王舒叆，王子元,2，張 敏,2,*

（1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京工商大學，北京 100048；2.北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京工商大學，北京 100048）

面條作為我國的傳統(tǒng)主食之一，是一種制作簡單、食用方便、營養(yǎng)豐富的食品。隨著人們生活水平的提高，“鮮濕面”應時而生[1-3]。近年來，雜糧鮮濕面也逐漸成為消費者所追捧的對象，其能為消費者提供豐富的營養(yǎng)以及特別的口感、滋味。然而鮮濕面含水量高，水分活度大，在室溫下極易腐敗變質[4]。本課題組前期對青稞鮮濕面進行16S rDNA高通量測序發(fā)現(xiàn)，在青稞鮮濕面貯藏期間，芽孢桿菌屬為優(yōu)勢腐敗菌群[5]。近年來，蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）已逐漸被認為是一種通過生產(chǎn)腸毒素而導致胃腸疾病的致病性細菌[6-7]。蠟樣芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種革蘭氏陽性菌，兼性需氧，廣泛分布于土壤、灰塵和污水中，也是食品中常見的污染菌和條件致病菌[8-10]。食品中蠟樣芽孢桿菌數(shù)量超過5（lg（CFU/g））時即可導致嘔吐和腹瀉[11]。如何抑制青稞鮮濕面中蠟樣芽孢桿菌的生長已成為青稞鮮濕面生產(chǎn)加工中的一項亟待解決的問題。

目前，除常用的一些保鮮劑外，肉桂醛、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）和乳酸鏈球菌素（Nisin）等天然化合物也逐漸成為具有應用前景的保鮮劑研究對象。肉桂精油已被證明在肉制品及乳制品的保鮮應用中有良好的抑菌效果[12]，周小偉[13]通過肉桂醛熏制鮮濕面從而達到抑菌保鮮的目的。EGCG不僅對于引起食品腐敗變質的革蘭氏陽性菌有較好的抑制效果，同時能在食物體系中起到良好的抗氧化性[14]；Feng Lifang[15]和Li Tingting[16]等將茶多酚溶液涂抹在黑鯛和大黃魚的表面再進行冷藏，能使其貨架期分別延長6 d和8 d；駱曉波[17]研究顯示EGCG納米脂質體能延長鱈魚的保鮮時間，具有廣闊的市場潛力。Nisin作為一種理想的天然、高效食品防腐劑也因其對革蘭氏陽性菌具有較好的抑制效果，被廣泛應用于乳制品、肉制品及豆制品等高蛋白食品的保鮮研究[18-19]。毛汝婧[20]通過將Nisin與其他抑菌劑復配達到延長鮮濕面貯藏期的目的?？梢姡鲜? 種抑菌劑均能起到一定的食品保鮮作用。但是，將上述3 種抑菌劑作為配料添加至青稞鮮濕面中，并探究其對面制品內特定菌（蠟樣芽孢桿菌）的抑制效果的研究鮮有報道。

根據(jù)GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》，Nisin在方便面制品中的最大添加量為0.25 g/kg（0.025%），肉桂醛和EGCG無明確規(guī)定添加量。本研究擬對比分析同一添加量（0.025%）的3 種抑菌劑，以及0.05%的肉桂醛和EGCG對青稞鮮濕面中蠟樣芽孢桿菌的抑菌效果。通過對室溫（25 ℃）條件下貯藏的青稞鮮濕面中蠟樣芽孢桿菌菌落數(shù)的分析及青稞鮮濕面產(chǎn)品的質構和色澤的測定，評判這3 種抑菌劑在青稞鮮濕面產(chǎn)品中的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘北青3號’青稞（蛋白質量分數(shù)9.57%、水分質量分數(shù)12.2%）購自山西東方亮生命科技有限公司；金沙河小麥粉（蛋白質量分數(shù)12.87%、水分質量分數(shù)13.11%）、不加碘食鹽購自當?shù)亓闶鄢小?/p>

胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉 上海麥克林生化科技有限公司；鹽酸 福晨（天津）化學試劑有限公司；無水乙醇 北京化工廠；胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術有限公司；肉桂醛（純度95%）、EGCG（純度90%）、Nisin A（純度900 IU/mg） 上海源葉生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

IMDT168實驗面條機、JHMZ200和面機 北京東孚久恒儀器技術有限公司；TMS-Pilot物性分析儀 美國FTC公司；BCL-1360A超凈工作臺 北京亞太克隆儀器技術有限公司；DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；THZ-83A恒溫水浴振蕩器 天津市泰斯特儀器有限公司；CR-400/410色差儀 日本柯尼卡美能達公司；WF-20B高效粉碎機 南京科益機械設備有限公司；SLG30-IV雙螺桿擠壓機（?？谥睆?.39 cm、長徑比為23∶1） 濟南賽百諾科技開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

蠟樣芽孢桿菌為北京工商大學糧油加工實驗室前期在青稞鮮濕面中分離、純化及鑒定的保藏菌種，將蠟樣芽孢桿菌單菌落接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫搖床中以150 r/min連續(xù)振蕩培養(yǎng)13 h后，吸取10 mL蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)液，8 000 r/min離心10 min，收集沉淀，加入2 mL無菌生理鹽水使菌體復懸，制成2 mL的蠟樣芽孢桿菌懸液，于4 ℃冰箱貯藏并在1 d之內使用。

1.3.2 抑菌劑的制備

肉桂醛、EGCG、Nisin于2～8 ℃貯藏。肉桂醛、EGCG溶解于體積分數(shù)15%乙醇溶液，Nisin溶解于0.02 mol/L的HCl溶液，分別制成10 mg/mL的抑菌劑母液[21]。3 種抑菌劑用0.2 μm過濾膜過濾消毒，于4 ℃冰箱貯藏并在1 d內使用。

1.3.3 最小抑菌濃度的測定

將蠟樣芽孢桿菌制成6～7（lg（CFU/mL））的菌懸液，實驗設置陽性對照（加菌液）、陰性對照組（不加菌液）和抑菌劑實驗組，每組均設3 組平行實驗，共90 孔。實驗組為100 μL新鮮LB液體培養(yǎng)基分別與100 μL的3 種抑菌劑混勻，用二倍稀釋法使3 種抑菌劑分別由高至低配成一定的質量濃度梯度（4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625、0.007 812 5 mg/mL）[22]；陽性、陰性對照組為200 μL新鮮LB液體培養(yǎng)基按照二倍稀釋法稀釋。實驗組與陽性對照組每孔加入100 μL蠟樣芽孢桿菌懸液吸打混勻，陰性對照組每孔再加入100 μL新鮮LB液體培養(yǎng)基。將96 孔板放在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，觀察96 孔板中能明顯看到LB液體培養(yǎng)基不渾濁（且陽性對照孔內的蠟樣芽孢桿菌正常生長，液體培養(yǎng)基渾濁）的孔所對應的抑菌劑的最小質量濃度即為該抑菌劑的最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）。

1.3.4 青稞粉的制備

未擠壓青稞粉：WF-20B高效粉碎機過80 目篩粉碎青稞籽，再過120 目二次粉碎得水分質量分數(shù)為7.70%的未擠壓青稞粉。

擠壓青稞粉：用去離子水將未擠壓青稞粉的水分質量分數(shù)調整至17%并充分攪拌均勻，靜置24 h。采用SLG30-IV雙螺桿擠壓機預熱30 min后，進行擠壓膨化（擠壓工藝參數(shù)為：螺桿轉速260 r/min；筒體I區(qū)40 ℃、II區(qū)70 ℃、III區(qū)100 ℃、IV區(qū)150 ℃），擠壓后再經(jīng)WF-20B高效粉碎機過120 目篩制得擠壓青稞粉[23]。

