王鳳嬌 孟憲紅 傅 強(qiáng) 欒 生 隋 娟

基于簡(jiǎn)化基因組測(cè)序的中國(guó)明對(duì)蝦3個(gè)選育世代遺傳多樣性分析*

王鳳嬌1,2,3孟憲紅1,2①傅 強(qiáng)1,2欒 生1,2隋 娟1,2

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

本研究基于簡(jiǎn)化基因組測(cè)序(2b-RAD)技術(shù)，對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦() “黃海2號(hào)” 2015~2017年3個(gè)連續(xù)選育世代(G9~G11)的親本群體、共649個(gè)個(gè)體進(jìn)行了簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，并對(duì)這3個(gè)親本群體進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析。實(shí)驗(yàn)在3個(gè)選育世代中共獲得66985個(gè)SNP位點(diǎn)。遺傳分析的結(jié)果顯示，G9~G11平均核苷酸多樣性(P)分別為0.1439、0.1587和0.1674，平均觀測(cè)雜合度(H)分別為0.1388、0.1515和0.1609，多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.1241、0.1360和0.1430。G9~G11親本群體的遺傳多樣性整體呈現(xiàn)一定的上升趨勢(shì)，但差異不顯著。檢驗(yàn)顯示， 3個(gè)世代總的st值為0.0061，G9~G11相鄰世代群體間遺傳分化程度較弱(G9~G10為0.0029, G10~G11為0.0026)，表明相鄰世代的遺傳距離逐漸減小。3個(gè)世代間基因交流充分，基因流為62.91~94.63。本研究表明，人工定向選育工作的推進(jìn)對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦選育群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響：在固定的選擇壓力下(4%~5%)，親本群體的遺傳多樣性并無(wú)降低的趨勢(shì)，中國(guó)明對(duì)蝦選育群體遺傳分化小，遺傳結(jié)構(gòu)趨向穩(wěn)定。研究結(jié)果為進(jìn)一步制定中國(guó)明對(duì)蝦選育計(jì)劃提供基礎(chǔ)遺傳數(shù)據(jù)和科學(xué)的理論指導(dǎo)。

中國(guó)明對(duì)蝦；選育群體；2b-RAD；SNP；遺傳多樣性

中國(guó)明對(duì)蝦()是中國(guó)近海特有種，主要分布在黃海、渤海海區(qū)的山東、河北、遼寧、天津及江蘇近海和朝鮮半島西海岸(王清印, 2014)。其適應(yīng)能力強(qiáng)、生長(zhǎng)快、耐低溫、品質(zhì)好、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)物種之一。20世紀(jì)80年代，中國(guó)明對(duì)蝦養(yǎng)殖技術(shù)得到突破，中國(guó)明對(duì)蝦的養(yǎng)殖產(chǎn)量迅速增加，1991年總產(chǎn)量達(dá)20萬(wàn)t，成為當(dāng)時(shí)我國(guó)最重要的對(duì)蝦養(yǎng)殖品種(李健等, 2015)。1993年開始暴發(fā)的白斑綜合癥病毒(White spot syndrome virus, WSSV)對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)造成了沉重的打擊。隨之而來(lái)的養(yǎng)殖環(huán)境惡化，種質(zhì)資源衰退等問題，均嚴(yán)重影響了整個(gè)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。為了保護(hù)中國(guó)明對(duì)蝦的種質(zhì)資源，開展優(yōu)良群體的選育工作，培育高產(chǎn)、抗逆的中國(guó)明對(duì)蝦新品種已成為必然。

