全君杰，羅 剛，李志容，梁二妹

1珠海市香洲區(qū)香灣社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心口腔科，廣東 珠海 519000；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，廣東 廣州510120

引導(dǎo)骨再生技術(shù)在口腔頜面骨缺損中已廣泛運(yùn)用，屏障膜材料在引導(dǎo)骨再生技術(shù)上具有關(guān)鍵作用，臨床上已有在使用的各類生物膜材料，但各有物化性能不佳、引導(dǎo)骨再生能力不足及細(xì)胞粘附不佳等缺點(diǎn)，絲素蛋白（SF）和殼聚糖（CS）均是天然高分子材料，有較多研究表明SF和CS具有良好的引導(dǎo)骨再生的能力［1-3］。有研究將SF做成三維多孔SF支架用于骨組織工程研究［4］，先將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞植入支架，再植入鼠頭蓋骨創(chuàng)傷模型上，說明SF可用于骨重建和再生，表現(xiàn)出機(jī)械穩(wěn)定性和持久性。然而，單純的SF支架還有很多缺點(diǎn)，如其機(jī)械性能不佳，成形困難，親水性差和降解緩慢等。載有生長因子的CS膜可以明顯促進(jìn)骨的再生［5-6］。由CS制成的單純CS生物材料在運(yùn)用時(shí)，具有機(jī)械性能較差，在中性溶液中狀態(tài)不穩(wěn)定等缺陷，就需要將CS進(jìn)行修飾或者與其它材料復(fù)合以改善性能［7］，構(gòu)建有骨誘導(dǎo)性的骨組織工程材料。HA晶體是構(gòu)成人體自然骨的重要組成部分［8］，SF∕羥基磷灰石（nHA）材料的構(gòu)建有效地改善了nHA的機(jī)械強(qiáng)度，在誘導(dǎo)骨再生方面也有一定效果［9-10］。將CS與nHA復(fù)合，構(gòu)建適合骨組織工程的生物材料，這種復(fù)合材料有一定的韌性和可塑性，并有一定誘導(dǎo)骨再生能力［11-12］。但是上述復(fù)合材料還存在力學(xué)強(qiáng)度低，降解速率與機(jī)體組織在其表面的生長速率不匹配等問題。目前，鮮有研究將以上3種材料符合制備生物膜來研究3種材料復(fù)合后對于促進(jìn)成骨細(xì)胞生長的影響，本研究運(yùn)用SF，CS和HA制備復(fù)合生物膜，將MG-63細(xì)胞與復(fù)合生物膜在體外共同培養(yǎng)，以了解其成骨性能。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器

SF粉末（浙江湖州新天絲生物技術(shù)有限公司），平均粒徑2.5 μm；CS（脫乙酰度＞90%），HA（上海博奧生物科技有限公司），乙醇、醋酸等均為分析純。CCK-8檢測試劑盒，硝基苯磷酸鹽試劑（Sigma，美國）。

1.2 復(fù)合生物膜的制備

將SF和CS溶于1%（v/v）醋酸配成酸性溶液，調(diào)pH至5.0。配置1 mol的硝酸鈣溶液和0.6 mol的磷酸氫二銨溶液，將HA逐滴加入溶液中（單純的SF/CS復(fù)合膜不加入HA），反應(yīng)溫度控制在4℃，pH控制在6.0。攪拌反應(yīng)2 h后，復(fù)合材料漿料在室溫下放置至少4 h除去氣泡，澆鑄在平板上成膜，室溫下?lián)]發(fā)溶劑48 h,用去離子水反復(fù)洗滌，即得到SF/CS/n-HA及單純的SF/CS復(fù)合膜，復(fù)合膜鋪在平板上干燥備用。

1.3 復(fù)合生物膜的電鏡檢測

取適量的膜材料置于電子顯微鏡載物臺上，真空下噴金，觀察期表面形態(tài)。

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 以冷沉淀法制備2組復(fù)合膜，實(shí)驗(yàn)組采用SF/CS/n-HA膜，對照組采用SF/CS膜，空白組使用載玻片。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備 將實(shí)驗(yàn)組和對照組的復(fù)合膜裁切制備成邊長1 cm，厚度0.5 cm的正方形片，空白組使用市售載玻片裁切成邊長為1 cm的正方形，以60Co消毒滅菌備用。

