黃子彧,林瑩瑩,宋思家,任發(fā)政,,郭慧媛,,*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京 100083;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 教育部北京市共建功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083)

蠟樣芽孢桿菌是一種條件致病菌,容易引起食源性疾病的爆發(fā)[1],對食品加工的耐受能力強(qiáng),在多種市售的食品中均有檢出[2-4]。根據(jù)國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)對中國食源性疾病爆發(fā)的監(jiān)測資料分析,由蠟樣芽孢桿菌引起的疾病占所有食源性微生物疾病的8.6%,排在第4位[5]。蠟樣芽孢桿菌容易茹附在食品加工設(shè)備表面,且具有很高的生物被膜形成能力,在食品設(shè)備的清洗中難以被清除,從而成為該菌殘留在終產(chǎn)品中的主要原因之一[6]。

生物被膜是細(xì)菌茹附在固體表面并被一種基質(zhì)(包括胞外多糖)包裹在內(nèi)的微生物聚集體。細(xì)胞外基質(zhì)對其內(nèi)的菌體具有保護(hù)作用,減少殺菌清洗劑的滲透,提高細(xì)菌對殺菌劑、紫外線、高溫等不利因素的抗性[7-8]。生物被膜態(tài)細(xì)菌比浮游態(tài)微生物更難清除,是原料、產(chǎn)品以及人員的反復(fù)污染源[9]。研究證實(shí),與浮游細(xì)菌相比形成生物膜的細(xì)菌對消毒劑和抗菌素的耐受性提高了1 000多倍[10]。因此,蠟樣芽孢桿菌生物被膜的清除是食品安全控制的一大挑戰(zhàn)。

在食品工業(yè)中,對微生物污染的控制主要依靠加工過程中的就地清洗(clean-in-place,CIP)系統(tǒng),它是在無需拆分加工設(shè)備的前提下能夠有效地清洗加工設(shè)備內(nèi)表面的一種設(shè)備清洗程序[11]。由于生物被膜態(tài)菌的耐酸堿性增強(qiáng),工廠中常用的CIP程序可能無法將蠟樣芽孢桿菌徹底清除。有研究報(bào)道,標(biāo)準(zhǔn)的CIP程序(先用水洗,然后使用10.0 g/L氫氧化鈉溶液65 ℃沖洗10 min,接著使用10.0 g/L硝酸溶液65 ℃沖洗10 min)對茹附在機(jī)械表面的蠟樣芽孢桿菌的清除效果并不顯著,僅能成功降低2 個(gè)數(shù)量級[12]。因此,對現(xiàn)有的CIP系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化對于能有效清除蠟樣芽孢桿菌生物被膜非常重要。

由于生物被膜對化學(xué)或物理的處理有一定的抗性,所以單純的依靠酸堿沖刷對其的清除達(dá)不到理想的效果[13]。有研究表明,將酶、表面活性劑、殺菌劑等復(fù)合使用時(shí),對生物被膜的清除效果顯著高于單一成分的作用[14-15]。因此,將CIP中的酸堿清洗劑與其他物質(zhì)聯(lián)合使用,能更好更快地清除生物被膜,并且更好地適應(yīng)生產(chǎn)環(huán)節(jié),提高企業(yè)效益。

本實(shí)驗(yàn)對從食品生產(chǎn)線分離出的蠟樣芽孢桿菌的生物被膜形成能力及酸堿耐受性進(jìn)行評估,挑選出生物被膜形成能力強(qiáng)、酸堿耐受性高的菌株作為研究對象,通過正交試驗(yàn)探究能徹底清除蠟樣芽孢桿菌生物被膜的最優(yōu)酸堿CIP條件。并且進(jìn)一步研究酸堿清洗劑與殺菌劑過氧乙酸聯(lián)合使用對蠟樣芽孢桿菌生物被膜的清除效果,探索最佳清洗條件,為生產(chǎn)過程中的清洗消毒試劑的選用參數(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株A1～A4菌均分離自食品工廠生產(chǎn)線管道內(nèi),分離方法依照GB 4798.14—2014《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)》,經(jīng)過16S rRNA及理化指標(biāo)鑒定為蠟樣芽孢桿菌,菌種保藏號為CGMCC NO.16908。菌株活化參考Lin Yingying等[16]的方法。

