洪 磊 ，敖 葉，周志楠，唐 文，阮 涌，倪萌萌，陳 祥*

(1.貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點試驗室，貴州省動物遺傳育種與繁殖重點試驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025)

基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）是一種內(nèi)源性的金屬蛋白酶活性抑制劑[1]，最初被認(rèn)為主要作用于調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶活性和抑制細(xì)胞外基質(zhì)的轉(zhuǎn)化，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等，如血管生成[2]，并且在細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。哺乳動物的TIMP家族中有4 個成員，在大多數(shù)的細(xì)胞、組織、體液中表達(dá)[4]。TIMP1基因是在20 世紀(jì)70 年代初以膠原酶抑制劑的形式在體外培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞[5]、人血清[6]以及牛軟骨和主動脈提取物中發(fā)現(xiàn)的[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，TIMP1基因參與調(diào)控小鼠的生殖周期，主要作用于子宮和卵巢[8]。更為重要的是，TIMP1基因也被認(rèn)為是類固醇生成的調(diào)節(jié)劑[9]。在綿羊上的研究發(fā)現(xiàn)TIMP1基因在子宮中的表達(dá)受激素影響，如雌二醇[10]。而在山羊上，Peng 等[11]研究發(fā)現(xiàn)TIMP1基因可以增加山羊輸卵管上皮細(xì)胞的增殖，表明TIMP1基因在促進(jìn)輸卵管上皮細(xì)胞的存活中發(fā)揮重要作用。因此，TIMP1基因的功能除作為基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑之外，其對動物繁殖的重要作用也逐漸受到人們關(guān)注。

黔北麻羊是貴州三大地方優(yōu)良山羊品種之一，具有遺傳性能穩(wěn)定、耐粗飼、抗病力強、合群性好、性情溫順、適應(yīng)性強等特點[12]，具有較高的經(jīng)濟價值。目前，與黔北麻羊產(chǎn)羔性狀相關(guān)的分子水平基礎(chǔ)研究較為缺乏。因此，本研究在同課題組對產(chǎn)單、多羔黔北麻羊的卵巢組織進(jìn)行mRNA 轉(zhuǎn)錄組分析的基礎(chǔ)上，篩選出差異性較高的TIMP1基因，對黔北麻羊的TIMP1基因編碼區(qū)進(jìn)行克隆，分析其分子結(jié)構(gòu)序列，探究其在單、多羔黔北麻羊多組織中的表達(dá)差異，以期為探究黔北麻羊產(chǎn)羔性狀分子機制及提高產(chǎn)羔性能研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及樣品采集 實驗動物來自貴州省習(xí)水縣富興牧業(yè)有限公司，根據(jù)養(yǎng)殖場的系譜和繁殖記錄，選擇3 歲2 胎次的單、多羔黔北麻羊母羊各3 只（單羔組：連續(xù)2 胎產(chǎn)羔數(shù)為1 只；多羔組：連續(xù)2 胎產(chǎn)羔數(shù)為2只以上），采用同期發(fā)情處理后，在第二個情期母羊自然發(fā)情，4～5 h 后參照貴州省地方標(biāo)準(zhǔn)《羊屠宰操作規(guī)程》（DB22/T 2740-2017）進(jìn)行屠宰，分別采集輸卵管、垂體、下丘腦、卵巢、子宮5 個組織，置于液氮中保存，以用于組織總RNA 提取。

1.1.2 試劑與儀器 Trizol 試劑購自貴州綠盟英創(chuàng)生物科技有限公司；AMP、TOP10 感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；高純度質(zhì)粒小提試劑盒等購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；快速瓊脂糖凝膠回收試劑盒、T-克隆PCR 產(chǎn)物克隆試劑盒購自生工生物工程技術(shù)有限公司（上海）；熒光染料UltraSYBR Mixture SYBR Green I、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，均購自擎科生物科技有限公司。PCR 擴增儀（型號為C1000 Touch?）、實時熒光定量PCR 儀（型號為CFX96 Real-Time System）、凝膠成像系統(tǒng)（型號為Universal Hood Ⅱ），均購自美國BIO-RAD 有限公司。

1.2 方法

1.2.1TIMP1基因引物設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI 上的山羊TIMP1基因mRNA 序列，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計mRNA 及CDS 區(qū)引物。為保證所設(shè)計引物的高特異性，并用NCBI 上的在線引物設(shè)計及分析軟件Primer BLAST 進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參基因，送至生工生物工程技術(shù)有限公司（上海）合成，TIMP1、β-actin基因引物序列信息見表1。

