肖麗娜李榮沖彭振英田麗彬韓 燕崔 鳳萬(wàn)書(shū)波李國(guó)衛(wèi)劉譯陽(yáng)*

(1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250014; 2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心,山東 濟(jì)南 250100)

AP2/ERF(PETAL/ethylene responsive element binding factor)類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)與植物逆境脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,DREB(Dehydration Responsive Element Binding Protein)轉(zhuǎn)錄因子則是AP2/ERF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)亞家族[1]。DREB轉(zhuǎn)錄因子含有一個(gè)由60個(gè)左右的氨基酸殘基組成的AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域,其中位于第14位的V(纈氨酸)和第19位的E(谷氨酸)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子與順式元件的結(jié)合非常重要[2]。DREB家族轉(zhuǎn)錄因子能與DRE/CRT元件特異性結(jié)合,從而調(diào)控下游抗逆基因的表達(dá),最終提高植物對(duì)逆境的抵抗和適應(yīng)能力[3]。擬南芥AtDREB基因家族可分為六個(gè)亞族,分別為A1～A6[4-5]。其A1和A4的表達(dá)受低溫脅迫的誘導(dǎo);A2和A3的表達(dá)受干旱和高溫誘導(dǎo);A5可能負(fù)反饋A1和A2,A6的表達(dá)也受到一定的脅迫的誘導(dǎo)[4-5]。

花生是我國(guó)重要的油料作物之一,出油率高達(dá)45%～50%,在我國(guó)廣泛種植。低溫、干旱和鹽脅迫等逆境脅迫是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量形成的重要因素,尋找新的抗逆基因,培育出抗逆花生新品種是育種家追求的目標(biāo)[6]。然而,相對(duì)于模式植物,對(duì)花生低溫和耐鹽的非生物脅迫耐受性研究較少,對(duì)花生非生物脅迫相關(guān)基因的功能和轉(zhuǎn)基因研究正處于起步階段[7]。本研究采用生物信息學(xué)方法分析了AhDREB基因家族各成員的物理化學(xué)性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)情況等,為進(jìn)一步研究AhDREB轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能和提高逆境條件下的花生抗性奠定了一定的理論基礎(chǔ)[8]。

1 材料與方法

1.1 植物材料及處理

供試品種為T(mén)ifrunner,由美國(guó)花生種質(zhì)資源庫(kù)提供,本實(shí)驗(yàn)室保存?；ㄉN子在營(yíng)養(yǎng)土與蛭石(2∶1)的混合土中萌發(fā),培養(yǎng)于16h光照/8h黑暗(28℃/22℃)的光照培養(yǎng)箱中。將萌發(fā)后兩周大小的幼苗進(jìn)行高溫、低溫、高鹽和干旱脅迫處理后,選取其倒三葉進(jìn)行材料保存。高溫處理時(shí),將幼苗分別置于45℃培養(yǎng)箱中,分別在0h、6h、12h、24h取材;低溫處理時(shí),將幼苗分別置于4℃培養(yǎng)箱中,分別在0h、4h、8h、12h取材;20%PEG6000進(jìn)行模擬干旱脅迫處理,分別在0h、4h、6h、12h取材;250 mmol/L NaCl進(jìn)行高鹽處理,分別在0d、1d、2d、4d取材。以上材料均用液氮冷凍,保存于-80℃冰箱,并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 花生AhDREB轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)序列的鑒定

從TAIR(https://www.arabidopsis.org/)中搜索下載擬南芥AtDREB轉(zhuǎn)錄因子家族的6個(gè)亞組的蛋白全長(zhǎng)序列共55個(gè),通過(guò)blastp在Peanut Base[9](https://peanutbase.org/)中進(jìn)行檢索,根據(jù)E-value＜1.0e-10進(jìn)行篩選,獲得相應(yīng)花生轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)序列,并刪除重復(fù)序列。對(duì)所預(yù)測(cè)的花生AhDREB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行染色體位置、氨基酸數(shù)目、編碼序列等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3 花生和擬南芥DREB轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

擬南芥和花生DREB轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列利用Clustal X進(jìn)行多重序列比對(duì),并運(yùn)用MEGA5.2軟件中的鄰接法(NJ, neighbor-joining)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap設(shè)為1000次[10]。

1.4 花生AhDREB家族基因結(jié)構(gòu)及保守域分析分析

將花生AhDREB基因組序列和編碼序列利用在線(xiàn)GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制外顯子—內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖[11]。利用在線(xiàn)軟件MEME[12](http://meme-suite.org/)對(duì)花生AhDREB家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析,并利用Adobe Illustrator工具導(dǎo)出圖片。