1.4.3 細(xì)胞接種 將3組材料置于無菌培養(yǎng)皿中，加入75%酒精溶液消毒處理30 min，PBS緩沖液(pH 7.4)充分浸泡1 h，中間換液以保證交換出所有殘留酒精。然后置于紫外燈下照射30 min，自然風(fēng)干。滅菌后的材料用DMEM培養(yǎng)液(20%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)浸泡24 h，移入12孔無菌培養(yǎng)板。取500 μL人骨肉瘤細(xì)胞（MG63）細(xì)胞懸液(1.0×105/mL)接種于含試樣的培養(yǎng)板中，在37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，再于每孔加入1 mL DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)板置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，次日換液，以后隔日換液1次。

1.4 復(fù)合生物膜的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.4細(xì)胞粘附率的測定 分別在細(xì)胞接種培養(yǎng)1、4、7 h后，將試樣從培養(yǎng)液中取出，用PBS緩沖液（pH 7.4）沖洗2次，去除死細(xì)胞，移入96孔板，每孔加入新鮮培養(yǎng)基100 μL，避光加入CCK-8 10 μL，用吸管輕輕吹打數(shù)次，培養(yǎng)板置于37℃恒溫箱培養(yǎng)2 h后，吸取100 μL加入96孔板，置于酶標(biāo)儀內(nèi)于波長490 nm處測量各孔的吸光度A490nm值。

1.4.5 細(xì)胞粘附率的測定 分別在細(xì)胞接種培養(yǎng)1、3、5 d后，用PBS緩沖液（pH 7.4）沖洗2次，以去除死細(xì)胞，移入96孔板，每孔加入新鮮培養(yǎng)基100 μL，避光加入CCK-8 10 μL，用吸管輕輕吹打數(shù)次，培養(yǎng)板置于37℃恒溫箱培養(yǎng)2 h后，吸取100 μL加入96孔板，置于酶標(biāo)儀內(nèi)于波長490 nm處測量各孔的吸光度A490nm值。

1.4.6 堿性磷酸酶(ALP)活性測試 將接種培養(yǎng)7、14、21 d后的試樣從培養(yǎng)液中取出，用PBS緩沖液（pH 7.4）沖洗2次，加入700 μL消化液消化3～5 min，用吸管輕輕吹打數(shù)次。再加入含血清培養(yǎng)基終止消化，充分?jǐn)D出支架中液體后，離心收集細(xì)胞。以PBS緩沖液（pH 7.4）漂洗細(xì)胞，再加入200 μLTritonX-100(2%)細(xì)胞裂解液，置于4℃冰箱裂解24 h。取裂解液100 μL加入96孔板，避光滴加配置好的磷酸對硝基苯酯每孔200 μL于恒溫培養(yǎng)箱培育30 min后取出，用酶標(biāo)儀測定細(xì)胞裂解液在405 nm處的光密度A405nm值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對數(shù)據(jù)行析因方差分析，對每個(gè)時(shí)間段進(jìn)行組間比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電鏡結(jié)果

兩組復(fù)合生物膜中，SF/CS/nHA與SF/CS生物膜的均有孔隙結(jié)構(gòu)，而SF/CS/nHA的孔隙直徑略大于SF/CS，其孔隙分布情況也較為均勻（圖1）。

2.2 細(xì)胞黏附率

結(jié)果顯示，3組的MG-63細(xì)胞黏附率均隨著接種時(shí)間增加而增高，各組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）；實(shí)驗(yàn)組及對照組在3個(gè)時(shí)間段內(nèi)，均高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞黏附率在各個(gè)時(shí)間段內(nèi)也均高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 3組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)MG63細(xì)胞的黏附比較Tab.1 The absorbance values of cell adhesion at three time points of three groups(Mean±SD)

2.3 細(xì)胞增殖情況

3組細(xì)胞的增殖率隨時(shí)間的增加而增加，在3個(gè)時(shí)間段內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組及對照組均高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。第3天實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖率高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第1天和第5天，實(shí)驗(yàn)組與對照組的細(xì)胞增殖率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 3組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)MG63細(xì)胞的增殖情況比較Tab.2 Comparison of proliferation rate of MG-63 on different membranes at three time points of three groups(Mean±SD)

2.4 復(fù)合膜上MG-63細(xì)胞的ALP活性

結(jié)果顯示，MG-63細(xì)胞產(chǎn)生的ALP會隨著時(shí)間的增加而增加。在3個(gè)時(shí)間段內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組及對照組的ALP均高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3）；實(shí)驗(yàn)組的ALP也均高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 3組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)MG63細(xì)胞的ALP活性比較Tab.3 Comparision of alkaline phosphatase activity of MG-63 cells at different membranes(Mean±SD)