1.2.2 黔北麻羊組織總RNA 提取及cDNA 第一鏈的合成采用Trizol 法提取單、多羔黔北麻羊的輸卵管、垂體、下丘腦、卵巢、子宮5 個組織的總RNA，并吸取1 μL測定總RNA 的濃度和純度，OD260/OD280在1.8～2.0，-80℃保存。將合格的RNA 按照Hi Fi Script cDNA 第一鏈合成試劑盒（北京康為有限公司）操作步驟反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行濃度和純度檢測，OD260/OD280范圍在1.7～1.9，-20℃保存。

1.2.3 目的片段的合成及回收 以cDNA 為模板，進(jìn)行TIMP1基因CDS 區(qū)克隆，PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：2×Es Taq Master Mix 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/μL）各 1.0 μL，RNase-Free Water 5.5 μL，cDNA模板2.5 μL（1 500 ng/μL）。PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55.6℃退火45 s，72℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72℃終延伸5 min。將擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。按照膠回收試劑盒回收目的片段，取1 μL 反應(yīng)產(chǎn)物于超微量紫外分光光度計進(jìn)行濃度和純度檢測。

1.2.4TIMP1基因的連接、轉(zhuǎn)化及菌夜驗證 按照pMD-19T 載體連接試劑盒的操作步驟，將膠回收產(chǎn)物與pMD-19T 載體在16℃恒溫下連接過夜。將連接液加入到E.coliTOP10 感受態(tài)細(xì)胞中，冰上靜置30 min，再42℃熱激90 s，冰上靜置20 min 后，加入700 μL 不含抗生素的液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)1 h，涂布于含有氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基，將平板正向放置37℃培養(yǎng)1 h，然后倒置培養(yǎng)過夜。觀察平板上菌落的生長情況，隨機挑取10 個白色單克隆菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中（含有氨芐青霉素），37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，進(jìn)行菌液PCR 鑒定。PCR 反應(yīng)體系及條件見1.2.3。PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。挑選與目的條帶一致的菌夜送至生工生物工程技術(shù)有限公司（上海）進(jìn)行測序。

1.2.5TIMP1基因在黔北麻羊不同組織表達(dá)水平檢測以cDNA 為模板，采用實時熒光定量PCR 檢測TIMP1基因在單、多羔黔北麻羊輸卵管、垂體、下丘腦、卵巢、子宮5 個組織中的表達(dá)水平。反應(yīng)體系10 μL：2×T5 Fast qPCR Mix 5 μL；上、下游引物（10 μmol/L）各0.75 μL；cDNA（1 500 ng/μL）1.5 μL；ddH2O 2 μL。程序如下：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性10 s；58℃退火10 s；68℃延伸28 s；進(jìn)行40 個循環(huán)；最后從60℃按0.5℃增值到95℃進(jìn)行溶解曲線分析，熒光采集時間為5 s，每個樣品進(jìn)行3 個平行試驗。獲得擴增曲線呈光滑的“S”型曲線，可用于2-△△Ct方法的計算，溶解曲線全部呈單峰，峰值較好，即引物特異性好。

臨離開美食街，忽然看見藕稀飯，明明吃飽了，還是條件反射買了一碗。回妹妹同學(xué)家吃起來，藕塊，略硬，頗掛喉。要等到秋風(fēng)起了，寒霜降了，江南的藕才可口，煮出鐵銹紅色，軟糯芬芳，糯米粥煮得發(fā)亮，上面飄著厚厚一層粥油。寒冬的時候，坐在街頭，喝一碗，可暖一下午，也暖了一輩子。

表1 引物序列

1.2.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析 本次實驗TIMP1基因和β-actin基因的Ct 值數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法分析，得出TIMP1基因在單、多羔黔北麻羊的輸卵管、垂體、下丘腦、卵巢、子宮5 個組織中的相對表達(dá)量，實驗數(shù)據(jù)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，使用LSD 法進(jìn)行差異顯著性檢驗。

1.2.7 黔北麻羊TIMP1基因生物信息學(xué)分析及生物進(jìn)化樹構(gòu)建 利用在線軟件ProtParam（http://us.expasy.org/tools/protparam.html/）預(yù)測TIMP1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，使用ProtScale（http:www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl/）分析疏水性，使用在線軟件TMHMM Server.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析預(yù)測跨膜區(qū)域，使用在線軟件SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、在線軟件SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）預(yù)測分析信號肽TIMP1蛋白結(jié)構(gòu)功能域，使用在線軟件SOPMA 對TIMP1蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測，用在線軟件SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive/EHVM5c/models/）分析蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，下載并整理NCBI 上的綿羊、牛、駱駝、馬、人、豬、犬等10 個物種的mRNA 序列信息，利用BioEdit 軟件進(jìn)行多重比對分析，然后用MEGA6 軟件進(jìn)行遺傳距離計算和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建（鄰接法），且Bootstrap Replication 值為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 黔北麻羊TIMP1基因的擴增 利用反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板擴增TIMP1基因的CDS 區(qū)，PCR 結(jié)果如圖1 所示，片段長度大小與預(yù)期片段大小624 bp 一致，可以初步判斷擴增片段為黔北麻羊TIMP1基因的CDS 區(qū)。

