朱亞玲， 楊紫薇， 高佳慧， 陳建美， 陳璐， 孔雅珍， 刁勇

(華僑大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 福建 泉州 362021)

三七為五加科植物三七PanaxNotoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根和根莖，具有散瘀止血、消腫定痛的作用，用于治療咯血、吐血、衄血、便血、崩漏、外傷出血、胸腹刺痛、跌撲腫痛等疾病[1].《本草綱目》記載三七“止血散血定痛，金刃箭傷、跌撲杖瘡、血出不止者，嚼爛涂，或?yàn)槟街?，其血即止”[2]，臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，三七對(duì)冠心病、高血壓、動(dòng)脈硬化、腫瘤等多種疾病具有改善和治療作用[3-4].白及為蘭科植物白及Bletillastriata(Thunb.) Reichb.f.的干燥塊莖，具有收斂止血、消腫生肌的功效，用于治療咯血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等疾病[1].《本草綱目》中記載“白及主癰腫惡瘡，敗疽，傷陰死肌，胃中邪氣賊風(fēng)鬼?yè)簦蚓彶皇铡盵2].現(xiàn)代研究表明，白及具有促進(jìn)傷口愈合、抗?jié)?、止血、抗腫瘤和抗炎活性[5-6]的作用.此外，白及的活性成分還被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品等行業(yè)[7].三七和白及同為止血藥，二藥相合，一散一收，去瘀生新，有止血而不留瘀的效果.白及多糖可增加三七總皂苷作用于胃腸道的藥效[8].三七-白及藥對(duì)在臨床實(shí)踐中應(yīng)用廣泛，但目前對(duì)于二者配伍的藥理作用機(jī)制尚不明確.

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從整體角度描述生物系統(tǒng)、藥物和疾病之間復(fù)雜的相互作用[9-11]，已被廣泛應(yīng)用于中藥的潛在活性成分及其作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、機(jī)制研究、藥物開發(fā)、藥效研究等過(guò)程，是開發(fā)創(chuàng)新藥物的重要方法[12-14].本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選三七-白及藥對(duì)的活性成分，并綜合分析三七-白及藥對(duì)作用靶點(diǎn)、相關(guān)的疾病和信號(hào)通路等，探索三七-白及藥對(duì)的藥理作用機(jī)制，進(jìn)一步擴(kuò)大藥物使用范圍，為“老藥新用”提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 三七和白及化學(xué)成分的檢索與收集

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥lsp.nwu.edu.cn/index.php)[15]，分別以“三七”、“白及”作為關(guān)鍵詞，檢索2味中藥已知的所有化學(xué)成分，以口服生物利用度(OB)≥30%，化合物類藥性(DL)≥0.18作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得三七和白及中符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)成分信息，將其作為活性成分.

1.2 三七和白及活性成分靶點(diǎn)信息的收集

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)查找與活性成分相關(guān)的作用靶點(diǎn)，收集靶點(diǎn)蛋白信息.利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(http：∥www.uniprot.org/)[16]，將檢索物種限定為“Homosapiens”，對(duì)收集的靶點(diǎn)蛋白名稱進(jìn)行統(tǒng)一校正，并獲取靶點(diǎn)蛋白相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因.采用Cytoscape 3.6.1(https:∥cytoscape.org)軟件[17]，以三七、白及、活性成分及靶點(diǎn)信息為基礎(chǔ)，構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖.

1.3 靶點(diǎn)基因相關(guān)疾病的獲取

將靶點(diǎn)基因?qū)攵拘耘c基因比較CTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥ctdbase.org)[18]，富集分析這些基因相關(guān)的疾病，以校正P<0.01作為顯著性標(biāo)準(zhǔn)，得到三七-白及藥對(duì)靶點(diǎn)基因相關(guān)的疾病信息.

1.4 靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

利用蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥string-db.org/)構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白之間相互作用網(wǎng)絡(luò)[19].將三七、白及相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，將研究物種設(shè)置為“Homosapiens”，最低互作分值設(shè)置成最高可信(HC)≥0.9，刪除與其他蛋白無(wú)相互作用的節(jié)點(diǎn)，獲得蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，將互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，并用cytoHubba插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，計(jì)算節(jié)點(diǎn)的度(degree)，篩選degree排名前5的節(jié)點(diǎn)蛋白，并將其作為核心蛋白.