標(biāo)準(zhǔn)菌株蠟樣芽孢桿菌ATCC 14579(產(chǎn)生物被膜陰性對照菌株)、標(biāo)準(zhǔn)菌株蠟樣芽孢桿菌ATCC 10987(產(chǎn)生物被膜陽性對照菌株) 中國科學(xué)院微生物所菌種保藏中心;不銹鋼片(食品級304不銹鋼,長寬為1 cm×1 cm) 李通金屬有限公司。

蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、胰蛋白胨、葡萄糖(均為分析純) 北京易秀博谷生物科技有限公司;磷酸氫二鈉、結(jié)晶紫、過氧乙酸、苯扎溴銨、次氯酸鈉(均為分析純) 科百奧生物技術(shù)公司。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(pH 7.2):蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL,用于平板計(jì)數(shù);腦心浸出液培養(yǎng)基(pH 7.4):胰蛋白胨20 g、氯化鈉10 g、磷酸氫二鈉5 g、葡萄糖4 g、牛心浸出粉10 g、蒸餾水1 000 mL,用于菌株的培養(yǎng);0.10%結(jié)晶紫:結(jié)晶紫乙醇飽和液(結(jié)晶紫2 g溶于20 mL 95%乙醇中)20 mL,1%草酸銨溶液80 mL將兩液混勻置24 h后過濾即可;0.01 mol/L磷酸緩沖液溶液:KCl 0.2 g、NaCl 8.5 g、Na2HPO4·12H2O 2.9 g、KH2PO40.27 g、蒸餾水1 000 mL;中和劑:3.0%吐溫-80和0.3%卵磷脂溶于0.01 mol/L磷酸緩沖液。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWY-C2112培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;SmartspecTM3000分光光度計(jì) 美國Bio-Rad公司;SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司醫(yī)療設(shè)備廠;LMS 780共聚焦顯微鏡 德國卡爾·蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 蠟樣芽孢桿菌生物被膜的制備

參照Lin Yingying等[16]的方法進(jìn)行。

1.3.2 生物被膜形成能力評價(jià)

采用結(jié)晶紫染色法[17]進(jìn)行評價(jià)。

1.3.3 生物被膜態(tài)菌耐酸堿性測定

耐堿性測定:將培養(yǎng)72 h含有菌膜的不銹鋼片置于2.00%的氫氧化鈉溶液中,80 ℃作用15 min。無菌水沖洗后將不銹鋼片放入己滅菌的15 mL離心管中,管內(nèi)含有0.5 g的玻璃珠(100～150 μm),渦旋振蕩1 min。進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

耐酸性測定:將培養(yǎng)72 h含有菌膜的不銹鋼片置于1.50%的硝酸溶液中,在80 ℃作用15 min。無菌水沖洗后將不銹鋼片放入以滅菌的15 mL離心管中,管內(nèi)含有0.5 g的玻璃珠(100～150 μm),渦旋振蕩1 min。進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。耐受性(D)按下式計(jì)算:

式中:A為未處理不銹鋼片上的菌數(shù);B為處理后不銹鋼片的菌數(shù);t為作用時(shí)間/min。

1.3.4 不銹鋼片上活菌數(shù)的測定

不銹鋼片經(jīng)過不同的CIP程序處理后,將不銹鋼片置于無菌的15 mL離心管中,內(nèi)含0.5 g直徑為100 μm的玻璃珠以及3 mL無菌磷酸緩沖液,旋渦振蕩1 min后,在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.3.5 生物被膜的微觀結(jié)構(gòu)觀察

生物被膜在黑暗中用碘化丙啶染色15 min,然后在共聚焦顯微鏡下觀察其微觀結(jié)構(gòu)[18]。用氬離子激發(fā)熒光,激發(fā)波長為488 nm,40 倍鏡,圖片面積為220 mm(x軸)×220 mm(y軸),z軸掃描的寬度為0.92 μm。

