0.20)×105CFU/g。根據(jù)相應結(jié)果計算耐藥菌在總可培養(yǎng)細菌中的占比(圖2)。由圖2可以看出，同一個采樣點刺參腸道內(nèi)容物中的不同抗生素耐藥菌占比差異顯著。Y1、Y2、Q2單個采樣點均表現(xiàn)出單一種類抗生素耐藥菌豐度高的特點，相應耐藥菌種類分別為四環(huán)素耐藥菌(23.15%)、萘啶酸耐藥菌(37.04%)和萘啶酸耐藥菌(16.76%)。W2采樣點中萘啶酸耐藥菌和乙酰甲喹耐藥菌的占比均很高，分別達到39.94%和40.06%。W1和Q1采樣點雖然有多種抗生素耐藥菌的檢出，但是占比均較低，檢出率最高的萘啶酸耐藥菌的比例也僅為7.32%和6.95%。所有采樣點中氟苯尼考、慶大霉素和鏈霉素耐藥菌的占比均不高，占比范圍為0.01%~4.15%。

2.2 幼參腸道中可培養(yǎng)耐藥菌的分離及鑒定結(jié)果

根據(jù)含抗生素2216E培養(yǎng)基上形成的菌落形態(tài)、顏色、形狀、透明度等表型形態(tài)指標，對篩選得到的耐藥菌進行排重，選取目標菌落分離純化，用于菌株保藏及分類地位鑒定，結(jié)果見表3。由表3可知，共獲得98株耐藥菌株，其中，四環(huán)素、萘啶酸、氟苯尼考、乙酰甲喹、慶大霉素和鏈霉素耐藥菌株分別為18、22、10、14、11和23株。依據(jù)16S rDNA序列的EzBioCloud數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果，可以判斷耐藥菌分別分布在30個屬。屬水平統(tǒng)計結(jié)果顯示，6個采樣點所獲的耐藥菌株分別分布到6、7、13、6、14和8個屬中；所分離到的98株耐藥菌中，檢出率最高的3個屬為弧菌屬()、芽孢桿菌屬()和嗜冷桿菌屬()，分別檢出15株、 13株和12株，占耐藥菌株總數(shù)的15.30%、13.27%和12.25%。

鑒于16S rDNA鑒定結(jié)果在屬水平上的準確性高，根據(jù)相應菌株在屬水平上耐藥菌的分類地位和在抗生素平板上的優(yōu)勢度，統(tǒng)計屬水平上各采樣點不同抗生素耐藥菌種類的豐度分布(圖3)。各采樣點耐藥菌種類差異較大，其中，Y1采樣點的耐藥菌種類豐度較高的菌為嗜冷桿菌屬和假交替單胞菌屬()，Y2采樣點耐藥菌種類主要為芽孢桿菌屬和嗜冷桿菌屬，W2采樣點耐藥菌種類主要為弧菌屬和動性球菌屬()，Q2采樣點耐藥菌種類主要為弧菌屬，以上4個采樣點都存在同一個屬的不同菌株耐多種抗生素的情況。W1和Q1這 2個采樣點耐藥菌種類較多；在W1采樣點同一種抗生素耐藥菌株的多樣性較高；在Q1采樣點耐氟苯尼考、乙酰甲喹和慶大霉素3種抗生素的耐藥菌株各集中于單一屬的細菌中，而耐四環(huán)素、萘啶酸和鏈霉素的耐藥菌株的多樣性較高，分布在4~5個屬中。

表2 不同采樣點可培養(yǎng)細菌及耐藥細菌數(shù)量(CFU/g)

Tab.2 The number of total cultured bacteria and drug-resistant bacteria at different sampling sites (CFU/g)

圖2 各采樣點刺參腸道中不同抗生素耐藥菌占總可培養(yǎng)細菌比例

2.3 各樣品中耐藥基因豐度分析

對刺參腸道中的四環(huán)素類、喹諾酮類、氯霉素類和氨基糖苷類共7種抗生素耐藥基因的標準曲線公式見表1，對7個基因的絕對含量和相對于16S rDNA的相對含量進行測算，結(jié)果見圖4和圖5。所檢測的2個四環(huán)素耐藥基因和拷貝數(shù)絕對含量分別為7.63×104~5.24×105和1.95×106~1.91×107copies/g，相對16S rDNA的含量分別為1.69×10–2~1.01×10–1，同一采樣點拷貝數(shù)是拷貝數(shù)的12~94倍。所檢測的2個喹諾酮類耐藥基因和的拷貝數(shù)絕對含量分別為1.71×103~1.51×104和8.57×104~2.21×108copies/g，相對16S rDNA的含量分別為4.09×10–4~7.87×10–3和3.53× 10–2~4.18×101，同一采樣點拷貝數(shù)是拷貝數(shù)的9~1.02×105倍。所檢測的2個氯霉素類耐藥基因和的拷貝數(shù)絕對含量分別為1.29×105~ 8.66×107和7.25× 104~1.64×107copies/g，相對16S rDNA的含量分別為0.17~16.4和0.28~4.56，同一采樣點拷貝數(shù)是拷貝數(shù)的1.77~78.7倍。氨基糖苷類耐藥基因的拷貝數(shù)絕對含量為1.18×104~1.20×106copies/g，相對16S rDNA的含量為1.56×10–2~ 8.73×10–1。