1.3.5 青稞鮮濕面的制作及接種

青稞鮮濕面制作工藝：按m（擠壓青稞粉）∶m（未擠壓青稞粉）∶m（小麥粉）＝1∶1∶3稱料混勻，在800 W微波爐中微波殺菌40 s[24]，再加入一定比例無菌去離子水（溶解了原料粉總質量1%的食鹽，并加入2 mL蠟樣芽孢桿菌菌懸液）后放入和面機中和面6 min，得到目標水分質量分數(shù)為36%的面絮，裝入自封袋密封，在30 ℃恒溫下靜置30 min醒面，再采用面條機將醒發(fā)好的面絮壓制成厚度為1.5 cm的面片并切成寬度為2 cm的面條，最后每25 g面條放入一個自封袋中密封備用，所得青稞鮮濕面中初始蠟樣芽孢桿菌菌落總數(shù)達到5～7（lg（CFU/g））。對于肉桂醛和EGCG實驗組，設置在青稞鮮濕面中抑菌劑的添加量分別為0.025%（MIC）、0.05%（2 MIC），以添加15%乙醇為對照組；對于Nisin實驗組，設置在青稞鮮濕面中抑菌劑的添加量為0.025%（MIC）（因為GB 2760—2014限制其添加量不超過0.025%，因此不探究0.05%添加量），以添加0.02 mol/L鹽酸溶液為對照組。所有實驗組均以不添加制劑為空白對照組。所有樣品在25 ℃條件下貯藏。數(shù)據(jù)采自3 次獨立重復的平行實驗。

1.3.6 蠟樣芽孢桿菌總數(shù)測定

按照GB/T 4789.2-2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》方法測定樣品貯藏0、6、12、24 h和36 h時的蠟樣芽孢桿菌總數(shù)，選用TSA培養(yǎng)基進行微生物分析。

1.3.7 質構特性測定

采用物性分析儀對青稞鮮濕面樣品進行質地剖面分析（texture profile analysis，TPA）測定，測定速率48 mm/min，探頭回升高度為15.00 mm，形變量為70%[25]，感應力為0.05 N，兩次壓縮間隔為1 s，測定的質構指標包括硬度、彈性、內聚性和咀嚼性，每個樣品重復測定6 次，除去最大值和最小值，取平均值[26]。數(shù)據(jù)采自3 次獨立重復的平行實驗。

1.3.8 色澤測定

選取切條之前壓延好的青稞鮮濕面片作為樣品，采用色差儀測定樣品的L*值（亮度）、a*值（紅綠度）、b*值（黃藍度）[27]。每個樣品重復測定5 次，除去最大值和最小值，取平均值。數(shù)據(jù)采自3 次獨立重復的平行實驗。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)均采用Excel和SPSS 19.0軟件處理，選擇Duncan檢驗在P＜0.05水平上對數(shù)據(jù)進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 3 種抑菌劑的最小抑菌濃度

表1 抑菌劑對蠟樣芽孢桿菌作用24 h的最小抑菌濃度Table 1 Minimum inhibitory concentrations of antimicrobial agents against Bacillus cereus after 24 h exposure

由表1可知，3 種抑菌劑對蠟樣芽孢桿菌的MIC均為0.025%，這與Cetin-Karaca等[28]的研究結果相符。結合GB 2760—2014推薦添加量，肉桂醛和EGCG抑菌效果采用0.025%（MIC）及0.05%（2 MIC），Nisin抑菌效果采用0.025%（MIC）進行后續(xù)實驗分析。

2.2 3 種抑菌劑對蠟樣芽孢桿菌的抑制效果

圖1 25 ℃下0.025%（A）、0.05%（B）肉桂醛和EGCG對青稞鮮濕面中蠟樣芽孢桿菌的抑制作用Fig. 1 Inhibitory effect of cinnamaldehyde and EGCG at 0.025% (A)and 0.05% (B) each on Bacillus cereus inoculated in fresh wet noodles incorporated with highland barley stored at 25 ℃