1.3.6 各因素對蠟樣芽孢桿菌生物被膜清除效果量效關(guān)系的單因素試驗(yàn)

1.3.6.1 氫氧化鈉質(zhì)量濃度

當(dāng)氫氧化鈉作用時(shí)間20 min、硝酸質(zhì)量濃度15 g/L、硝酸作用時(shí)間20 min、整個(gè)CIP程序溫度85 ℃時(shí),改變氫氧化鈉質(zhì)量濃度分別為10、15 g/L和20 g/L,采用1.3.4節(jié)方法測定活菌數(shù)。

1.3.6.2 氫氧化鈉作用時(shí)間

當(dāng)氫氧化鈉質(zhì)量濃度20 g/L、硝酸質(zhì)量濃度15 g/L、硝酸作用時(shí)間20 min、整個(gè)CIP程序溫度85 ℃時(shí),改變氫氧化鈉作用時(shí)間分別為10、15 min和20 min,采用1.3.4節(jié)方法測定活菌數(shù)。

1.3.6.3 硝酸質(zhì)量濃度

當(dāng)氫氧化鈉質(zhì)量濃度20 g/L、氫氧化鈉作用時(shí)間20 min、硝酸作用時(shí)間20 min、整個(gè)CIP程序溫度85 ℃時(shí),改變硝酸質(zhì)量濃度分別為5、10、15 g/L,采用1.3.4節(jié)方法測定活菌數(shù)。

1.3.6.4 硝酸作用時(shí)間

當(dāng)氫氧化鈉質(zhì)量濃度20 g/L、氫氧化鈉作用時(shí)間20 min、硝酸質(zhì)量濃度15 g/L、整個(gè)CIP程序溫度85 ℃時(shí),改變硝酸作用時(shí)間分別為10、15 min和20 min,采用1.3.4節(jié)方法測定活菌數(shù)。

1.3.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,擬定4因素3水平正交試驗(yàn),因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and their coded levels used in orthogonal array design

1.3.8 酸堿清洗劑與過氧乙酸聯(lián)合使用對蠟樣芽孢桿菌生物被膜清除效果的量效關(guān)系

采用目前食品加工廠普遍使用的CIP程序,該CIP程序?yàn)闅溲趸c質(zhì)量濃度15 g/L、氫氧化鈉作用時(shí)間10 min、硝酸質(zhì)量濃度10 g/L、硝酸作用時(shí)間10 min、整個(gè)CIP程序溫度85 ℃基礎(chǔ)上,在酸洗步驟后加入過氧乙酸清洗的步驟,過氧乙酸的質(zhì)量濃度分別為1、2 g/L和3 g/L。采用1.3.4節(jié)方法測定活菌數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 蠟樣芽孢桿菌的生物被膜形成能力及酸堿耐受性

圖1 蠟樣芽孢桿菌在不銹鋼片上的生物被膜形成能力Fig. 1 Biofilm formation ability of B. cereus on stainless steel sheets

表2 蠟樣芽孢桿菌對15 g/L氫氧化鈉和10 g/L硝酸在85 ℃的耐受性Table 2 Tolerance of the biofilm of B. cereus to 15 g/L NaOH and 10 g/L HNO3 at 85 ℃

由圖1可知,不同菌株的生物被膜形成能力存在差異,4 株菌株的生物被膜形成能力均低于陽性對照菌株ATCC 10987,均高于陰性對照菌株ATCC 14579,且在這4 株菌株中,菌株A1的生物被膜形成能力最強(qiáng)。從表2可知,4 株菌株對酸堿都存在耐受性,且對酸堿耐受性均高于生物被膜形成能力最低的菌株ATCC 14579,說明生物被膜的形成有利于提高菌株的酸堿耐受性,對菌體起保護(hù)作用。菌株A1對氫氧化鈉的耐受性最高,菌株A3對硝酸的耐受性最高。在4 株菌中,菌株A1的生物被膜形成能力最強(qiáng),對氫氧化鈉的耐受性最高,對硝酸也有較高的耐受性,在經(jīng)受CIP程序清洗之后容易殘存于管道中形成生物被膜最終污染產(chǎn)品,所以菌株A1作為以下清除實(shí)驗(yàn)中的研究對象。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 氫氧化鈉質(zhì)量濃度