表3 不同采樣點抗生素培養(yǎng)基篩選到的耐藥菌株數(shù)及屬水平上的種類數(shù)

Tab.3 Number of strains and genera of drug-resistant bacteria screened by antibiotic culture medium at different sampling sites

注：括號外數(shù)字為所分離到的耐藥菌株數(shù)，括號內(nèi)的數(shù)字為根據(jù)16S rDNA鑒定結(jié)果所匹配到的屬水平的種類數(shù)

Note: Data outside the brackets is the number of drug-resistant strains isolated from the antibiotic plates, data inside the brackets is the genus number classified by 16S rDNA sequences

圖3 基于屬水平的各采樣點耐藥菌豐度分布

圖4 刺參腸道中目標耐藥基因的濃度

2.4 耐藥菌總數(shù)和比例與耐藥基因豐度的相關(guān)性分析

針對四環(huán)素、萘啶酸、氟苯尼考、慶大霉素和鏈霉素5種藥物作用下耐藥菌所占比例與對應的7種耐藥基因的相對拷貝數(shù)(基因絕對拷貝數(shù)與16S rDNA基因絕對拷貝數(shù)的比值)分別做線性回歸分析(表4)。結(jié)果顯示，基因相對拷貝數(shù)比例和鏈霉素以及慶大霉素耐藥菌占比之間存在顯著相關(guān)性(<0.05)。除此之外，和與四環(huán)素耐藥菌占比、和與萘啶酸耐藥菌占比、和與氟苯尼考耐藥菌占比之間相關(guān)性不顯著(>0.05)。

圖5 刺參腸道中目標耐藥基因的相對拷貝數(shù)

表4 耐藥菌占比與耐藥基因相對含量的相關(guān)性分析

Tab.4 Analysis of correlation between the percentage of antibiotic-resistant bacteria and the relative abundance of antibiotic resistance genes

3 討論

3.1 幼參腸道中耐藥細菌的數(shù)量特征

水產(chǎn)養(yǎng)殖已經(jīng)成為我國北方沿海重要產(chǎn)業(yè)，養(yǎng)殖過程的疾病頻發(fā)導致了抗生素的廣泛使用。養(yǎng)殖動物腸道微生物在抗生素的選擇壓力下，易產(chǎn)生耐藥性，多項研究證實，抗生素耐藥菌已普遍存在養(yǎng)殖環(huán)境中(張昊等2018; 王嵐等, 2017; 左志晗等,2018)。本研究對山東地區(qū)3個刺參主產(chǎn)區(qū)的刺參苗種腸道中6種抗生素耐藥菌進行了調(diào)查，不同采樣點均獲得了6種抗生素耐藥菌，說明耐藥現(xiàn)象在刺參苗期養(yǎng)殖中普遍存在。6種抗生素中，乙酰甲喹、萘啶酸和四環(huán)素耐藥菌的數(shù)量較高，最高值分別達到了4.31×105、1.04×106和1.15×105CFU/g，占可培養(yǎng)細菌總數(shù)的40.06%、39.94%和23.15%，而氟苯尼考、慶大霉素和鏈霉素耐藥菌的占比相對較低。李壹等(2016)對山東地區(qū)海水養(yǎng)殖環(huán)境中的耐藥菌進行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在山東海水養(yǎng)殖區(qū)存在一定程度的抗生素耐藥性菌，四環(huán)素耐藥菌的比例為22.8%~49.0%，而氟苯尼考占比為0.1%~ 7.1%，說明養(yǎng)殖刺參腸道中的耐藥菌與沿海海水環(huán)境中的耐藥菌相似性較高，可能是由于養(yǎng)殖生物排泄物排入外海以及外海海水引入養(yǎng)殖系統(tǒng)再次使用的交互作用引起的。從3個地區(qū)6個采樣點的耐藥菌占比分布特點還可以看出，同一個地區(qū)不同采樣點各抗生素耐藥菌占比存在很大差異，如Y2中萘啶酸耐藥菌豐度顯著高于Y1，W2中萘啶酸和乙酰甲喹耐藥菌的占比顯著高于W1，相對于Q1耐藥菌種類較多，Q2中僅有萘啶酸耐藥菌是優(yōu)勢耐藥菌，這些情況說明，刺參腸道中耐藥菌的組成和分布除了受外海海水環(huán)境影響外，與不同養(yǎng)殖業(yè)者各自的養(yǎng)殖管理和用藥習慣存在很大關(guān)系。