利用傳統(tǒng)數(shù)量遺傳學(xué)方法在對(duì)蝦選擇育種中進(jìn)行遺傳參數(shù)評(píng)估和遺傳解析已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展(欒生等, 2013; 何玉英等, 2011)。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，相繼涌現(xiàn)出RFLP、AFLP、SSR和SNP等多種分子標(biāo)記技術(shù)，這些分子標(biāo)記技術(shù)為群體的遺傳結(jié)構(gòu)評(píng)估提供新的途徑。SNP標(biāo)記作為遺傳學(xué)研究中最為流行的分子標(biāo)記，與傳統(tǒng)分子標(biāo)記相比，具有在基因組中分布廣泛、密度高、穩(wěn)定遺傳等優(yōu)勢(shì)，是目前水產(chǎn)動(dòng)物高密度遺傳圖譜構(gòu)建、群體遺傳學(xué)研究和種質(zhì)資源保護(hù)利用等領(lǐng)域的理想標(biāo)記(徐安畢等, 2007; Li, 2003; 黃映萍, 2010; 劉安然等, 2019)。然而，水產(chǎn)物種的基因組研究背景相對(duì)滯后，基因組的雜合度和高復(fù)雜性也限制了高通量測(cè)序的應(yīng)用。近年來(lái)，簡(jiǎn)化基因組測(cè)序的發(fā)展為水產(chǎn)物種提供了新的手段。2b-RAD (Wang, 2012)技術(shù)是近年來(lái)在非模式生物中進(jìn)行SNP開發(fā)最為有效、經(jīng)濟(jì)的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序方法之一。該技術(shù)由于具有酶切DNA片段大小一致、文庫(kù)構(gòu)建簡(jiǎn)單快速、標(biāo)簽密度易于調(diào)節(jié)、成本低廉、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛的應(yīng)用。

本研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象中國(guó)明對(duì)蝦“黃海2號(hào)”是采用群體、家系與多性狀復(fù)合育種技術(shù)，經(jīng)連續(xù)選育 13代獲得的新品種。該品種生長(zhǎng)速度快、具有明顯的抗病性(李旭鵬等, 2018)。根據(jù)多性狀復(fù)合育種技術(shù)制定的配種方案，該群體獲得了可觀的遺傳進(jìn)展(Sui, 2018)。但累代人工選育是否會(huì)降低該選育群體的遺傳多樣性、影響中國(guó)明對(duì)蝦的選育效果，尚缺少實(shí)際檢測(cè)數(shù)據(jù)的支撐。目前，雖然已有學(xué)者通過RAPD分析(石拓等, 2001)、線粒體DNA序列分析(張輝等, 2010)、AFLP分析(安麗等, 2008)和SSR分析(張?zhí)鞎r(shí)等, 2005)對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦養(yǎng)殖群體進(jìn)行了遺傳多樣性研究，吳瑩瑩等(2013)利用非探針HRM開發(fā)的39個(gè)SNP，分析了中國(guó)明對(duì)蝦群體的遺傳多樣性。但這些研究的標(biāo)記數(shù)目較低，且尚缺少中國(guó)明對(duì)蝦人工選育群體的分析報(bào)道。本研究利用2b-RAD簡(jiǎn)化基因組技術(shù)，對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦“黃海2號(hào)” G9~G113個(gè)連續(xù)選育世代的親本群體進(jìn)行高通量SNP開發(fā)，并基于這些標(biāo)記分析了遺傳多樣性參數(shù)、群體間遺傳分化和遺傳距離，從分子水平揭示不同世代的群體遺傳結(jié)構(gòu)，了解人工選育方案對(duì)其遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的影響，從而為選育工作提供可靠的理論基礎(chǔ)，確保選育工作順利進(jìn)行。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用中國(guó)明對(duì)蝦“黃海2號(hào)”取自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所水產(chǎn)遺傳育種中心。2015~ 2017年(G9~G11)該育種群體按照多性狀復(fù)合育種的配種方案進(jìn)行家系構(gòu)建、選育。選取在傳代過程中用于構(gòu)建核心家系的親本，置于–80℃超低溫冰柜內(nèi)保存?zhèn)溆?。該親本群體包括2015年137尾、2016年244尾和2017年268尾，共計(jì)649尾。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取和檢測(cè) 采用TIANamp Marine Animals DNA Kit (天根生化科技有限公司，北京)提取中國(guó)明對(duì)蝦肌肉組織基因組DNA，通過瓊脂糖檢測(cè)和NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific)對(duì)抽提的DNA質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測(cè)。DNA產(chǎn)物置于–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 2b-RAD文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序質(zhì)量分析 利用2b-RAD標(biāo)簽串聯(lián)技術(shù)進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，文庫(kù)的構(gòu)建過程參考Wang等(2012)。選用的IIB型限制性內(nèi)切酶為XI，為了得到盡可能多的標(biāo)記，所有樣品均采用標(biāo)準(zhǔn)型5′-NNN-3′接頭建庫(kù)。文庫(kù)質(zhì)控合格后在Illumina Hiseq X Ten平臺(tái)進(jìn)行Paired-end測(cè)序(由 青島歐易生物科技有限公司完成)。原始數(shù)據(jù)下機(jī)后，按照以下條件進(jìn)行過濾：剔除不含有XI酶切識(shí)別位點(diǎn)的序列；剔除低質(zhì)量序列(即大于10個(gè)堿基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于20的序列)；剔除有10個(gè)以上連續(xù)相同堿基的序列。由此獲得可用于后續(xù)標(biāo)記篩查、分型的高質(zhì)量序列。