圖2 氫氧化鈉質(zhì)量濃度對蠟樣芽孢桿菌生物被膜的清除效果Fig. 2 Removal efficiency of different concentrations of NaOH on B. cereus biofilm

由圖2可知,蠟樣芽孢桿菌的清除效果隨氫氧化鈉質(zhì)量濃度的增加而增加。當(dāng)氫氧化鈉質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí),大多數(shù)的生物被膜己經(jīng)被清除,不銹鋼片上殘留的菌數(shù)為2.08(lg(CFU/cm2)),減少了5.5(lg(CFU/cm2)),清除率為72.5%。隨著氫氧化鈉質(zhì)量濃度的增加,生物被膜的清除率進(jìn)一步提高,達(dá)到93.5%。當(dāng)質(zhì)量濃度增加到20 g/L時(shí),蠟樣芽孢桿菌生物被膜的清除效果最好,不銹鋼片上未有蠟樣芽孢桿菌檢出。因此,氫氧化鈉質(zhì)量濃度范圍選定15～20 g/L。

2.2.2 硝酸質(zhì)量濃度

圖3 硝酸質(zhì)量濃度對蠟樣芽孢桿菌生物被膜的清除效果Fig. 3 Removal efficiency of different concentrations of HNO3 on B. cereus biofilm

由圖3可知,蠟樣芽孢桿菌的清除效果隨硝酸質(zhì)量濃度的增加而增加。當(dāng)硝酸質(zhì)量濃度為5 g/L時(shí),大多數(shù)的生物被膜己經(jīng)被清除,不銹鋼片上殘留的菌數(shù)為1.64(lg(CFU/cm2)),減少了5.94(lg(CFU/cm2)),清除率為78.3%。隨著硝酸質(zhì)量濃度的增加,生物被膜的清除率進(jìn)一步提高,達(dá)到85.4%。當(dāng)硝酸質(zhì)量濃度為15 g/L時(shí),蠟樣芽孢桿菌生物被膜的清除效果最好,不銹鋼片上未有蠟樣芽孢桿菌檢出。因此,硝酸質(zhì)量濃度范圍選定10～15 g/L。

2.2.3 氫氧化鈉作用時(shí)間

圖4 氫氧化鈉作用時(shí)間對蠟樣芽孢桿菌生物被膜的清除效果Fig. 4 Effect of NaOH treatment time on removal of B. cereus biofilm

由圖4可知,蠟樣芽孢桿菌的清除效果隨氫氧化鈉作用時(shí)間的延長而增加。當(dāng)氫氧化鈉作用時(shí)間為10 min時(shí),大多數(shù)的生物被膜己經(jīng)被清除,不銹鋼片上殘留的菌數(shù)為0.84(lg(CFU/cm2)),減少了6.74(lg(CFU/cm2)),清除率為88.9%。隨著氫氧化鈉作用時(shí)間的延長,生物被膜的清除率進(jìn)一步提高,達(dá)到92.7%。當(dāng)作用時(shí)間延長到20 min時(shí),蠟樣芽孢桿菌生物被膜的清除效果最好,不銹鋼片上未有蠟樣芽孢桿菌檢出。因此,氫氧化鈉作用時(shí)間范圍選定10～20 min。

2.2.4 硝酸作用時(shí)間

圖5 硝酸處理時(shí)間對蠟樣芽孢桿菌生物被膜的清除效果Fig. 5 Effect of HNO3 treatment time on removal of B. cereus biofilm