由圖1A可知，在0～6 h內，蠟樣芽孢桿菌菌落數(shù)呈現(xiàn)減小趨勢，這可能是微生物在適應新環(huán)境的初期所產(chǎn)生的滯后現(xiàn)象[29]，36 h貯藏期內，空白對照組的菌落數(shù)顯著增長了1.36（lg（CFU/g））；0.025% EGCG組中蠟樣芽孢桿菌菌落數(shù)增加了1.30（lg（CFU/g）），貯藏末期與乙醇對照組和空白對照組無顯著差異；而0.025%肉桂醛組中蠟樣芽孢桿菌菌落數(shù)僅增加0.84（lg（CFU/g）），其生長速率與其他組相比明顯延緩；貯藏36 h時與對照組（“對照組”菌落數(shù)為空白對照組與乙醇對照組的平均值，下同）相比，0.025%肉桂醛組的蠟樣芽孢桿菌菌落數(shù)顯著降低0.64（lg（CFU/g））。因此，0.025%肉桂醛顯著抑制了蠟樣芽孢桿菌的生長，而0.025% EGCG并沒有顯示出抑菌活性。黃敏欣等[30]在綜述中闡明，肉桂醛在較低的抑菌濃度下，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌具有良好的抑制效果。

由圖1B可知，在整個貯藏期內，空白對照組中蠟樣芽孢桿菌顯著增長了1.77（lg（CFU/g）），0.05%肉桂醛組蠟樣芽孢桿菌菌落數(shù)顯著減小了0.7（lg（CFU/g）），0.05% EGCG組顯著減小了0.58（lg（CFU/g））。在貯藏終點，0.05%肉桂醛和0.05% EGCG組蠟樣芽孢桿菌菌落數(shù)分別為4.96（lg（CFU/g））和5.38（lg（CFU/g）），分別比對照組減小了2.49（lg（CFU/g））和2.07（lg（CFU/g））。周小偉等[31]研究發(fā)現(xiàn)，0.05%的肉桂醛可完全抑制從鮮濕面中分離出的革蘭氏陽性芽孢桿菌的生長；辛敏等[32]研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚（EGCG為其主要成分）對枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌有著良好的抑制效果，且與其濃度呈正相關。0.05%肉桂醛和0.05% EGCG對蠟樣芽孢桿菌的抑制活性明顯高于低劑量（0.025%）的抑制活性，能顯著抑制青稞鮮濕面中蠟樣芽孢桿菌的生長，且肉桂醛的抑菌活性要高于EGCG。Cetin-Karaca等[28]研究發(fā)現(xiàn)，0.05%肉桂醛和0.05% EGCG均可顯著抑制重組嬰兒米糊中蠟樣芽孢桿菌的生長。

圖2 25 ℃下0.025% Nisin對青稞鮮濕面中蠟樣芽孢桿菌的抑制作用Fig. 2 Inhibitory effect of 0.025% Nisin on Bacillus cereus inoculated in fresh wet noodles incorporated with highland barley stored at 25 ℃

由圖2可知，在整個貯藏過程中，空白對照組的蠟樣芽孢桿菌菌落數(shù)顯著增加了1.39（lg（CFU/g））；而添加0.025% Nisin的青稞鮮濕面中的蠟樣芽孢桿菌菌落數(shù)僅增加了0.96（lg（CFU/g））。貯藏期內，0.025% Nisin組的菌落數(shù)一直顯著低于空白對照組和HCl對照組，在貯藏終點比對照組顯著低0.83（lg（CFU/g））。侯亞文等[33]研究表明，Nisin能對許多引起食品腐敗的革蘭氏陽性菌，特別是芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌等產(chǎn)芽孢的細菌產(chǎn)生較強的抑制效果。但是Nisin的抑菌效果受食品成分和環(huán)境影響較大，食品中的許多組分都能影響其抑菌活性[34]。