1.2.3 全基因組SNP篩查和分型 由于中國(guó)明對(duì)蝦尚未有發(fā)表的全基因組序列作為參考，本研究借用課題組前期構(gòu)建的中國(guó)明對(duì)蝦高密度遺傳連鎖圖譜數(shù)據(jù)(標(biāo)記密度為0.41 cM, 尚未發(fā)表)，利用該作圖群體2個(gè)親本構(gòu)建的已有Reference (命名為Family- Reference，該參考標(biāo)簽庫(kù)可靠性已在圖譜構(gòu)建中得到驗(yàn)證)進(jìn)行后續(xù)的標(biāo)記篩查、分型。該Reference是在核心群體中選取2個(gè)性狀差異大的雌雄代表性個(gè)體進(jìn)行測(cè)序標(biāo)簽(Tag)聚類，構(gòu)建的RAD分型參考標(biāo)簽庫(kù)。全基因組標(biāo)記分型參照RAD-typing分型策略(Fu, 2013)。分型過程是將本研究所有測(cè)序個(gè)體(作圖群體的2個(gè)親本)的高質(zhì)量reads，利用SOAP軟件(Li, 2009) (參數(shù)設(shè)置為：–M4–v2–r0)比對(duì)到該Reference上，篩查標(biāo)記位點(diǎn)及分型信息。對(duì)于共顯性的SNP標(biāo)記，利用最大似然法ML得到每個(gè)個(gè)體在每個(gè)位點(diǎn)的基因型。為了保證SNP位點(diǎn)分型的準(zhǔn)確性和嚴(yán)謹(jǐn)性，進(jìn)行以下條件的過濾：在個(gè)體內(nèi)標(biāo)簽深度500以上的不進(jìn)行分型。只留取標(biāo)簽內(nèi)最多有 3個(gè)SNP的標(biāo)簽位點(diǎn)；標(biāo)記在80%的個(gè)體中可以分型；最小等位基因頻率MAF≥0.01。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Genepop軟件(Version 1.0.5) (Rousset, 2008)對(duì)SNP位點(diǎn)的分型結(jié)果進(jìn)行處理，計(jì)算其有效等位基因數(shù)(N)、期望雜合度(H)、觀測(cè)雜合度(H)、多態(tài)信息含量(PIC)、最小等位基因頻率(MAF)和等位基因頻率等遺傳參數(shù)，并計(jì)算世代間的遺傳分化系數(shù)(st)、近交系數(shù)(is)、群體間的遺傳距離(DR)和基因流(N)。利用vcftools軟件(Version 0.1.14) (Danecek, 2011)計(jì)算核苷酸多樣性(P)和轉(zhuǎn)換/顛換(s/v)的比值。使用Admixture軟件(Version 1.3.0) (Alexander, 2009)分析中國(guó)明對(duì)蝦的群體結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA的提取及文庫(kù)的構(gòu)建

提取的基因組DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，圖1為部分基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，提取的基因組DNA無(wú)明顯拖帶現(xiàn)象，完整性較好。用NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)顯示，OD260 nm/OD280 nm在1.8~2.0之間，表明提取的基因組DNA質(zhì)量較高，可用于后續(xù)的建庫(kù)和測(cè)序。