由圖5可知,蠟樣芽孢桿菌的清除效果隨硝酸作用時(shí)間的延長而增加。當(dāng)硝酸作用時(shí)間為10 min時(shí),大多數(shù)的生物被膜己經(jīng)被清除,不銹鋼片上殘留的菌數(shù)為1.06(lg(CFU/cm2)),減少了6.52(lg(CFU/cm2)),清除率為86.0%。隨著硝酸作用時(shí)間的延長,生物被膜的清除率進(jìn)一步提高,達(dá)到94.6%。當(dāng)作用時(shí)間延長到20 min時(shí),蠟樣芽孢桿菌生物被膜的清除效果最好,不銹鋼片上未有蠟樣芽孢桿菌檢出。因此,氫氧化鈉作用時(shí)間范圍選定10～20 min。

2.3 優(yōu)化CIP程序的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知,4 個(gè)因素對蠟樣芽孢桿菌生物被膜清除效果的影響依次為硝酸質(zhì)量濃度＞氫氧化鈉質(zhì)量濃度＞硝酸作用時(shí)間＞氫氧化鈉作用時(shí)間。由于正交表各列均被因素排滿,表中未留下空列,故做重復(fù)實(shí)驗(yàn),估算試驗(yàn)誤差,進(jìn)行方差分析,以確定各因素的顯著性水平,方差分析結(jié)果見表4。通過F檢驗(yàn)表明:4 個(gè)因素對蠟樣芽孢桿菌的清除率都有顯著的影響。綜上,CIP程序清除蠟樣芽孢桿菌生物被膜的最優(yōu)條件為A2B3C3D3,即先使用17.5 g/L氫氧化鈉溶液85 ℃沖洗20 min,然后使用純水沖洗,接著使用15 g/L硝酸溶液在85 ℃沖洗20 min,最后使用純水沖洗。按照以上條件做3 次平行實(shí)驗(yàn),在不銹鋼片上未檢測出蠟樣芽孢桿菌。該條件下蠟樣芽孢桿菌的清除率達(dá)到100%,優(yōu)于表3中任一組合的試驗(yàn)結(jié)果,此條件為最佳結(jié)果。

表3 不同CIP處理?xiàng)l件對蠟樣芽孢桿菌生物被膜清除效果的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Orthogonal array design with experimental results for the optimization of CIP conditions

表4 正交試驗(yàn)方差分析Table 4 Analysis of variance for the effect of CIP conditions on removal of B. cereus biofilm as per orthogonal array design

2.4 酸堿清洗劑與殺菌劑聯(lián)合使用對蠟樣芽孢桿菌生物被膜的清除效果

僅使用CIP程序中的酸堿清洗劑清除蠟樣芽孢桿菌生物被膜,存在著酸堿濃度高,作用時(shí)間長的問題。為了減少酸堿清洗劑的使用量和清洗強(qiáng)度,本研究擬將酸堿清洗劑與殺菌劑聯(lián)合使用的方法,從而使食品設(shè)備的清洗更高效、更環(huán)保。

2.4.1 3 種殺菌劑對蠟樣芽孢桿菌生物被膜清除效果

圖6 不同殺菌劑對蠟樣芽孢桿菌生物被膜的清除效果Fig. 6 Removal efficiency of different disinfectants on B. cereus biofilm

苯扎溴銨、次氯酸鈉、過氧乙酸均是食品工廠中經(jīng)常使用的殺菌劑。由圖6可知,菌株A1不同殺菌劑的耐受性不同。在3 種殺菌劑中,蠟樣芽孢桿菌生物被膜清除效果最好的是過氧乙酸,接著是苯扎溴銨,效果最差是次氯酸鈉,它們對蠟樣芽孢桿菌生物被膜的清除率依次為64.6%、56.9%、54.4%。因此,選用過氧乙酸與CIP酸堿清洗劑聯(lián)合使用。

2.4.2 CIP清洗與過氧乙酸聯(lián)合使用清除蠟樣芽孢桿菌生物被膜

圖7 CIP與過氧乙酸聯(lián)合使用對蠟樣芽孢桿菌生物被膜的清除效果Fig. 7 Removal efficiency of CIP regime combined with peracetic acid on B. cereus biofilm

