程振田，袁祥萍，戴曉莉，李曉亮

（1.濰坊市益都中心醫(yī)院，山東 濰坊 262500；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟南 250100）

姜黃素（Curcumin）是從姜科草本姜黃屬植物姜黃和郁金中提取分離的含酚基和醌基的天然藥物，主要產(chǎn)地在中國、印度等亞熱帶地區(qū)[1]。自上世紀九十年代以來，姜黃素越來越得到科學(xué)家們的關(guān)注。大量研究表明，姜黃素具有抗氧化、抑制腫瘤、治療老年性癡呆等多種功效[2-5]。近年來，醫(yī)藥界對姜黃的研究越來越多，應(yīng)用越來越廣泛，顯示其具有巨大的臨床應(yīng)用潛力。但作為藥物能夠上市的最重要問題是其安全性，目前國內(nèi)未見姜黃素的臨床前毒理學(xué)評價研究報道，本文在GLP條件下采用小鼠、SD大鼠作為研究對象，通過檢測體重、攝食量、外觀體征、臨床及毒性病理等指標(biāo)，研究了姜黃素灌胃給予三種動物后的毒性反應(yīng)，為姜黃素的進一步研究開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

①實驗動物及環(huán)境：KM小鼠18g～22 g，SD大鼠100 g～120 g，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0006。②藥品與試劑：姜黃素（山東省藥學(xué)科學(xué)院中藥研究所，批號：120125）；病理檢測試劑盒（上海太陽生物技術(shù)有限公司）；甲醛溶液（萊陽經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)精細化工廠，500 ml/瓶，批號：20131103）；戊巴比妥鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，25 g/瓶，批號：89020183）。③儀器：日立全自動生化分析儀（7180型）；全自動血球計數(shù)儀（SYSMEX XT-2000IV）；包埋機（TB718）、攤烤片機（TK-218）；生物組織脫水機（TP1020）、切片機（RM2235）。

1.2 方法

1.2.1 劑量設(shè)計：據(jù)文獻報道顯示[6]，姜黃素按照等效劑量折算系數(shù)計算小鼠的等效劑量為280 mg/kg。其中，設(shè)計最大濃度為0.5 g/mL時配置成姜黃素混懸液，規(guī)定小鼠單次給藥毒性試驗中灌胃的最大容積為40 mL/kg。在實驗過程中依據(jù)最大濃度和最大容積進行小鼠灌胃給藥操作，具體地劑量為20 g/kg（1日1次）。另外，在大鼠重復(fù)給藥毒性試驗中，設(shè)計高劑量給藥濃度和容積分別為0.4 g/mL和20 mL/kg，1日1次。其中，分別選擇高劑量水平的1/2和1/4作為中、低劑量給藥濃度。因此，高、中、低三個劑量分別為8、4、2 g/kg。

1.2.2 小鼠單次給藥毒性試驗[7]：準備KM小鼠40只，按照體重均衡原則平均分為2組，分別為姜黃素組和溶劑對照組。其中，姜黃素組按照上述劑量設(shè)計中的要求給藥；溶劑對照組則在同等條件下給予相同容積的純凈水。觀察小鼠的毒性反應(yīng)，并且每天觀察外觀體征，連續(xù)14天；期間每周需稱量2次體重。觀察期結(jié)束后，采用CO2方法對小鼠安樂死處理，剖檢后肉眼觀察臟器有無明顯病變，適機取病變組織進行病理學(xué)檢查。

1.2.3 大鼠重復(fù)給藥毒性試驗[8]：準備SD大鼠160只，按照體重均衡原則平均分為4組，分別為姜黃素高、中、低3個劑量組和溶劑對照組。其中，姜黃素組別按照上述劑量設(shè)計中的要求給藥，溶劑對照組則在同等條件下給予相同容積的純凈水。整個實驗需連續(xù)給藥26周，后停藥4周。期間密切觀察大鼠的毒性反應(yīng)，并且每周監(jiān)測1次大鼠的體重變化和攝食量范圍。試驗期間給藥第13周時每組各取10只大鼠，26周時每組各取20只大鼠，待恢復(fù)4周后每組各取10只大鼠，均給予戊巴比妥鈉（mg/kg）麻醉后進行腹主動脈采血操作，開展血液生化學(xué)及血液學(xué)指標(biāo)檢查。在剖檢后摘取心、肝、脾、肺、腎及腦等主要臟器并且稱重后計算臟器系數(shù)變化。最后，所有摘取的大鼠臟器均以甲醛固定液處理后進行HE染色，觀察病理組織改變。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié) 果