圖1 基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

DNA質(zhì)檢合格后，為了保證每個(gè)文庫(kù)的質(zhì)量，對(duì)構(gòu)建的每個(gè)文庫(kù)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，可直觀的顯示文庫(kù)構(gòu)建是否成功。圖2為聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)文庫(kù)質(zhì)量。

2.2 2b-RAD測(cè)序及SNP分型結(jié)果

本研究基于2b-RAD測(cè)序技術(shù)構(gòu)建中國(guó)明對(duì)蝦649個(gè)樣品的標(biāo)簽測(cè)序文庫(kù)，測(cè)序獲得1217161378條原始Reads，平均每個(gè)樣本測(cè)序Reads數(shù)為28938658。質(zhì)量控制后，平均每個(gè)樣本中獲得含XI酶切位點(diǎn)的高質(zhì)量Reads占測(cè)序原始Reads的74.86%。引用的高質(zhì)量參考(Reference)共包含286345條共顯性標(biāo)簽序列。在對(duì)相同的Reads聚類得到特異性標(biāo)簽后，平均每個(gè)樣本獲得特異性標(biāo)簽數(shù)目為343262，樣本的平均測(cè)序深度為43.08×。3個(gè)選育世代獲得66985個(gè)高質(zhì)量的SNP位點(diǎn)，用于后續(xù)群體遺傳分析。

2.3 中國(guó)明對(duì)蝦SNP突變類型分析

統(tǒng)計(jì)SNP分型結(jié)果中各位點(diǎn)的突變類型特點(diǎn)。如圖2所示，C/T轉(zhuǎn)換類型最多，占所有堿基突變類型的39%，A/G轉(zhuǎn)換類型占14%。G/C顛換類型最少，占所有堿基突變類型的6%，A/C與A/T顛換類型均占14%，G/T顛換類型占8%。轉(zhuǎn)換與顛換(s/v)之比為1.402。

圖2 目的片段PCR產(chǎn)物結(jié)果

2.4 不同世代的SNP遺傳多樣性分析

由于本次分型只統(tǒng)計(jì)了二等位基因型，因此，每個(gè)SNP位點(diǎn)觀測(cè)等位基因數(shù)目(N)均為2。位點(diǎn)的平均分型率為92.47%。結(jié)果顯示(表1)，G9~G11世代有效等位基因(N)平均分別為1.2069、1.2324和1.2475；平均期望雜合度(H)分別為0.1434、0.1584和0.1671；測(cè)得平均觀測(cè)雜合度(H)分別為0.1388、0.1515和0.1609；核苷酸多樣性(P)分別為0.1439、0.1587和0.1674。G9~G11選育世代多態(tài)信息含量(PIC)的均值分別為0.1241、0.1360和0.1430；最小等位基因頻率(MAF)分別為0.1074、0.1038和0.1146。近交系數(shù)分別為0.1141、0.0701和0.0532。

表1 不同世代SNP位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性參數(shù)分析*

Tab.1 Analysis of genetic polymorphism parameters of SNP loci in different generations

*：括號(hào)中的數(shù)據(jù)為平均值

*: Data in brackets are means

2.5 世代間等位基因頻率變化

G9~G11所有位點(diǎn)的平均等位基因頻率分別為86.92%、86.31%和85.87%。3個(gè)世代選育群體野生型等位基因頻率整體呈現(xiàn)一定的下滑趨勢(shì)，但差異并不顯著。從每個(gè)位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)3代等位基因的變化規(guī)律，其中，逐代下降的SNP數(shù)量為20348，占30.38%；逐代上升的SNP數(shù)量為8558，占12.78% (表2)，逐代下降的位點(diǎn)數(shù)是逐代上升位點(diǎn)的2.4倍。從逐代下降的位點(diǎn)中，篩選出50個(gè)變化程度高的位點(diǎn)，變化程度在24.43%~29.76%之間，平均值為27.56%，從逐代上升的位點(diǎn)中，篩選了50個(gè)變化程度高的位點(diǎn)，變化程度在27.16%~30.45%之間，平均值為28.79%，二者之間也無(wú)顯著性差異(=0.552)，圖3和圖4表示選取的50個(gè)具有代表性的等位基因頻率變化情況。