在青稞鮮濕面中，蠟樣芽孢桿菌的平均初始數(shù)量為5.86（lg（CFU/g）），0.025%肉桂醛和Nisin均可使蠟樣芽孢桿菌得到不同程度的抑制，但不能完全抑制其生長，0.025% EGCG對青稞鮮濕面中的蠟樣芽孢桿菌無顯著性影響；而添加0.05%的肉桂醛和EGCG均可顯著抑制蠟樣芽孢桿菌的生長。結合GB 2760—2014中規(guī)定的最大添加量的限制，在25 ℃貯藏條件下，肉桂醛對青稞鮮濕面中蠟樣芽孢桿菌的抑制效果最好。

2.3 3 種抑菌劑對青稞鮮濕面質構的影響

根據(jù)TPA結果，25 ℃貯藏條件下，貯藏36 h內，添加0.025%的3 種抑菌劑的青稞鮮濕面與空白對照組、乙醇對照組及HCl對照組比較，其硬度、彈性、內聚性和咀嚼性均無顯著性差異（數(shù)據(jù)未列出）。表2為添加了0.05%肉桂醛和0.05% EGCG的青稞鮮濕面質構特性隨著貯藏時間的變化結果。在25 ℃下貯藏12 h后，肉桂醛、EGCG組的青稞鮮濕面硬度比對照組顯著增加了3.34 N和3.11 N；貯藏24 h后，分別添加0.05%肉桂醛和0.05% EGCG的青稞鮮濕面比對照組顯著增加了7.29 N和4.94 N。

表2 25 ℃下0.05%抑菌劑對青稞鮮濕面質構品質的影響Table 2 Effect of each bacteriostatic agent at 0.05% on the texture of fresh wet noodles incorporated with highland barley stored at 25 ℃

貯藏12 h后，添加0.05%肉桂醛和0.05% EGCG的青稞鮮濕面咀嚼性比對照組分別顯著增加了3.345 mJ和3.675 mJ；而貯藏終點36 h時實驗組與對照組之間無顯著差異。空白對照組在貯藏期內的咀嚼性先下降后上升，而0.05%肉桂醛和0.05% EGCG組在36 h貯藏期內均無顯著變化，證明0.05%肉桂醛和0.05% EGCG可在樣品貯藏12～24 h期間內提高其咀嚼性。

分別添加0.05%肉桂醛和0.05% EGCG的青稞鮮濕面與兩種對照組比較，其彈性和內聚性均無明顯差異，在36 h貯藏期內所有樣品彈性呈整體減小趨勢，內聚性變化不明顯。

胡劉巖[35]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)肉桂醛處理過的冷鮮肉硬度、彈性、黏結性、膠著性、咀嚼度均比對照組好；還有研究發(fā)現(xiàn)肉桂醛納米液處理牛肉餅對其質構有顯著的改善作用[36]。胡思[37]研究表明，茶多酚可與環(huán)境中的蛋白質結合形成穩(wěn)定性較強的交聯(lián)網(wǎng)狀結構，可達到提升鮮濕面質構品質的作用。綜合硬度、彈性、內聚性和咀嚼性的質構特性分析，與兩個對照組相比，0.05%肉桂醛和0.05% EGCG可在12～24 h貯藏期內提高青稞鮮濕面的硬度，在貯藏12 h時提高其咀嚼性。

2.4 3 種抑菌劑對青稞鮮濕面色澤的影響

在25 ℃貯藏36 h，分別添加0.025% 3 種抑菌劑的青稞鮮濕面與空白對照組、乙醇對照組以及HCl對照組比較，其L值、a*值和b*值均無顯著性差異，且隨著貯藏時間的延長，所有樣品的L*值和b*值均呈現(xiàn)下降趨勢，a*值呈現(xiàn)上升趨勢（數(shù)據(jù)未列出）。