2.1 小鼠單次給藥毒性試驗

溶劑對照組小鼠未發(fā)生任何異常反應(yīng)，而姜黃素組小鼠在灌胃給藥后2 h即出現(xiàn)尿液變黃，48 h后全身毛色也呈現(xiàn)黃色，但3 d后所有小鼠均恢復(fù)正常。小鼠體重觀察結(jié)果顯示：與溶劑對照組相比，姜黃素組小鼠給藥3 d后體重開始出現(xiàn)增長緩慢的現(xiàn)象，差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），7 d后則完全恢復(fù)正常體重增長水平。另外，剖檢后肉眼觀察大鼠的心、肝、脾、肺、腎等主要臟器，均未見明顯異常。因此，確定小鼠的最大給藥劑量為20 g/kg。體重見表1。

表1 姜黃素灌胃給藥對小鼠體重的影響（±s，n=20）

表1 姜黃素灌胃給藥對小鼠體重的影響（±s，n=20）

注：*P＜0.05 vs 溶劑對照組

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2.2 大鼠重復(fù)給藥毒性試驗

姜黃素8、4、2 g/kg三個劑量組大鼠給藥期間均出現(xiàn)黃色尿液及毛色變黃。與溶劑對照組比較，姜黃素8、4 g/kg劑量組大鼠在給藥13周和26周時血清中TC、TG降低，8 g/kg劑量組大鼠在給藥13周和26周時脾臟、肝臟系數(shù)增加，以上指標(biāo)停藥4周后可恢復(fù)正常。病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，所有大鼠臟器均未出現(xiàn)藥物相關(guān)病理組織學(xué)病變。有統(tǒng)計學(xué)差異的指標(biāo)見表2和表3。

表2 姜黃素重復(fù)給藥26周對SD大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響（±s，mmol/L）

表2 姜黃素重復(fù)給藥26周對SD大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響（±s，mmol/L）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 溶劑對照組

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表3 姜黃素重復(fù)給藥26周對SD大鼠臟器系數(shù)的影響(±s，g/100 g)

表3 姜黃素重復(fù)給藥26周對SD大鼠臟器系數(shù)的影響(±s，g/100 g)

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 溶劑對照組

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3 討 論

單次給藥毒性是實驗動物接受一次大劑量藥物后產(chǎn)生的毒性反應(yīng)。毒性較小的中藥常用最大給藥濃度，最大給藥容積即最大給藥量法進行單次給藥毒性試驗。姜黃素可配制的最大濃度為0.5 g/mL，小鼠最大灌胃體積為40 mL/kg，因此試驗可采用給予小鼠的最大給藥量20 g/kg灌胃。試驗結(jié)果顯示，小鼠出現(xiàn)黃色尿液和毛色變黃，原因可能為姜黃素為黃色物質(zhì)，可分布到皮膚及毛發(fā)，可通過尿液排出。

重復(fù)給藥毒性試驗研究是中藥提取物研發(fā)中非常重要的內(nèi)容，藥物大劑量重復(fù)多次給予動物后，可最大限度地獲得藥物引起的毒性信息，包括藥物引起的毒性性質(zhì)和毒性靶器官等，能夠更準確地預(yù)測藥物在臨床上應(yīng)用后可能產(chǎn)生的毒性[10]。本文重復(fù)給藥毒性試驗研究表明，大鼠出現(xiàn)TC和TG降低，支持文獻報道的姜黃素有降血糖和血脂的作用[1]，因此此作用為藥理作用而非毒性作用。

綜上所述，通過本研究結(jié)果可得姜黃素小鼠單次給藥最大給藥量為20 g/kg；大鼠重復(fù)給藥26周重復(fù)給藥最大無毒反應(yīng)劑量（NOAEL）均為4 g/kg；2.7 g/kg劑量，分別相當(dāng)于藥效學(xué)劑量的68、34和17倍左右。提示本品臨床應(yīng)用安全劑量較高，應(yīng)用非常安全。