1.5 花生AhDREB基因家族在不同組織及非生物脅迫下的表達(dá)量分析

分析花生AhDREB基因家族在不同組織中的表達(dá)量時(shí),從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載已發(fā)表的花生22個(gè)不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(PRJNA291488)[13],查找并下載花生AhDREB基因表達(dá)的FPKM值,利用HemI軟件繪制熱圖[14]。

分析花生AhDREB基因家族在不同脅迫條件下的表達(dá)量時(shí),挑選萌發(fā)10d后的花生品種“豐花1號(hào)”幼苗,分為2個(gè)重復(fù)組,進(jìn)行下述脅迫處理:2% NaCl處理24 h,20% PEG6000處理24h,低溫(4℃)處理24h,高溫(37℃)處理24h,不進(jìn)行任何處理的作為對(duì)照。取各處理材料的葉片,用液氮速凍后用于提取總RNA,進(jìn)行RNA-seq測(cè)序,并將原始測(cè)序數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(PRJNA553073)。利用此數(shù)據(jù)庫(kù),查找并下載花生AhDREB基因在上述脅迫下的相對(duì)表達(dá)量,使用Cuffdiff軟件[15]并按以下標(biāo)準(zhǔn)鑒定差異表達(dá)基因:① 對(duì)照或處理的FPKM值至少有1個(gè)大于1;②|Log2 Fold changes|≥1; ③p≤0.05,利用HemI軟件繪制熱圖。

1.6 花生AhDREB基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的qRTPCR驗(yàn)證

花生RNA 提取采用RNA prep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根)。反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(按操作說(shuō)明進(jìn)行)。qRT-PCR采用TB Green?remix Ex TaqTMII(Tli RNase H Plus)試劑盒(TaKaRa),按操作說(shuō)明進(jìn)行。AhDREB1特異性引物:上游引物:5'-TCCAAGCCATGAAGCCGTAG-3';下游引物:5'-ATTCACTTCCTCGACCACCG-3'。AhDREB12特異性引物:上游引物:5'-TTCGCGAACCAATCAGCAAC-3';下游引物:5'-CCGGAAAGTTCAAACGTGCG-3'。內(nèi)參基因TUA5(NCBI登錄號(hào)GO264294)的特異性引物為:上游引物:5'-CTGATGTCGCCGTGCTCTTGG-3';下游引物:5'-CTGTTGAGGTTGGTGTAGGTAGG-3'。所有試驗(yàn)均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù),數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT法。熒光定量PCR儀采用Roche的Light Cycler 2.0 instrument system。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生AhDREB轉(zhuǎn)錄因子家族成員的鑒定

利用擬南芥AtDREB轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列在花生數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因檢索,共得到22個(gè)花生AhDREB轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列。將這22個(gè)AhDREB轉(zhuǎn)錄因子的基因重新命名為AhDREB1到AhDREB22 (表1)。

分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),22個(gè)AhDREB基因數(shù)目不均勻地分布于A、B兩個(gè)基因組中的12條染色體上,其中有8個(gè)位于A基因組,14個(gè)位于B基因組。在A基因組中,Aradu.A02和Aradu.A04各有1個(gè)AhDREB基因,其余的3條染色體存在2個(gè)。在B基因組中,Araip.B08上有4個(gè),Araip.B06上有3個(gè),Araip.B04和Araip.B07上分別有2個(gè),其余的染色體上個(gè)只有1個(gè)。在22個(gè)基因中存在多對(duì)等位基因,例如,AhDREB5和AhDREB17為一對(duì)等位基因,AhDREB1和AhDREB9為一對(duì)等位基因。

表1 AhDREB基因信息匯總Table 1 Summary of AhDREB gene information

2.2 花生AhDREB轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

以擬南芥AtDREB轉(zhuǎn)錄因子家族成員為參考,對(duì)花生22條序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建(圖1)。結(jié)果顯示,與擬南芥AtDREB家族分類(lèi)相對(duì)應(yīng),花生AhDREB家族22個(gè)成員也可分為6個(gè)亞家族:A1、A2、A3、A4、A5和A6,其成員數(shù)量分別為1、12、3、4、1和1個(gè)。其中,A1、A4和A5亞家族聚集成一組,A2、A3和A6亞家族聚集成一組,構(gòu)成了進(jìn)化樹(shù)的兩個(gè)緊密聯(lián)系的大組。

2.3 花生AhDREB基因結(jié)構(gòu)分析

分析AhDREB的6個(gè)亞家族基因結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)他們具有明顯不同的特點(diǎn)(圖2)。22個(gè)成員中,除AhDREB2和AhDREB13有4個(gè)外顯子,AhDREB10和AhDREB15有3個(gè)外顯子外,其余成員只有1～2個(gè)外顯子,并且外顯子較多的基因,氨基酸數(shù)目也相對(duì)較多,這說(shuō)明在進(jìn)化中該家族基因發(fā)生了外顯子數(shù)目增加和長(zhǎng)度增長(zhǎng),導(dǎo)致基因大小也隨之增加。