3.2 幼參腸道中耐藥菌的分類特征

據(jù)98株抗生素耐藥菌的16S rDNA鑒定分類結(jié)果可以看出，耐藥菌檢出率排序：弧菌屬>芽孢桿菌屬>嗜冷桿菌屬>假交替單胞菌屬。這一結(jié)果與Dang等(2007)研究發(fā)現(xiàn)的弧菌是海水養(yǎng)殖環(huán)境最具優(yōu)勢的耐藥菌屬結(jié)論一致?；【图俳惶鎲伟谴虆⒅饕闹虏【?王印庚等, 2006; 逄慧娟等, 2017)，刺參養(yǎng)殖生產(chǎn)中大量使用的抗生素主要針對病原性弧菌和假交替單胞菌，藥物的長期使用易導致其在抗生素選擇的壓力下耐藥性的產(chǎn)生。芽孢桿菌屬細菌作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的益生菌，被廣泛應用于水環(huán)境和養(yǎng)殖動物腸道菌群調(diào)控(Pandiyan, 2013)，本研究中，芽孢桿菌屬細菌在耐藥菌中占較高的優(yōu)勢，可能與養(yǎng)殖環(huán)境中大量使用芽孢桿菌屬的益生菌，再利用抗生素進行疾病防控，導致芽孢桿菌屬細菌產(chǎn)生耐藥性有關(guān)。李研東(2004)利用體外耐藥性誘導實驗誘導出對氟喹諾酮類藥物耐藥的蠟樣芽孢桿菌()，說明芽孢桿菌的耐藥性與抗生素的誘導作用息息相關(guān)。因此，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中益生菌和抗生素的使用應設(shè)置相應的時間差，以降低因抗生素使用帶來的耐藥益生菌產(chǎn)生風險。

3.3 幼參腸道耐藥基因的分布特征

鑒于耐藥基因具有存在的持久性和可轉(zhuǎn)移性，處于可移動元件上的耐藥基因可轉(zhuǎn)移到其他非致病菌或條件致病菌中，較多學者通過檢測ARGs評估耐藥風險。在智利三文魚養(yǎng)殖場(Miranda, 2003)、泰國綜合養(yǎng)魚場(Agers?, 2007)、澳大利亞水產(chǎn)養(yǎng)殖場(Hoa, 2008)和日本金槍魚養(yǎng)殖場(Furushita, 2003)均已經(jīng)檢測到多種ARGs。我國對水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境、養(yǎng)殖廢水和養(yǎng)殖生物(Dang, 2006、2007; Su, 2017; Gao, 2012; Wen, 2016; Huang, 2017)中的耐藥基因檢測結(jié)果表明，水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境及養(yǎng)殖動物體內(nèi)也存在多種ARGs。本研究所檢測的7種抗生素耐藥基因在刺參腸道中均被檢出，進一步證明了相應耐藥菌株的存在。但同一個采樣點同一類抗生素的不同耐藥基因的絕對含量卻存在很大差異，如四環(huán)素耐藥基因的含量遠高于，喹諾酮類耐藥基因的含量高于，這與李壹等(2016)對海水的檢測結(jié)果相似，本研究對氯霉素類 2個耐藥基因和基因表達量檢測也出現(xiàn)了類似的趨勢，即的含量高于，這可能是由于不同基因在環(huán)境中的代謝速率差異以及基因在傳遞過程中的質(zhì)?；蛩拗骶窒拊斐傻?。從不同耐藥基因相對含量與相應耐藥菌占比的相關(guān)性分析可以看出，除基因相對豐度與鏈霉素和慶大霉素耐藥菌占比極顯著相關(guān)(<0.01)外，其他耐藥基因相對豐度與相應抗生素耐藥菌的占比均不存在顯著相關(guān)性。李壹等(2016)對海水中耐藥菌占比和相關(guān)耐藥基因相對豐度的相關(guān)性分析也得出類似結(jié)論，即只有氯霉素相關(guān)耐藥基因和相對拷貝數(shù)比例和氯霉素耐藥菌占比存在顯著相關(guān)性，其他所有基因的相對豐度均與相應耐藥菌占比不存在顯著相關(guān)性。這可能是由兩方面原因造成的：一是可培養(yǎng)細菌占所有細菌的比例很低，目前培養(yǎng)的耐藥菌不能全部反映出總細菌中耐藥菌的占比；二是因為不同耐藥菌基因在不同細菌中的相對拷貝數(shù)和降解速率不同。