1.5 靶點(diǎn)基因GO生物學(xué)過(guò)程與KEGG通路富集分析

將靶點(diǎn)基因?qū)肷飳W(xué)信息注釋及可視化DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥david.ncifcrf.gov/home.jsp)[20]進(jìn)行基因本體論(GO)富集分析及京都基因與基因百科全書(KEGG)通路富集分析，以基因在某條通路富集結(jié)果的可信度(Q)<0.05作為顯著性標(biāo)準(zhǔn)，分析靶點(diǎn)基因參與的生物學(xué)過(guò)程及信號(hào)通路.

2 研究結(jié)果

2.1 三七-白及藥對(duì)的活性成分

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共收集到119個(gè)三七化學(xué)成分，36個(gè)白及化學(xué)成分，依據(jù)口服生物利用度(OB)≥30%，化合物類藥性(DL)≥0.18進(jìn)行篩選，共得到17個(gè)活性成分，其中,三七有8個(gè)，白及有9個(gè).三七和白及活性成分,如表1所示.

表1 三七和白及活性成分Tab.1 Active ingredients in PanaxNotoginseng and Bletillastriata

2.2 作用靶點(diǎn)信息及藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

篩選得到的17個(gè)活性成分中，三七活性成分MOL007475和白及活性成分MOL005776未檢索到相關(guān)作用靶點(diǎn)；15個(gè)活性成分共獲得193個(gè)靶點(diǎn)蛋白，三七活性成分靶點(diǎn)有184個(gè)，白及活性成分靶點(diǎn)有27個(gè)；2味藥物共同作用靶點(diǎn)有18個(gè)，分別為AR，DPP4，EGFR，ESR1，PRKACA，PPARG，KCNH2，PTGS1，PTGS2，RXRA，SCN5A，F(xiàn)2，PRSS1，NOS3，NCOA2，TOP2A，F(xiàn)7，PPARD.三七-白及藥對(duì)既有不同作用靶點(diǎn)，又有共同作用靶點(diǎn)，提示三七和白及在用藥過(guò)程中存在一定的協(xié)同或拮抗作用.

圖1 藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig.1 Drug-active ingredient-target network

將三七、白及2味藥物和15個(gè)活性成分及193個(gè)靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入Cytoscape軟件，得到藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，如圖1所示.圖1中：網(wǎng)路共包含210個(gè)節(jié)點(diǎn)和336條邊；紅色六邊形分別代表三七和白及；粉色圓形代表三七的活性成分；橙色圓形代表白及的活性成分；綠色菱形代表作用靶點(diǎn)；連接線代表相互關(guān)系.經(jīng)Cytoscape軟件分析，槲皮素(quercetin)作用靶點(diǎn)有150個(gè)，數(shù)量最多，其次為β-谷甾醇(beta-sitosteroll)37個(gè)和豆甾醇(stigmasterol)31個(gè).從作用靶點(diǎn)角度分析，PTGS2相互作用活性成分?jǐn)?shù)目最多，有12個(gè)，PTGS1相互作用活性成份有9個(gè)，SCN5A有8個(gè).結(jié)果表明:前述活性成分和靶點(diǎn)蛋白在三七-白及藥對(duì)疾病治療過(guò)程中發(fā)揮重要作用，活性成分與靶點(diǎn)蛋白間復(fù)雜的相互作用關(guān)系體現(xiàn)了中藥在應(yīng)用中“多組分-多靶點(diǎn)”綜合調(diào)節(jié)的特點(diǎn).

2.3 靶點(diǎn)基因與相關(guān)疾病分析

將193個(gè)靶點(diǎn)基因?qū)隒TD數(shù)據(jù)庫(kù)，富集相關(guān)疾病，得到與靶點(diǎn)基因相關(guān)的疾病共有35類，前10類靶點(diǎn)基因相關(guān)疾病的富集，如表2所示.由表2可知：與癌癥相關(guān)的疾病有124種，涉及139個(gè)靶點(diǎn)基因；其次為神經(jīng)系統(tǒng)疾病,有83種，涉及116個(gè)靶點(diǎn)基因;心血管疾病有70種，涉及120個(gè)靶點(diǎn)基因，說(shuō)明三七-白及藥對(duì)可用于癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等的治療.