由圖7可知,蠟樣芽孢桿菌的清除效果隨過氧乙酸質(zhì)量濃度的增加而增加。當(dāng)過氧乙酸質(zhì)量濃度為1 g/L時(shí),大多數(shù)的生物被膜己經(jīng)被清除,不銹鋼片上殘留的菌數(shù)為2.36(lg(CFU/cm2)),減少了5.09(lg(CFU/cm2)),清除率為68.3%。隨著過氧乙酸質(zhì)量濃度的增加,生物被膜的清除率進(jìn)一步提高,達(dá)到87.2%。當(dāng)質(zhì)量濃度增加到3 g/L時(shí),蠟樣芽孢桿菌生物被膜的清除效果最好,不銹鋼片上未有蠟樣芽孢桿菌檢出。因此,CIP清洗與過氧乙酸聯(lián)合使用的程序?yàn)橄仁褂?5 g/L氫氧化鈉溶液85 ℃沖洗10 min,然后使用純水沖洗,接著使用10 g/L硝酸溶液85 ℃沖洗10 min,然后使用3 g/L過氧乙酸溶液25 ℃沖洗10 min,最后使用中和劑沖洗。

2.4.3 CIP清洗與過氧乙酸聯(lián)合使用前后蠟樣芽孢桿菌生物被膜的微觀結(jié)構(gòu)

圖8 經(jīng)過CIP與過氧乙酸聯(lián)合處理后的蠟樣芽孢桿菌在共聚焦顯微鏡下的微觀結(jié)構(gòu)Fig. 8 Confocal laser scanning microscopic images of B. cereus biofilms treated with CIP combined with peracetic acid

如圖8所示,蠟樣芽孢桿菌生物被膜是非均勻的,由菌體纏繞聚合成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。未經(jīng)過處理的生物被膜的厚度大約為30 μm,結(jié)構(gòu)致密。經(jīng)過CIP清洗處理后的生物被膜結(jié)構(gòu)被破壞,僅余下單層的細(xì)菌,厚度約為10 μm。經(jīng)過CIP清洗與過氧乙酸聯(lián)合處理后的生物被膜幾乎被完全清除,僅留下幾個(gè)單獨(dú)的菌體殘留在不銹鋼片上。從該結(jié)果看,CIP程序清洗與過氧乙酸聯(lián)合使用能有效進(jìn)一步地清除蠟樣芽孢桿菌生物被膜,該結(jié)果也與活菌計(jì)數(shù)的結(jié)果相符合。

3 討 論

蠟樣芽孢桿菌在食品加工機(jī)械的表面上表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物被膜形成能力,而生物被膜能夠?qū)ζ鋬?nèi)的菌體起保護(hù)作用,降低清洗劑、殺菌劑對菌體的危害[19],生物被膜態(tài)細(xì)菌比浮游態(tài)細(xì)菌更難清除。生物被膜態(tài)細(xì)菌抗逆性的提高,使蠟樣芽孢桿菌的清除成為食品加工中一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。CIP程序是在加工生產(chǎn)中控制與清除微生物一項(xiàng)基本且關(guān)鍵的措施。有報(bào)道蠟樣芽孢桿菌生物被膜經(jīng)CIP程序?yàn)橄仁褂眉兯疀_洗,再使用5 g/L氫氧化鈉溶液65 ℃沖洗10 min后,再使用純水沖洗,僅能降低1 個(gè)數(shù)量級[20];經(jīng)過程序?yàn)橄仁褂?5 g/L氫氧化鈉溶液65 ℃沖洗30 min,再使用純水沖洗洗,然后使用10 g/L硝酸溶液65 ℃沖洗10 min,最后用純水沖洗處理后,菌數(shù)降低約5 個(gè)數(shù)量級[21]。因?yàn)榫w酸堿耐受性提高,它容易在CIP過程中存活下來,殘留在機(jī)械表面上最后導(dǎo)致產(chǎn)品的污染。因此,探究能將蠟樣芽孢桿菌徹底清除的CIP工藝對于食品加工過程是一項(xiàng)至關(guān)重要的任務(wù)。本研究中,通過正交試驗(yàn)探究清除蠟樣芽孢桿菌的最佳CIP清洗程序,該程序?yàn)椴捎?7.5 g/L氫氧化鈉溶液85 ℃沖洗20 min,使用純水沖洗,然后使用15 g/L硝酸溶液85 ℃沖洗20 min,最后使用純水沖洗,能徹底清除不銹鋼片上的蠟樣芽孢桿菌,菌落數(shù)約降低7 個(gè)數(shù)量級,與其他優(yōu)化方法相比,多降低2 個(gè)數(shù)量級[22-23],清除效率更高。