圖1 花生和擬南芥DREB轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 A phylogenetic tree of DREB transcription factors from peanut and Arabidopsis

圖2 花生AhDREB基因結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Gene structure analysis of AhDREB

2.4 花生AhDREB轉(zhuǎn)錄因子motif搜索及保守序列分析

利用MEME軟件對(duì)AhDREB蛋白質(zhì)序列進(jìn)行motif搜索,并構(gòu)建AhDREB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化樹(shù)及motif分布圖(圖3)。結(jié)果顯示,花生AhDREB轉(zhuǎn)錄因子共鑒定出6種motif,其中motif1和motif2分布最廣泛,保守性最高,分別有29個(gè)和27個(gè)保守氨基酸。motif1和motif2對(duì)應(yīng)的則是AP2/ERF結(jié)構(gòu)域,motif1的第13位和第18位對(duì)應(yīng)的是AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的第14位的纈氨酸(V)和第19位的谷氨酸(E),這是DREB與ERF家族的主要區(qū)別。另外其他4個(gè)保守序列motif3、motif4、motif5和motif6,也分布于不同的亞家族中,在亞家族內(nèi)具有保守性。在A2亞家族中,所有成員均含有motif1、motif2和motif3,其 中AhDREB1、AhDREB2、AhDREB9和AhDREB10蛋白序列尾部含有特殊的motif4。A6和A3亞家族中的AhDREB20、AhDREB5、AhDREB17含有特有的motif6。A1、A5及A4亞家族中,除AhDREB3只含有motif1之外,其余成員都含有motif1和motif2,這與進(jìn)化樹(shù)中的分組相一致。上述結(jié)果表明,盡管AhDREB蛋白質(zhì)序列大小存在一定的差異,但內(nèi)部具有高度的保守性。亞家族內(nèi)的AhDREB轉(zhuǎn)錄因子成員motif的種類(lèi)、數(shù)目和分布相對(duì)具有一致性,這同樣也反映了進(jìn)化樹(shù)分組的可靠性。

2.5 花生AhDREB轉(zhuǎn)錄因子基因家族的不同組織表達(dá)分析

圖3 花生AhDREB基因家族保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 Conserved motifs of AhDREB family members in peanut

利用已發(fā)表的22個(gè)花生組織的表達(dá)量數(shù)據(jù)對(duì)AhDREB進(jìn)行分析(圖4)。結(jié)果表明,大多數(shù)AhDREB基因在各個(gè)組織中的表達(dá)量均較低,部分基因在特定組織或發(fā)育時(shí)期具有較高的表達(dá)水平。花生AhDREB7、AhDREB12和AhDREB21在種子發(fā)育后期表達(dá)量較高。AhDREB8和AhDREB21作為一對(duì)同源基因具有相同的表達(dá)模式,在莖尖、果莢及種子發(fā)育等時(shí)期表達(dá)量相對(duì)較高,這表明兩者在花生發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。AhDREB6和AhDREB16作為一對(duì)同源等位基因,在果針入土后表達(dá)量升高,這暗示著兩者可能參與了果針入土后的胚胎發(fā)育過(guò)程。

2.6 花生AhDREB基因在不同脅迫條件下的表達(dá)分析

為進(jìn)一步分析花生AhDREB基因在不同脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)變化,利用本實(shí)驗(yàn)室在干旱、高鹽、高溫與低溫脅迫下的花生轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(PRJNA354652),分析花生AhDREB家族基因在上述脅迫下的表達(dá)量。結(jié)果如圖5所示,共有12個(gè)AhDREB基因在高溫、低溫、鹽與干旱脅迫下具有不同的響應(yīng)模式。其中,有4個(gè)AhDREB基因響應(yīng)干旱脅迫上調(diào)或下調(diào)表達(dá);6個(gè)AhDREB基因響應(yīng)高溫脅迫上調(diào)或下調(diào)表達(dá);4個(gè)AhDREB基因響應(yīng)鹽脅迫上調(diào)或下調(diào)表達(dá),5個(gè)AhDREB基因響應(yīng)低溫脅迫上調(diào)或下調(diào)表達(dá)。其中AhDREB1基因在干旱和低溫脅迫下均上調(diào)表達(dá),AhDREB12基因在鹽和高溫脅迫下均上調(diào)表達(dá),推測(cè)這兩個(gè)基因在脅迫反應(yīng)中起重要作用。