表2 G9~G11世代SNP位點(diǎn)的基因頻率變化規(guī)律

Tab.2 Gene frequency variation of SNP loci in G9~G11 generations

2.6 世代間遺傳變異及分化

群體間總的遺傳分化系數(shù)為0.0061。隨著選育世代的增加，遺傳分化系數(shù)在相鄰世代之間相繼減小，G9與G10間st值為0.0029，G10與G11間st值為0.0026，兩兩比較所得st值均小于0.05，3個(gè)選育世代群體間遺傳分化較弱。從圖6可看出，3個(gè)亞群的波形一致性很高，這再次說明3個(gè)選育世代遺傳分化很弱，遺傳結(jié)構(gòu)基本穩(wěn)定。選育世代間的遺傳距離(DR)范圍為0.0026~0.0040，G9與G10間的遺傳距離為0.0029，G10與G11間的遺傳距離為0.0026，相鄰世代的遺傳距離也逐步減小。G9與G10間的基因流(N)為86.83，G10與G11間的基因流(N)為94.63。

圖3 SNP位點(diǎn)堿基突變類型及其比例

圖4 G9~G11 50個(gè)逐代下降SNP位點(diǎn)的基因頻率變化

圖5 G9~G11 50個(gè)逐代上升SNP位點(diǎn)的基因頻率變化

圖6 中國(guó)明對(duì)蝦樣品聚類結(jié)果

表3 中國(guó)明對(duì)蝦G9~G11世代遺傳分化系數(shù)(st)和遺傳距離(DR)

Tab.3 Genetic differentiation coefficient (Fst) and genetic distance (DR) in G9~G11F. chinensis

注：下三角為群體間遺傳分化系數(shù)(st)，上三角為群體間遺傳距離群體(DR)

Note: The lower triangle is the genetic differentiation coefficient (st) between groups, and the upper triangle is the genetic distance group between groups (DR)

3 討論

3.1 高通量測(cè)序及SNP突變類型分析

由于中國(guó)明對(duì)蝦沒有已發(fā)表的參考基因組序列，依據(jù)RAD-typing的分型策略(Fu, 2013)，需要從測(cè)序數(shù)據(jù)中提取含有酶切識(shí)別位點(diǎn)的Reads，使用ustacks(version 1.34)軟件進(jìn)行聚類，從頭構(gòu)建一個(gè)供分型使用的參考標(biāo)簽庫(kù)(Reference)。本研究在選擇參考標(biāo)簽庫(kù)的過程中，比較了使用2種參考序列(Reference)對(duì)開發(fā)SNP標(biāo)記的影響，即分別利用中國(guó)明對(duì)蝦高密度連鎖圖譜作圖群體2個(gè)親本構(gòu)建的family-Reference以及從選育群體中隨機(jī)選取4個(gè)測(cè)序良好的個(gè)體構(gòu)建的progeny-Reference，使用相同的分型標(biāo)準(zhǔn)對(duì)3代選育群體進(jìn)行分型。對(duì)于2種Reference分型得到的標(biāo)記進(jìn)行比對(duì)，在允許2個(gè)錯(cuò)配的條件下，共比對(duì)到60176個(gè)標(biāo)記，即標(biāo)記共有率為92.45%，2種Reference的基因組覆蓋度和代表性均良好。分型后，分別得到66304和66985個(gè)SNP，2次分型得到的標(biāo)記數(shù)均無(wú)顯著差異。考慮到遺傳圖譜的前期工作基礎(chǔ)，最終確定了family-Reference作為參考序列(待發(fā)表數(shù)據(jù))。經(jīng)過2b-RAD測(cè)序后，每個(gè)樣本得到的原始Reads從29119715~89664272不等。質(zhì)量過濾后，平均每個(gè)樣本中獲得含有XI酶切位點(diǎn)的高質(zhì)量Reads占測(cè)序原始Reads的74.86%，平均每個(gè)個(gè)體的測(cè)序深度為43.08×。說明了本次構(gòu)建的文庫(kù)質(zhì)量較高，測(cè)序深度達(dá)到了高準(zhǔn)確度下的分型標(biāo)準(zhǔn)(Jiao, 2014)。

