劉茵茵 羅丹 屈晶晶 閆曉煜

結(jié)腸癌是目前全世界高發(fā)的惡性腫瘤［1］，嚴(yán)重威脅人們的身心健康。眾所周知，早期結(jié)直腸癌患者治愈率比較高，5年生存率可達到90%，但因缺乏有效的早期診斷方法，結(jié)腸癌患者確診時多已為中晚期，其生存率僅為10%～15%［2］。最新研究表明，目前結(jié)腸鏡檢查仍然是對結(jié)腸癌敏感性最高的篩查工具，但有一定風(fēng)險，且目前尚無更好的篩查方法可以替代［3］。病例分期是術(shù)后正確選擇治療方案、制定隨訪計劃和預(yù)測生存率的關(guān)鍵依據(jù)［4］，而TNM分期仍然是最強大的預(yù)測指標(biāo)［5］。lncRNAs是近年來發(fā)現(xiàn)的一類非編碼RNA，其會產(chǎn)生長＞200bp且多的外顯子轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本通常不會被翻譯成蛋白質(zhì)［6］。近年來大量研究表明，腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后均與lncRNAs的表達失調(diào)密切相關(guān)，其表達譜可能作為診斷惡性腫瘤的一類新的生物標(biāo)志物［7-9］。結(jié)腸癌的演變進程復(fù)雜且緩慢，涉及繁雜的基因和蛋白表達變化。因此，篩查并驗證結(jié)腸癌相關(guān)基因及蛋白的表達譜有利于提高早期結(jié)腸癌的診斷率，從而提高患者治愈率并延長生存時間。多項研究表明［10，11］，在結(jié)腸癌組織中多條lncRNAs表達上調(diào)，且與患者不良預(yù)后緊密關(guān)聯(lián)，如CCAT1、HOTAIR。仍有大量結(jié)腸癌相關(guān)的lncRNAs亟待探索。隨著對lncRNAs與結(jié)腸癌的深入研究，其異常表達對結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的作用也將越來越明確，很有可能尋找到對結(jié)腸癌高度敏感的lncRNAs作為結(jié)腸癌早期診斷的重要指標(biāo)。故而，本研究將針對5種篩選出的lncRNAs構(gòu)建多個指標(biāo)聯(lián)合篩檢早期結(jié)腸癌的Logistic多因素分析模型，探索其在結(jié)腸癌患者血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 STEP one plus QPCR(美國ABI公司)，高速冷凍離心機(湖南凱達科學(xué)儀器有限公司)，水平電泳槽(北京六一)，電泳儀電源(北京六一)。

1.2 主要試劑 Trizol Reagent A350-1(invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄RT試劑盒(Fermentas)，Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI)，RNA酶抑制劑(Fermentas)，96孔PCR板密封蓋(Axygen)，AgaroseⅠ瓊脂糖(Amresco)等試劑。

1.3 方法

1.3.1 43例結(jié)腸癌患者(結(jié)腸癌組)中各型結(jié)腸癌臨床診斷均符合《中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2017)》［2］，男27例，女16例；年齡40～70歲。27例正常對照組(NC組)中男12例，女15例；年齡27～71歲，均為同期體檢正常并排除其他干擾疾病的健康者。

1.3.2 篩選目標(biāo)lncRNAs采用文獻篩選的方法篩選結(jié)腸癌患者中表達差異的lncRNAs(5條)作為研究對象。

1.3.3 qRT-PCR驗證表達差異的lncRNAs采用TRIzol LS法提取血清樣本中的總RNAs。采用qRTPCR相對定量法檢測候選的5種lncRNAs的表達情況。

1.3.4 將結(jié)腸癌組與NC組組成一個有序分類變量，分析lncRNAs表達譜診斷結(jié)腸癌的正確率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行ROC和Logistic回歸分析。t檢驗作兩組間的比較；ROC曲線法計算每個lncRNAs診斷結(jié)腸癌的Se、Sp、Youden指數(shù)、AUC、cut off等特征參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清中l(wèi)ncRNAs的表達情況比較 兩組血清中l(wèi)ncRNAs的ROC曲線，見圖1。結(jié)腸癌組CCATI、HOTAIR、LincRNAP2、SOX2OT、ANRIL的表達值分別為(25.62±17.07)、(4.71±2.86)、(1.29±0.63)、(2.98±1.41)、(3.81±2.62) ；NC組 CCATI、HOTAIR、LincRNAP2、SOX2OT、ANRIL的表達值分別為(1.39±0.71)、(1.04±0.45)、0.81±0.41)、(1.26±0.63)、(1.36±0.80)；結(jié)腸癌組CCATI、HOTAIR、LincRNAP2、SOX2OT、ANRIL的表達值高于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

圖1 結(jié)腸癌組血清中l(wèi)ncRNAs的ROC曲線

2.2 5種lncRNAs中ROC分析結(jié)果及特征參數(shù) CCAT1的AUCROC最高，達到0.924；其次分別為HOTAIR(0.904)、SOX2OT(0.895)、ANRIL(0.868)，而LincRNAP2的AUCROC最低，僅0.602，故而此次試驗排除該條lncRNAs，不將其作為聯(lián)合預(yù)測分期的選擇；靈敏度最高的是CCAT1，最低的是SOX2OT；特異度最高的是CCAT1，最低的是LincRNAP2。見表2。