表3 25 ℃下0.05%抑菌劑對青稞鮮濕面色澤的影響Table 3 Effect of each antibacterial agent 0.05% on the color of fresh wet noodles incorporated with highland barley stored at 25 ℃

表3顯示添加了0.05%肉桂醛和0.05% EGCG的青稞鮮濕面色澤在貯藏過程中的變化結果。在貯藏期內所有樣品的L*值均顯著下降。貯藏12 h后，0.05%肉桂醛和0.05% EGCG組與空白對照組和乙醇對照組相比均顯著提高了青稞鮮濕面的亮度，貯藏至36 h時，肉桂醛組青稞鮮濕面亮度最高，與對照組相比其L*值提高了5.295；0.05% EGCG處理組與對照組相比其L*值提高了2.915。

在貯藏過程中，所有樣品的a*值均顯著增加。貯藏至36 h時，0.05%肉桂醛和0.05% EGCG組a*值與對照組相比分別降低0.41和0.59。

在貯藏期內，除肉桂醛組b*值無顯著性變化，其他組樣品b*值均顯著下降。肉桂醛組貯藏至36 h其b*值與對照組相比顯著增加2.44，可能與肉桂醛乙醇溶液呈淡黃色有關；而0.05% EGCG組青稞鮮濕面的b*值與兩個對照組之間無顯著差異，說明其對青稞鮮濕面的b*值無顯著影響。溫小禮[38]的研究表明，5 μL/L的肉桂醛熏蒸處理香菇，不僅可提高其抗壞血酸、超氧化歧化酶和谷胱甘肽還原酶等相關抗氧化物酶的活力，還能提高香菇清除自由基的能力及總抗氧化能力，從而達到護色的效果。因此，肉桂醛可能因為其較強的抗氧化性抑制了青稞鮮濕面中的酶促褐變反應，從而達到提升亮度、黃藍度的效果，進而起到護色保鮮的作用。

綜合L*值、a*值、b*值分析結果，在25 ℃下貯藏36 h，添加0.05%的肉桂醛對青稞鮮濕面有較好的改善色澤的效果，與對照組相比樣品貯藏36 h使其L*值提高5.29，a*值降低0.41，b*值升高2.435。

3 結 論

在25 ℃、36 h的貯藏條件下，隨著抑菌劑添加量的增加其抑菌效果也顯著提高。相較于兩個對照組，添加0.025%的肉桂醛和Nisin對蠟樣芽孢桿菌均有抑制作用，分別使得貯藏終點的青稞鮮濕面中蠟樣芽孢桿菌比對照組顯著減小0.64（lg（CFU/g））和0.83（lg（CFU/g）），而0.05%肉桂醛和0.05% EGCG分別使得青稞鮮濕面中的蠟樣芽孢桿菌菌落數(shù)比對照組減小2.49（lg（CFU/g））和2.07（lg（CFU/g））?？梢娙夤鹑┑囊志钚宰詈茫?.025%和0.05%的添加量都可抑制青稞鮮濕面中蠟樣芽孢桿菌的生長，而Nisin的添加量要求限制了其在青稞鮮濕面的保鮮應用。

在25 ℃、36 h的貯藏條件下，低添加量（0.025%）的肉桂醛、EGCG和Nisin對青稞鮮濕面的質構以及色澤均無顯著性影響；高添加量（0.05%）的肉桂醛和EGCG僅可在12～24 h貯藏期內提高青稞鮮濕面的硬度以及在貯藏12 h時提高青稞鮮濕面的咀嚼性，但有較好的改善色澤作用。貯藏至36 h，與對照組相比，0.05%肉桂醛和EGCG分別使鮮濕面L*值提高了5.295和2.915，且0.05%肉桂醛使樣品的b*值顯著增加2.44，使青稞鮮濕面整體顏色更加偏黃色。