圖4 花生AhDREB基因表達(dá)模式熱圖Fig.4 Expression pattern analysis of AhDREB in peanut

圖5 花生AhDREB家族基因在干旱、鹽、高溫及低溫脅迫下的表達(dá)分析Fig.5 Expression pattern analysis of AhDREBs under drought, salt, high temperature and low temperature stresses

2.7 花生AhDREB基因qRT-PCR分析

通過(guò)對(duì)花生AhDREB基因在不同脅迫條件下的表達(dá)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)AhDREB1基因在干旱和低溫脅迫誘導(dǎo)下均上調(diào)表達(dá),AhDREB12基因在高溫和鹽脅迫誘導(dǎo)下均上調(diào)表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果,利用qRT-PCR分析AhDREB1與AhDREB12基因在250mmol/L NaCl,20%PEG6000,低溫(4℃)和高溫(45℃)處理下的表達(dá)特性。結(jié)果如圖6所示,AhDREB1基因在PEG模擬干旱脅迫條件下呈現(xiàn)先上升后下降的表達(dá)趨勢(shì),在低溫脅迫條件下逐漸上調(diào)表達(dá);AhDREB12受鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)并呈現(xiàn)先上升后下降而后又上升的表達(dá)趨勢(shì),而在高溫脅迫條件下則劇烈上調(diào)表達(dá)。

圖6 qRT-PCR分析花生AhDREB基因在干旱、鹽、高溫及低溫脅迫下的表達(dá)模式Fig.6 Expression pattern analysis of AhDREBs under drought, salt,high temperature and low temperature stresses using qRT-PCR

3 討論與結(jié)論

花生是我國(guó)重要的糧食與油料作物,而干旱、鹽與冷等非生物脅迫嚴(yán)重影響著花生的產(chǎn)量與品質(zhì)[16]。因此,培育抗逆的優(yōu)良花生品種,對(duì)提高花生產(chǎn)量具有重要的意義[6]。研究表明,轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控在植物響應(yīng)非生物脅迫方面起著重要的作用[17]。隨著花生基因組測(cè)序的完成,越來(lái)越多的響應(yīng)非生物脅迫的轉(zhuǎn)錄因子被鑒定出來(lái)。趙小波[18]等利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析了干旱條件下抗旱花生品種“J11”中轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化,確定存在236個(gè)轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生了差異表達(dá),其中60%的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào),這表明轉(zhuǎn)錄因子能夠提高花生的耐旱性。趙小波[19]等分析了鹽脅迫條件下花生轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況,共計(jì)發(fā)現(xiàn)33個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族,包括102個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)。陳娜[20]等在花生中篩選到99個(gè)與低溫脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,主要包括MYB、WRKY、NAC及AP2/ERF等家族蛋白。

DREB轉(zhuǎn)錄因子家族能夠與DRE/CRT順式作用元件特異性的識(shí)別和結(jié)合,同時(shí)調(diào)控多個(gè)抗逆基因的表達(dá),廣泛參與抗逆生理生化過(guò)程,從而調(diào)高植物的抗逆性[21]。利用DREB轉(zhuǎn)錄因子來(lái)增強(qiáng)植物的抗逆性的手段目前備受關(guān)注。本研究利用生物信息學(xué)方法,從花生數(shù)據(jù)庫(kù)中分離鑒定了22個(gè)AhDREB轉(zhuǎn)錄因子,聚類(lèi)分析將其分為6個(gè)亞組,這與擬南芥中的分類(lèi)一致[22]。蛋白質(zhì)保守基序分析表明,亞組內(nèi)部蛋白質(zhì)保守基序分布高度相似,均含有AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域,而不同亞組之間存在明顯的不同,這暗示著不同亞組間可能具有不同的功能。在不同組織的表達(dá)量分析表明,多數(shù)AhDREB基因在各個(gè)組織中表達(dá)量均較低甚至不表達(dá),而部分基因在花生特定組織及發(fā)育時(shí)期具有較高的表達(dá)量。例如AhDREB8、AhDREB12、AhDREB13和AhDREB21在花生莢果發(fā)育時(shí)期表達(dá)較高;AhDREB13在根中具有較高的表達(dá)量。在非生物脅迫條件下,A2組受低溫誘導(dǎo)后表達(dá)的基因數(shù)量較多;A1和A2組在干旱及熱激誘導(dǎo)后表達(dá)的基因數(shù)量較多,而A3組在鹽處理后表達(dá)的基因數(shù)量較多。其中,AhDREB1受干旱及冷條件下誘導(dǎo)顯著上升,AhDREB12在鹽及熱激條件下顯著上升,這暗示著這兩個(gè)基因在花生響應(yīng)非生物脅迫條件下具有重要的作用。