對于食品企業(yè)來說,降低清洗劑的濃度、縮短清洗的時(shí)間有利于企業(yè)利益。次氯酸鈉為弱堿性氧化型殺菌劑,通過水解釋放次氯酸氧化細(xì)胞內(nèi)含巰基的酶,并損害細(xì)胞膜[24]。過氧乙酸為弱酸性氧化型殺菌劑,通過水解釋放初生態(tài)氧使菌體蛋白變性,抑制細(xì)胞內(nèi)酶的活性,而達(dá)到殺菌的目的[25-26]。苯扎溴銨為非氧化型殺菌劑,帶正電荷,能夠吸附在帶負(fù)電荷細(xì)胞表面,其長鏈烷基能夠刺破細(xì)胞膜,使菌體內(nèi)容物外泄而達(dá)到殺菌目的[27]。過氧乙酸是食品工廠中常見的殺菌劑,具有廣譜的抗菌作用[25]。過氧乙酸對清除生物被膜有顯著的效果,金黃色葡萄球菌生物被膜再經(jīng)0.3%過氧乙酸溶液處理15 s后,幾乎100%的菌體細(xì)胞失活[28]。銅綠假單胞菌生物被膜經(jīng)過1.61%過氧乙酸溶液處理15 min后,清除率可以達(dá)到100%[26]。有研究報(bào)道,在過氧乙酸、苯扎溴銨、過氧化氫、碘消靈和次氯酸鈉中,對蠟樣芽孢桿菌生物被膜清除作用最好的是過氧乙酸,最差為次氯酸鈉[29-30],這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。鑒于其清潔低毒特性與其對蠟樣芽孢桿菌的清除效果高于其他殺菌劑,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了CIP清洗劑與殺菌劑過氧乙酸聯(lián)合使用對蠟樣芽孢桿菌生物被膜的清除效果。當(dāng)3 g/L的過氧乙酸與CIP聯(lián)合使用后,能夠達(dá)到徹底清除不銹鋼片上蠟樣芽孢桿菌生物被膜的效果,而且與從正交試驗(yàn)優(yōu)化CIP清洗程序相比,降低酸堿清洗劑的使用濃度,縮短了整個(gè)CIP清洗程序的時(shí)間。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從工廠生產(chǎn)線上分離出的蠟樣芽孢桿菌的生物被膜形成能力及酸堿耐受性,并挑選出生物被膜形成能力最強(qiáng)、酸堿耐受性高的菌株A1作為正交試驗(yàn)的研究對象。從正交試驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn),采用氫氧化鈉質(zhì)量濃度17.5 g/L、氫氧化鈉作用時(shí)間20 min、硝酸質(zhì)量濃度15 g/L、硝酸作用時(shí)間20 min清洗條件,可以徹底清除蠟樣芽孢桿菌生物被膜。進(jìn)而研究酸堿清洗劑與過氧乙酸聯(lián)合使用對蠟樣芽孢桿菌生物被膜的清除效果,得到的最佳清洗程序?yàn)橄仁褂?5 g/L氫氧化鈉溶液85 ℃沖洗10 min,然后使用純水沖洗,接著使用10 g/L硝酸溶液85 ℃沖洗10 min,然后使用3 g/L過氧乙酸溶液25 ℃沖洗10 min,最后使用中和劑沖洗。該程序在徹底清除蠟樣芽孢桿菌生物被膜的同時(shí),降低了酸堿清洗液的濃度、縮短了程序的清洗時(shí)間,為食品加工設(shè)備的清洗提供了一種更高效、更環(huán)保的方法。