3 討論

在臨床上已有部分成品生物膜材料運(yùn)用在骨缺損及骨引導(dǎo)再生修復(fù)上，理想的生物膜材料應(yīng)該具有與軟組織接觸面能起到阻擋纖維細(xì)胞長入骨缺損處形成瘢痕愈合，與骨組織面接觸的生物膜面應(yīng)該具有能引導(dǎo)成骨細(xì)胞長入骨缺損及生物膜上，并在一定程度上能促進(jìn)骨組織的再生［13-14］。國內(nèi)外有較多文章對SF、CS及HA進(jìn)行研究，這3種材料對于成骨細(xì)胞均具有一定引導(dǎo)其增殖及誘導(dǎo)其成骨性能，但是少有研究對于這3種材料進(jìn)行復(fù)合，并進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來研究其引導(dǎo)骨再生的性能。

細(xì)胞的黏附率是細(xì)胞在一個(gè)介質(zhì)上生長及增殖的第一步，有研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過膠原模擬多肽（DGEA和PA）和Ⅰ型膠原蛋白粘附于HA上，并促進(jìn)了成骨標(biāo)志物的表達(dá)［15］，他們認(rèn)為通過模擬多肽和Ⅰ型膠原蛋白不僅促進(jìn)了成骨細(xì)胞對于HA的粘附，而且還促進(jìn)了成骨細(xì)胞的分化，以達(dá)到HA的骨整合作用。本研究也發(fā)現(xiàn)MG-63細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)組的黏附率及增殖率均高于對照組及空白組，在黏附率實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞黏附率高于對照組及空白組?？赡苁荋A的加入誘導(dǎo)了MG-63細(xì)胞加速粘附在了實(shí)驗(yàn)組中［16］，實(shí)驗(yàn)組級對照組均高于空白組，所以無論是SF/CS膜還是SF/CS/nHA膜均具有較為安全的生物相容性。

有研究發(fā)現(xiàn)在聚乙二醇水凝膠中加入nHA，其中加入1%質(zhì)量比的nHA，成骨細(xì)胞的增殖率明顯高于其他組，成骨標(biāo)志物的沉積以及Ⅰ型膠原蛋白也均高于其他組［17］。該研究認(rèn)為nHA的加入可以有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖分化以及促進(jìn)成骨。本研究的增殖率的實(shí)驗(yàn)中，在第1天和第5天，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖率并未顯示出與對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，我們認(rèn)為其原因可能是MG-63細(xì)胞在第1天粘附于生物膜上未進(jìn)入高速的增殖期［18］，而在第5天未顯示出差異，可能是因?yàn)榧?xì)胞的接觸抑制產(chǎn)生的影響［19］；在第3天時(shí)出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組比對照組及空白組的增殖率都高，可能是因?yàn)閚HA的加入，誘導(dǎo)了MG-63細(xì)胞的增殖［20-21］。此外，有研究將nHA加入聚醚酮支架，nHA的加入提高了支架材料的粗糙度及親水性能［22］，該復(fù)合支架能夠有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的粘附，增殖以及成骨標(biāo)志物的表達(dá)，認(rèn)為nHA的加入大大提高了材料的生物活性，提高支架的粗糙度和親水性能有利于細(xì)胞的粘附與增殖。本研究認(rèn)為nHA的加入能夠提高膜材料的孔徑，有利于細(xì)胞的粘附及增殖［23］。

ALP的表達(dá)是被認(rèn)為成骨細(xì)胞在體外分化成熟成骨細(xì)胞及礦化基質(zhì)的重要標(biāo)志［24-25］，有研究發(fā)現(xiàn)，以HA涂層制備的羥基磷灰石-聚酰胺66支架與成骨細(xì)胞共同培養(yǎng)，相較于未用HA涂層的支架，HA無論是在成骨分化的早期和晚期，都能夠提高成骨相關(guān)蛋白（COL1、RUNX2和OCN）的表達(dá)，提高了ALP的活性［26］。該結(jié)果認(rèn)為在支架中加入HA可以促進(jìn)成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)了成骨細(xì)胞的分化，這與本研究結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)組及對照組的ALP表達(dá)在3個(gè)時(shí)間段內(nèi)均高于空白組，表明SF和CS能引導(dǎo)MG-63的ALP表達(dá)［27-28］；而實(shí)驗(yàn)組的ALP表達(dá)也是明顯高于對照組，可能是實(shí)驗(yàn)組加入了HA的原因，HA是人體自然骨的組成部分，其具有一定的骨引導(dǎo)性，能夠促進(jìn)成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)，可以誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞的ALP表達(dá)［29］。

綜上所述，SF/CS/nHA具有良好的生物相容性及具有一定的骨引導(dǎo)性，能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的粘附，增殖及促進(jìn)其成骨。在后續(xù)研究中，我們將進(jìn)行該生物膜的動物實(shí)驗(yàn)，以期該生物膜能成為一種新型的生物膜材料。