表2 前10類靶點(diǎn)基因相關(guān)疾病的富集Tab.2 Enrichment of target gene related diseases (top 10)

圖2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Protein interaction network

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心蛋白獲取

通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)及Cytoscape軟件分析，得到靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示.圖2中：網(wǎng)絡(luò)共包括167個(gè)節(jié)點(diǎn)和677條邊；節(jié)點(diǎn)的大小表示degree值的大小，節(jié)點(diǎn)越大，對(duì)應(yīng)的degree值越大，degree排名前5位的節(jié)點(diǎn)蛋白為AKT1(35)，MAPK1(34)，c-Jun(34)，P53(33)，TNF(31)，說(shuō)明這些節(jié)點(diǎn)蛋白在相互作用網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，將其作為核心蛋白.

2.5 靶點(diǎn)基因GO生物學(xué)過(guò)程及KEGG通路富集結(jié)果

圖3 前10條靶點(diǎn)基因生物學(xué)過(guò)程富集Fig.3 Biological process enrichment results of top 10 target genes

采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)基因進(jìn)行富集分析，GO富集結(jié)果顯示，靶點(diǎn)基因顯著富集到91條生物學(xué)過(guò)程中，主要涉及藥物反應(yīng)(response to drug)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(positive regulation of transcription)、衰老(aging)、細(xì)胞增殖的正調(diào)控(positive regulation of cell proliferation)等.前10條靶點(diǎn)基因生物學(xué)過(guò)程,如圖3所示.圖3中：以Q<0.05作為顯著性標(biāo)準(zhǔn),Q越小越顯著，氣泡顏色越偏向紅色，反之越偏向綠色；各條目相關(guān)基因數(shù)越多，氣泡越大，反之越小.KEGG通路富集結(jié)果顯示，靶點(diǎn)基因在66條通路顯著性富集，主要包括癌癥通路(pathways in cancer)、乙型肝炎(hepatitis B)、膀胱癌(bladder cancer)、TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)等，前10條靶點(diǎn)基因KEGG 通路富集，如表3所示.

表3 前10條靶點(diǎn)基因 KEGG 通路富集Tab.3 KEGG pathway analysis of (top 10) target genes

由富集到癌癥通路的靶點(diǎn)基因數(shù)目最多，有53個(gè).靶點(diǎn)基因與癌癥通路，如圖4所示.圖4中：紅色節(jié)點(diǎn)表示富集于癌癥通路上的靶點(diǎn)基因.由圖4可知：該結(jié)果與前述靶點(diǎn)基因相關(guān)疾病中癌癥數(shù)目最多的結(jié)果相符，提示三七-白及藥對(duì)在癌癥相關(guān)疾病的治療中具有潛在優(yōu)勢(shì)，可作為今后實(shí)驗(yàn)研究和臨床實(shí)踐的重要方向.

圖4 靶點(diǎn)基因與癌癥通路Fig.4 Target genes and pathways in cancer

3 討論

中藥在復(fù)雜疾病的治療中考慮了疾病治療的整體性，具有多組分、多靶點(diǎn)、多通路聯(lián)合作用的特點(diǎn)[21].采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)三七-白及藥對(duì)進(jìn)行研究，共得到17個(gè)活性成分與193個(gè)作用靶點(diǎn).通過(guò)藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析顯示：槲皮素、β-谷甾醇和豆甾醇等為網(wǎng)絡(luò)的重要節(jié)點(diǎn).槲皮素具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)的作用[22-24]，可用于治療肥胖、心血管疾病、糖尿病和癌癥等疾病[25-27].槲皮素通過(guò)上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，調(diào)控MAPK信號(hào)通路，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)A375SM細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗黑色素瘤的作用[28].β-谷甾醇具有廣泛的抗癌藥理活性，可下調(diào) P13K/AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo) SGC-7901 細(xì)胞發(fā)生自噬，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，發(fā)揮抗胃癌作用[29].實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇還能促進(jìn)肝癌移植瘤IFN-γ 表達(dá)并抑制IL-6 表達(dá)，降低血清VEGF 水平，發(fā)揮抗癌作用[30].豆甾醇能夠顯著降低COX-2 和CSF-1蛋白的表達(dá)，抑制NF-κB通路激活，改善硫酸右旋糖酐所致結(jié)腸炎，發(fā)揮抗炎活性[31].豆甾醇可通過(guò)上調(diào)促凋亡蛋白Bax和P53表達(dá)，并下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[32].網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)蛋白PTGS2，PTGS1，SCN5A等可與多個(gè)活性成分相互作用，體現(xiàn)了三七-白及藥對(duì)多組分、多靶點(diǎn)協(xié)調(diào)作用的特點(diǎn).靶點(diǎn)基因-疾病網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，與193個(gè)靶點(diǎn)基因相關(guān)的疾病共有35類，主要涉及癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等，說(shuō)明三七-白及藥對(duì)在癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等的治療中具有潛在藥效作用.