2.2 黔北麻羊TIMP1基因克隆及測序 如圖2 所示，黔北麻羊TIMP1基因與NCBI 上的山羊序列同源性達(dá)到100%，說明已經(jīng)成功構(gòu)建了基因的T 克隆載體。

2.3 黔北麻羊TIMP1 蛋白序列分析

2.3.1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 TIMP1 蛋白的分子式為C1020H1581N283O291S19，相對分子質(zhì)量為23.073 64 ku，等電點為8.62，酸堿性質(zhì)呈堿性。不穩(wěn)定系數(shù)為64.5，因此TIMP1 蛋白屬于堿性不穩(wěn)定蛋白。氨基酸組成中含量最高的是丙氨酸，占9.2%，并且TIMP1 蛋白中帶正電荷的氨基酸殘基量（精氨酸+賴氨酸）為20 個；帶負(fù)電荷的氨基酸殘基量（天冬氨酸+谷氨酸）為15 個；脂肪族系數(shù)為69.86。

表2 黔北麻羊TIMP1 蛋白氨基酸含量及所占比例

2.3.2 蛋白質(zhì)疏水性分析 由圖3 可知，TIMP1 蛋白第10～20 位氨基酸之間含有一個突出的疏水區(qū)域。整個多肽鏈中負(fù)值氨基酸多于正值氨基酸，即肽鏈中親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，表明整個多肽鏈表現(xiàn)為親水性。

2.3.4 蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測 由圖4 可知，TIMP1 蛋白含有信號肽序列，為分泌蛋白，序列為MALFAPMASGI LLLLWLTASRACTCI。推測TIMP1 蛋白可能在跨膜運輸起著信號識別作用，剪切位點位于第23 位和第24 位氨基酸之間，成熟肽始于第24 位氨基酸。

2.3.5 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域及亞細(xì)胞定位分析 預(yù)測分析TIMP1 蛋白結(jié)構(gòu)功能域，結(jié)果顯示，TIMP1 蛋白在24～199 位是個高度保守的結(jié)構(gòu)功能域，由NTR 結(jié)構(gòu)組成。利用PSORT Ⅱ Prediction 在線軟件預(yù)測TIMP1 蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，細(xì)胞質(zhì)為55.6 %，線粒體為44.4 %，TIMP1 蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中。

2.4 黔北麻羊TIMP1 蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4.1 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 對TIMP1 蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果如圖5 所示，TIMP1 蛋白中無規(guī)則卷曲所占的比例最大，高達(dá)50.72%，α-螺旋占22.71%，擴展鏈為22.71%，β-轉(zhuǎn)角區(qū)域僅為3.86%。

2.4.2 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 對TIMP1基因蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測一致。

2.5 黔北麻羊TIMP1基因在不同組織的表達(dá)分析 由圖6 可知，TIMP1基因在各被檢測組織中均有表達(dá)。單羔組中表達(dá)量為子宮＞卵巢＞輸卵管＞垂體＞下丘腦；多羔組中表達(dá)量為卵巢＞子宮＞輸卵管＞垂體＞下丘腦，且輸卵管、垂體和卵巢在多羔組表達(dá)中極顯著高于單羔組，其他組織間差異不顯著。

2.6 黔北麻羊TIMP1基因的遺傳進(jìn)化分析 與NCBI 上綿羊、牛、豬、駱駝、馬、犬、人、兔、鼠9 個物種的基因序列進(jìn)行比對，序列同源性分別為98.4 %、96.0 %、87.8 %、88.8 %、86.3 %、85.5 %、84.0 %、81.3 %、74.2 %，進(jìn)一步構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹結(jié)果如圖7，發(fā)現(xiàn)黔北麻羊與綿羊和牛的遺傳距離均最近，與豬的親緣關(guān)系較近，與駱駝、馬、犬、人、兔、鼠的遺傳距離較遠(yuǎn)，符合物種進(jìn)化規(guī)律。