本研究中選取的每個(gè)世代的測(cè)序樣本數(shù)都不一致(G9選取137尾、G10選取244尾、G11選取268尾)，是由于當(dāng)年需要構(gòu)建的家系數(shù)目不同。理論上，不同的樣本數(shù)會(huì)造成統(tǒng)計(jì)上嚴(yán)謹(jǐn)度的不同，另外，個(gè)體數(shù)量少的G9世代，也有137個(gè)樣本提供分型，因此認(rèn)為，雖然樣品數(shù)量不同但并不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。不同世代樣本數(shù)不同，在遺傳多樣性分析中也有報(bào)道，如Zhang等(2018)曾經(jīng)利用類似的方法對(duì)3個(gè)世代連續(xù)選擇的櫛孔扇貝()進(jìn)行分析，從G1世代抽取76只，G2世代抽取107只，G3世代356只，2b-RAD分型得到的18450個(gè)標(biāo)記進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，也發(fā)現(xiàn)樣本量不同對(duì)結(jié)果幾乎無(wú)影響。

SNP堿基替換類型分為轉(zhuǎn)換(s)與顛換(v)兩類，轉(zhuǎn)換發(fā)生在A與G或C與T之間，顛換有4種，發(fā)生在A與C、A與T、G與C和G與T之間。理論上發(fā)生轉(zhuǎn)換的概率與發(fā)生顛換概率(s/v)比值為0.5，但實(shí)際上s/v值往往大于0.5，這種差異性被稱為“轉(zhuǎn)換性偏差”(Gojobori, 1982; Li, 1984; Collins, 1994)。本研究驗(yàn)證的SNP多態(tài)性類型存在明顯的轉(zhuǎn)換型偏差現(xiàn)象，s/v=1.402>0.5。不同物種間轉(zhuǎn)換/顛換比值存在很大的差距。馬氏珠母貝()血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中，轉(zhuǎn)換與顛換的比值為0.5，與理論比率相符(王忠良等, 2018)。凡納濱對(duì)蝦()轉(zhuǎn)錄組中，轉(zhuǎn)換和顛換的比率為2.0(于洋, 2014)，而鮑中堿基的轉(zhuǎn)換大大多于堿基的顛換，轉(zhuǎn)換與顛換比為2.33 (王鷺驍?shù)? 2006)。產(chǎn)生這種差異的原因可能與不同物種在進(jìn)化中承受的選擇壓力有關(guān)(Zhao, 2002)。

3.2 群體遺傳多樣性

人工定向選育是一個(gè)復(fù)雜的過程，累代的人工選擇壓力及選擇環(huán)境勢(shì)必會(huì)造成群體遺傳水平的波動(dòng)，而遺傳多樣性是生物多樣性的基礎(chǔ)，對(duì)物種的生存、繁衍和進(jìn)化至關(guān)重要(張榮良等, 2016)。人工選擇育種的目的是在保持選育群體具有一定遺傳多樣性的基礎(chǔ)上，篩選獲得具有目標(biāo)性狀的選育新品種或新品系(張榮良等, 2016)。因此，在水產(chǎn)良種培育過程中維持群體的遺傳多樣性，是種質(zhì)資源利用的前提條件。本研究中的3個(gè)選育世代SNP標(biāo)記從整體水平上，野生型的平均等位基因頻率呈現(xiàn)一定的下降趨勢(shì)，但并不顯著，分別為86.92%、86.31%和85.87%。在人工選育的背景下，本研究顯示群體遺傳多樣性沒有明顯變化，推測(cè)原因?yàn)槿斯みx擇只定向改變少數(shù)位點(diǎn)的基因頻率。本研究進(jìn)一步從每個(gè)SNP位點(diǎn)角度統(tǒng)計(jì)等位基因變化規(guī)律，并從其中選取50個(gè)變化程度大的連續(xù)下降和連續(xù)上升的位點(diǎn)(圖4和圖5)，二者等位基因頻率變化程度分別為27.56%和28.79%，無(wú)顯著性差異(=0.552)。這些位點(diǎn)的變化是否與性狀存在遺傳上的相關(guān)性還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