根據(jù)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，得到核心蛋白AKT1，MAPK1，c-Jun，P53，TNF等，在三七-白及藥對(duì)藥理作用過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用.AKT1為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與調(diào)節(jié)包括代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和血管生成等生物過(guò)程[33-34]，在胰島素信號(hào)傳導(dǎo)、血管生成和腫瘤形成等方面起著重要作用[35-36].MAPK1參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和發(fā)育等過(guò)程，與多種癌癥的治療密切相關(guān)，miR-329-3p可直接抑制MAPK1表達(dá)，從而抑制宮頸癌發(fā)展[37].研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)lncRNA TDRG1可促進(jìn)miR-326的表達(dá)，從而降低MAPK1的表達(dá)水平，抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲[38].c-Jun是由原癌基因JUN編碼的一種轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)蛋白，研究表明，c-Jun與肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[39-40].P53是一種腫瘤抑制蛋白，可調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、凋亡、衰老，DNA修復(fù)或代謝等過(guò)程，TP53基因的突變普遍存在于各種癌癥類型中[41-42].TNF是一種主要由巨噬細(xì)胞分泌的多功能促炎細(xì)胞因子，參與調(diào)控多種生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、脂質(zhì)代謝和凝血等，并與自身免疫性疾病、胰島素抵抗和癌癥等疾病密切相關(guān)[43-44].

GO富集分析結(jié)果顯示，靶點(diǎn)基因顯著富集在藥物反應(yīng)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、衰老、細(xì)胞增殖正調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程.三七總皂苷能一定程度透過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)，調(diào)節(jié)帕金森患者腦中氨基酸質(zhì)量濃度，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[45].三七乙醇提取物可通過(guò)介導(dǎo)胰島素/IGF-1信號(hào)通路，增強(qiáng)應(yīng)激抵抗，發(fā)揮抗衰老作用[46].白及多糖能有效抑制NADPH氧化酶4(NOX4)的上調(diào)，降低Ang Ⅱ誘導(dǎo)的toll樣受體2(TLR2)過(guò)表達(dá)，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和抗炎作用[47].此外，三七總皂苷通過(guò)啟動(dòng)PI3K/AKT/mTOR通路和PI3K/AKT/Bad通路促進(jìn)肝再生期肝細(xì)胞增殖，保護(hù)肝細(xì)胞免受肝部分切除術(shù)后誘導(dǎo)的凋亡，可作為一種促進(jìn)肝臟再生能力和肝臟功能恢復(fù)的新途徑[48].KEGG的通路富集主要涉及癌癥通路、乙型肝炎、膀胱癌、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等，其中，顯著富集到癌癥通路上的靶點(diǎn)基因有53個(gè)，與前述結(jié)果靶點(diǎn)基因與癌癥相關(guān)的疾病數(shù)目最多結(jié)果相符，另外，癌癥通路與mTOR信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等多個(gè)信號(hào)通路的調(diào)控密切相關(guān)，說(shuō)明癌癥通路在三七-白及藥對(duì)疾病治療過(guò)程中的重要性.研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷可顯著降低Hgf,Met,Notch3等一系列促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的表達(dá)，提高腫瘤抑制基因Rxrg的表達(dá)，調(diào)控Met/miR-222水平，發(fā)揮抗肺癌和其他類型癌癥的作用[49].白及提取物可通過(guò)調(diào)控 PI3K/AKT 信號(hào)通路、RIG-1-like 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、Toll 樣信號(hào)通路以及 NF-κB信號(hào)通路中的差異基因表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗流感病毒作用[50].體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，白及多糖可通過(guò)抑制肝細(xì)胞癌增殖，發(fā)揮抗腫瘤活性[51].目前研究已證實(shí)的三七和白及有效成分所涉及的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路，與文中研究預(yù)測(cè)結(jié)果存在一致性，說(shuō)明預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，表明三七-白及藥對(duì)在疾病治療，尤其是癌癥的治療過(guò)程中具有潛在的優(yōu)勢(shì)，可以作為未來(lái)進(jìn)一步研究的方向.

綜上所述，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法綜合分析三七和白及的活性成分、作用靶點(diǎn)、相關(guān)疾病和信號(hào)通路等，為深入研究三七-白及藥對(duì)的藥理作用機(jī)制提供理論依據(jù)，但具體結(jié)果仍需進(jìn)一步的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床研究驗(yàn)證.