表1 兩組血清中l(wèi)ncRNAs的表達情況比較()

表1 兩組血清中l(wèi)ncRNAs的表達情況比較()

注：與NC組比較，aP＜0.05

表2 5種lncRNAs中ROC分析結(jié)果及特征參數(shù)

2.3 系列試驗組合檢測特征參數(shù) 鑒于結(jié)腸癌患者血清CCAT1表達值的Se、Sp均較高，為大量研究和試驗所證實，故此以CCAT1為基本檢測項目，結(jié)合文獻及試驗篩選出的3種lncRNAs，進行CCAT 1加 1～ 3種的lncRNAs系列試驗，篩選 Youden指數(shù)和準(zhǔn)確度高組合項。見表3。

表3 系列試驗組合檢測特征參數(shù)

3 討論

據(jù)報道，腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及患者的預(yù)后均與lncRNAs的表達失調(diào)緊密關(guān)聯(lián)，其表達譜可能成為診斷惡性腫瘤的一類新的生物標(biāo)志物。作為標(biāo)志物，Se與Sp越高，準(zhǔn)確性越高，用于早期診斷、療效評估、預(yù)后判定等的價值越高［12］。目前結(jié)腸鏡檢查是對結(jié)腸癌敏感性最高的篩查工具，但過程有一定風(fēng)險；而lncRNAs僅需抽取患者血清即可進行檢測，無風(fēng)險，但若應(yīng)用于臨床，還需有較高的Se或 Sp［13］。一種lncRNAs檢測能力有限，若聯(lián)合幾種lncRNAs標(biāo)志物可以提高診斷效率。本研究所檢測的5種腫瘤標(biāo)志物，其中CCAT1在結(jié)腸癌中的作用研究已相對成熟，但其尚未應(yīng)用于臨床，Se與Sp還需進一步提高。本文聯(lián)合Logistic多因素分析方法和ROC曲線，用AUCROC、Se、Sp等指標(biāo)探索lncRNAs的診斷價值。

3.1 單項指標(biāo)鑒別診斷結(jié)腸癌的臨床價值 本研究對ROC區(qū)線下面積和Se、Sp、Youden等指標(biāo)進行了綜合評價，最大限度提高評價診斷試驗準(zhǔn)確性。本研究結(jié)果顯示，用于診斷結(jié)腸癌的lncRNAs中，AUCROC≥0.7的指標(biāo)有CCAT1、HOTAIR、SOX2OT、ANRIL，表明其有一定的準(zhǔn)確性，可作為預(yù)測結(jié)腸癌的單項指標(biāo)。其中又以CCAT1的AUCROC最大，診斷價值最高，其Sp、Youden指數(shù)、Se也最大；而LincRNAP2的AUCROC最低，故而舍棄。

3.2 多指標(biāo)聯(lián)合診斷對診斷結(jié)腸癌的臨床價值 理想的鑒別指標(biāo)要求既靈敏又特異，高Se利于篩選，減少漏診; 高Sp則有助于診斷，避免誤診。在臨床實踐中，經(jīng)常會應(yīng)用多指標(biāo)的聯(lián)合進行診斷。本文聯(lián)合診斷常采用系列試驗，可提高Sp。本研究結(jié)果顯示，多指標(biāo)聯(lián)合診斷的效率明顯優(yōu)于單項指標(biāo)，且隨著聯(lián)合指標(biāo)的增加，系列試驗的Sp隨之升高，表明聯(lián)合診斷的指標(biāo)越多其診斷效率越高。但并非指標(biāo)越多越好，鑒于CCAT1研究相對成熟其作用已被證實［14］，本研究以CCAT1為基本檢測項目，聯(lián)合其他標(biāo)志物進行CCAT1加其他1～3項隨機組合的聯(lián)合試驗，做等級多分類Logistic回歸分析，然后用其概率做ROC曲線，結(jié)果顯示，系列試驗中CCAT1+HOTAIR+SOX2OT的平行線檢驗大于0.05，該假設(shè)被認(rèn)可，而且其組合Sp為98.4%，Youden指數(shù)0.856，Se為87.2%，AUCROC為0.982。

本研究嘗試應(yīng)用Logistic回歸綜合多指標(biāo)信息，根據(jù) ROC曲線確定診斷界值，同時增加診斷的Se和Sp。本次研究中單個CCAT1用于診斷結(jié)腸癌，其AUCROC達到0.924，Se達到0.903，Sp達到0.894，說明其對結(jié)腸癌的鑒別效能較高。

綜上所述，CCAT1將可能作為結(jié)腸癌的診斷、病情監(jiān)測及患者預(yù)后評估的分子標(biāo)記物，但其對結(jié)腸癌TNM分期的鑒別效能有待進一步研究。經(jīng)文獻篩選出的LincRNAP2，在本次研究中卻不具有檢驗效能，可能與樣本量過少有關(guān)，其具體效能有待商榷。多指標(biāo)聯(lián)合診斷的效率優(yōu)于單項指標(biāo)，且聯(lián)合指標(biāo)增加，系列試驗的特異度隨之升高。該方法亦可應(yīng)用于其他疾病診斷實驗的資料分析中，有著廣泛的應(yīng)用前景。