多態(tài)信息含量(PIC)和雜合度是2個(gè)較好的衡量基因多態(tài)性的指標(biāo)。當(dāng)PIC<0.25時(shí)，為低度多態(tài)位點(diǎn)；0.250.5時(shí)，表示該位點(diǎn)為高度多態(tài)性位點(diǎn)(Botstein, 1980)。從本研究統(tǒng)計(jì)結(jié)果來(lái)看，3個(gè)連續(xù)世代的PIC值逐漸升高，PIC分別為0.1241、0.1360和0.1430 (表1)，與吳瑩瑩等(2013)利用非探針HRM法對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦39個(gè)EST-SNP位點(diǎn)進(jìn)行了遺傳多態(tài)性分析，PIC為0.0476~0.375，平均值為0.272的結(jié)果相似。但均比Botstein等(1980)提出的衡量群體基因變異程度低等的標(biāo)準(zhǔn)值低很多。3代選育群體的平均雜合度(H)逐漸上升，分別為0.1388、0.1515和0.1609 (表1)，比利用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行研究所報(bào)道的數(shù)值低(劉萍等, 2004; 張?zhí)鞎r(shí)等, 2005)，產(chǎn)生這樣的結(jié)果應(yīng)該是所用分子標(biāo)記的不同造成的。由于SNP是二等位基因分子標(biāo)記，多態(tài)信息含量比SSR低，但大量位點(diǎn)的應(yīng)用能夠彌補(bǔ)多樣性的不足。隨著選育世代的進(jìn)行，3個(gè)人工選育群體的多態(tài)信息含量和雜合度逐漸增大，該結(jié)果與趙廣泰等(2010)利用微衛(wèi)星分析大黃魚()連續(xù)4代選育群體遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)時(shí)，發(fā)現(xiàn)的F1~F4代13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PIC從0.638下降到0.524，H從0.779下降到0.532的結(jié)果不同，也與馬冬梅等(2018)分析華南鯉()4個(gè)連續(xù)選育世代(F1、F2、F3和F4)的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，PIC從0.6577下降到0.5834，H從0.7943下降到0.7135的結(jié)果有差別。

本研究發(fā)現(xiàn)，3個(gè)世代親本的遺傳參數(shù)有上升的趨勢(shì)(但不顯著)。分析原因可能是與本研究所選取實(shí)驗(yàn)樣品有關(guān)。本研究所用的樣品并不是在選育群體中隨機(jī)抽選的個(gè)體，而是用于構(gòu)建G9~G11代核心家系的親本作為樣品，即這些個(gè)體是依據(jù)育種方案挑選出的性狀優(yōu)良個(gè)體，代表的是下一代群體的遺傳多樣性。選育世代親本遺傳多樣性高低，是下一代遺傳多樣性維持的重要基礎(chǔ)，而本研究親本的遺傳多樣性沒有下降，進(jìn)一步說明我們的育種方案是科學(xué)的，在保證遺傳進(jìn)展的同時(shí)，遺傳多樣性不會(huì)降低。

3.3 世代間的遺傳變化

種群的遺傳分化指數(shù)(st)是衡量群體間遺傳分化程度的重要參數(shù)，根據(jù)Wright (1978)對(duì)遺傳分化指數(shù)的界定，st值介于0~0.05之間，表示群體遺傳分化較弱。在本研究中，群體總遺傳分化指數(shù)為0.0061以及世代間st值均小于0.05 (表2)，說明3年選育世代遺傳分化程度較弱，群體間的遺傳結(jié)構(gòu)差異不顯著。隨著選育世代的增加，相鄰世代間遺傳距離呈減小趨勢(shì)，說明隨著選育時(shí)間的推進(jìn)，選育群體的遺傳背景趨于一致，遺傳結(jié)構(gòu)趨向穩(wěn)定，也體現(xiàn)了人工定向選擇的效應(yīng)?；蛄鲝?qiáng)弱對(duì)種群遺傳分化也具有重要影響，基因流N<1，表明由于遺傳漂變發(fā)生了分化；N>1，表明遺傳分化較??；N>4，表明群體間的基因交流更充分，遺傳分化更小。3個(gè)選育世代親本的基因流值為62.91~94.63，3個(gè)選育世代間基因交流非常充分，群體間的遺傳分化很小。由于中國(guó)明對(duì)蝦是一年生物種，遺傳變異程度低，對(duì)固定性狀的人工選擇并沒有在整個(gè)基因組上產(chǎn)生明顯的影響，因此遺傳分化程度低。