綜合以上結(jié)果可以看出，目前，苗期刺參中存在一定的攜帶耐藥菌和耐藥基因的風險，其耐藥菌的分布不僅受外海海水環(huán)境影響，也與不同養(yǎng)殖業(yè)者各自的養(yǎng)殖管理和用藥習慣密切相關(guān)；弧菌屬病原菌和芽孢桿菌屬益生菌的耐藥菌檢出比例較高，提示了抗生素的使用已對致病性耐藥菌和益生耐藥菌的產(chǎn)生造成了一定的威脅；耐藥基因豐度與耐藥菌豐度相關(guān)性不顯著，因此，后期應同時密切關(guān)注二者的分布特征，為評價耐藥風險提供科學依據(jù)。此外，細菌耐藥性在“腸道–環(huán)境–腸道”的循環(huán)中存在傳遞和放大的效應，隨腸道排泄進入環(huán)境的耐藥菌和耐藥基因?qū)O大的增加管控的難度和成本，因此，養(yǎng)殖過程中應密切關(guān)注腸道耐藥細菌和腸道耐藥基因的檢測，建立抗生素使用的監(jiān)測和預警機制，為科學選藥提供依據(jù)，也為研究和推廣降低耐藥菌數(shù)量及耐藥基因豐度的無害化處理過程提供科學參考。

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Distribution Characteristics of Antibiotic Resistant Bacteria and Antimicrobial Resistant Genes in the Intestine of Cultured Sea Cucumber () Seedlings in Shandong Province

YAN Qianqian1,2, LI Bin2,3, LIAO Meijie2,3①, WANGYingeng2,3, ZHANG Zheng2,3, YU Yongxiang2,3, RONG Xiaojun2,3, LI Dejun4

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology(Qingdao), Qingdao 266071; 4. Aquatic Technology Extension Station of Qingdao West Coast New Economic District, Qingdao 266400)

In order to understand the current status of drug-resistant bacteria and drug-resistant genes in the sea cucumber, seedlings were collected from 6 aquaculture farms in Shandong Province. The number, proportion and species of antibiotic-resistant bacteria in the intestinal were tested. Meanwhile, the distribution of seven drug-resistant genes of four classes of antibiotics was analyzed by quantitive real-time PCR (qRT-PCR). The results were listed as follows: All of the six kinds of antibiotic-resistant bacteria are detected at all six sampling sites. According to the proportion of drug-resistant bacteria to total cultured bacteria, the top three highest proportions are mequindox, nalidixic acid and tetracycline-resistant bacteria, with the proportions are 0.05%~40.06%, 2.16%~39.94% and 0.06%~23.15%, respectively. The proportion of florfenicol, gentamicin and streptomycin-resistant bacteria range from 0.01% to 4.15%. The 98 antibiotic-resistant bacteria strains are identified as 4 phyla, 5 classes and 30 genera based on 16S rDNA sequence. The top 3 genera are,andwith the detection rates of 15.30%, 13.27% and 12.25%, respectively. The components of drug-resistant bacteria species varied at different sampling sites, and there are compound antibiotic-resistant strains in,andgenera. The abundances of seven antibiotic resistance genes in six samples show that the contents of different antibiotic resistance genes against the same antibiotic are significantly different. There is significant correlation between the relative copy number ratio of aminoglycoside resistance gene () and the proportion of streptomycin and gentamicin-resistant bacteria. The correlation between the abundance of the other six genes and the proportion of drug-resistant bacteria is not significant. The results indicate that there is a certain risk of drug-resistant bacteria and drug-resistant genes in the seedling stage of sea cumber.

;Intestine; Antibiotic resistant bacteria; Antimicrobial resistant genes; Quantitive real-time PCR

LIAO Meijie, E-mail: liaomj@ysfri.ac.cn

S966.9

A

2095-9869(2020)04-0134-10

10.19663/j.issn2095-9869.20190424001

http://www.yykxjz.cn/

閆倩倩, 李彬, 廖梅杰, 王印庚, 張正, 于永翔, 榮小軍, 李德軍. 山東主要刺參養(yǎng)殖區(qū)幼參腸道抗生素耐藥菌及耐藥基因分布特征. 漁業(yè)科學進展, 2020, 41(4): 134–143

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* 國家重點研發(fā)計劃(2018YFD0901603)、中國水產(chǎn)科學研究院中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金(2018GH10)、中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所級基本科研業(yè)務費(20603022016008)和山東省農(nóng)業(yè)良種工程重大課題(2017LZGC010)共同資助 [This work was supported by National Key R&D Program of China (2018YFD0901603), Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2018GH10), Special Scientific Research Funds for Central Non-Profit Institutes, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences (20603022016008), and Agriculture Seed Improvement Project of Shandong Province (2017LZGC010)]. 閆倩倩，E-mail: qian_qian_1314@126.com

廖梅杰，副研究員，E-mail: liaomj@ysfri.ac.cn

2019-04-24,

2019-05-03

(編輯 馬璀艷)