3 討 論

TIMP家族成員主要由發(fā)育中的卵巢和睪丸分泌[13]，定位于特定的細(xì)胞和組織部位，研究表明，TIMPs 的生物學(xué)作用是與細(xì)胞表面蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的下游信號通路[14]。而且TIMP 家族成員可能在性腺發(fā)育、卵泡生長和排卵過程中發(fā)揮作用[15]。因此，TIMPs 與多種生殖過程有關(guān)[16]。TIMP1是TIMPs 家族中的一個重要基因，被認(rèn)為是與哺乳動物排卵過程相關(guān)的重要基因之一[17]。Boujrad 等[9]研究表明，TIMP1主要在卵泡中表達(dá)，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、凋亡和激素合成。TIMP1基因還與卵巢的排卵和黃體形成有關(guān)[18]，可作為山羊產(chǎn)羔性狀的候選基因。然而，TIMP1在黔北麻羊組織中的表達(dá)和功能尚不清楚。

本研究通過T-克隆獲得了黔北麻羊TIMP1基因編碼區(qū)序列，并與NCBI 中收錄的序列進(jìn)行比對，序列同源性達(dá)100%，未發(fā)現(xiàn)突變位點，說明黔北麻羊TIMP1基因的CDS 區(qū)與山羊相同。對黔北麻羊TIMP1基因序列所翻譯的蛋白質(zhì)進(jìn)行在線分析，發(fā)現(xiàn)TIMP1 蛋白的分子式為C1020H1581N283O291S19，編碼207 個氨基酸；等電點為8.62；相對分子質(zhì)量為23.07364 ku，這與Brew在人上預(yù)測[19]的結(jié)果存在差異，可能是因為存在種屬差異。本實驗發(fā)現(xiàn)黔北麻羊與綿羊和牛的遺傳距離均最近，與豬的親緣關(guān)系較近，與駱駝、馬、犬、人、兔、鼠的遺傳距離較遠(yuǎn)，符合物種進(jìn)化規(guī)律，同時說明TIMP1基因在黔北麻羊中體現(xiàn)出了一定的遺傳保守性。

An 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，與產(chǎn)單羔山羊相比，產(chǎn)多羔山羊卵巢組織中TIMP1基因的mRNA 表達(dá)增加。本實驗中，多羔組山羊TIMP1在卵巢組織的表達(dá)量極顯著高于單羔組且在組內(nèi)表達(dá)量最高，提示其與山羊的產(chǎn)羔性狀可能有關(guān)。此外，朱廣琴[21]同樣發(fā)現(xiàn)TIMP1基因在多羔奶山羊卵巢組織中的表達(dá)極顯著高于單羔奶山羊。由于卵巢組織在動物生殖過程中起著重要作用，它能分泌與生殖有關(guān)的性腺激素，從而影響發(fā)情、卵泡發(fā)育和排卵等[22-23]，結(jié)合本實驗結(jié)果進(jìn)一步推測TIMP1基因在卵巢組織的高表達(dá)可能對山羊卵泡發(fā)育、排卵和卵母細(xì)胞活化等過程產(chǎn)生重要影響。本研究結(jié)果顯示，TIMP1基因在多羔組垂體中表達(dá)極顯著高于單羔組，而垂體是雌激素的重要調(diào)控器官，雌二醇可以顯著下調(diào)MMP 家族基因表達(dá)[24]，而TIMP1基因作為其家族基因的抑制劑，推測TIMP1基因在雌激素的分泌過程中間接發(fā)揮作用，從而參與調(diào)控黔北麻羊產(chǎn)羔性狀。本研究發(fā)現(xiàn)TIMP1基因在多羔組輸卵管組織的表達(dá)極顯著高于單羔組，這與彭甲銀[25]研究相同。更為重要的是TIMP1基因可以促進(jìn)山羊輸卵管上皮細(xì)胞的增殖[11]，而輸卵管又是傳遞生殖細(xì)胞和受精的場所[26]，因此，TIMP1基因在輸卵管的高表達(dá)表明其與動物繁殖過程緊密相關(guān)，具體調(diào)控作用有待進(jìn)一步研究。結(jié)合本實驗研究結(jié)果，可進(jìn)一步推測TIMP1基因通過在垂體、卵巢和輸卵管中高表達(dá)從而對黔北麻羊產(chǎn)羔數(shù)量產(chǎn)生積極影響。綜合上述研究推測，TIMP1基因可能與黔北麻羊高產(chǎn)羔數(shù)有關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究克隆獲得黔北麻羊TIMP1基因CDS 區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)TIMP1基因在單、多羔黔北麻羊5 個組織中的表達(dá)存在差異性。推測TIMP1基因可能通過在輸卵管、垂體和卵巢的高表達(dá)影響黔北麻羊的產(chǎn)羔數(shù)量，具體的分子調(diào)控機制還有待進(jìn)一步研究。