本研究采用2b-RAD技術(shù)對(duì)連續(xù)選育的中國(guó)明對(duì)蝦“黃海2號(hào)”G9~G113個(gè)世代共計(jì)649個(gè)親本進(jìn)行了簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，共獲得66985個(gè)SNP用于群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)變化的評(píng)估，研究表明，隨著人工定向選育工作的推進(jìn)，對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦選育群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響，但中國(guó)明對(duì)蝦選育群體遺傳分化相當(dāng)小，遺傳結(jié)構(gòu)趨向穩(wěn)定，親本的遺傳多樣性并無(wú)降低的趨勢(shì)。研究結(jié)果為下一步制定中國(guó)明對(duì)蝦選育計(jì)劃提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考。

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WANG Fengjiao1,2,3, MENG Xianhong1,2①, FU Qiang1,2, LUAN Sheng1,2, SUI Juan1,2

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao 266071;2. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071; 3. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306)

Using a reduced-representation genome sequencing (2b-RAD) technique, this study performed genome-wide single-nucleotide polymorphism (SNP) screening of 649 individuals selected from three consecutive breeding generations (G9~G11) in a population ofnamed “Huanghai 2”. Genetic structure and genetic diversity of the parents’ population were further analyzed using these markers. In total, 66985 SNPs were developed and genotyped in the 649 shrimp. A genetic analysis showed that the average nucleotide diversities (P) were 0.1439, 0.1587, and 0.1674 in G9, G10, and G11, respectively. The average observed heterozygosities (H) were 0.1388, 0.1515, and 0.1609, respectively. The polymorphic information contents (PIC) were 0.1241, 0.1360, and 0.1430. Genetic diversity parameters of the G9~G11parent population showed an undisputed upward trend, although it was not significant. An-test showed that the totalstvalue of all three generations was 0.0061, and the degree of genetic differentiation between adjacent generations was weak (G9~G100.0029, G10~G110.0026). Genetic distances of adjacent generations decreased slightly, to 0.0029 and 0.0026 in G9~G10and G10~G11, respectively. Gene flow was 62.91~94.63 in all generations, which indicated that sufficient gene exchange. This study confirmed a certain impact of artificial selection on genetic diversity and genetic structure inbreeding populations. It also showed that current breeding strategies (selection pressures of 4% to 5% in each generation), do not undermine genetic diversity in parental populations. Genetic differentiation in each generation’s breeding population was small, and genetic structures tended to be stable. The study provides a basic database for genetic analysis ofat the molecular level, and theoretical guidance and data support for the formulation of abreeding program

; Breeding populations; 2b-RAD; SNP; Genetic diversity

MENG Xianhong, E-mail: mengxianhong@ysfri.ac.cn

S966.12

A

2095-9869(2020)04-0068-09

10.19663/j.issn2095-9869.20190510001

http://www.yykxjz.cn/

王鳳嬌, 孟憲紅, 傅強(qiáng), 欒生, 隋娟. 基于簡(jiǎn)化基因組測(cè)序的中國(guó)明對(duì)蝦3個(gè)選育世代遺傳多樣性分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(4): 68–76

Wang FJ, Meng XH, Fu Q, Luan S, Sui J. Analysis of genetic diversity in three generations of breeding populations ofbased on reduced-representation genome sequencing. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(4): 68–76

* 重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃藍(lán)色糧倉(cāng)科技創(chuàng)新項(xiàng)目課題(2018YFD0901302)、國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(41676148)和中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所級(jí)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(20603022017001)共同資助 [This work was supported by Key Plan Blue Granary Science and Technology Innovation Project (2018YFD0901302), National Natural Science Foundation of China (41676148), and Special Fund for Basic Scientific Research Business of Central Public Research Institutes, YSFRI, CAFS(20603022017001)]. 王鳳嬌，E-mail: 1730585520@qq.com

孟憲紅，研究員，E-mail: mengxianhong@ysfri.ac.cn

2019-05-10,

2019-05-30

(編輯 馬璀艷)