常 紅，畢 耀，王 穎，潘道東，黨亞麗，何 俊，曹錦軒*

（農(nóng)產(chǎn)品質量安全國家重點實驗室，浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室，浙江 寧波 315211）

金華火腿是中國最著名的傳統(tǒng)干腌肉制品之一，發(fā)酵時間長達數(shù)月，期間分解產(chǎn)生多種營養(yǎng)成分，色澤鮮艷，紅白分明，以色、香、味、形“四絕”聞名于世[1]。傳統(tǒng)金華火腿貯藏一般采用吊掛或者堆疊法暴露于空氣中，火腿天然色素易于氧化導致產(chǎn)品色澤變暗、表面脫水、含鹽量升高、質構變硬和可接受性降低[2-3]。此外，貯藏過程中霉菌等某些微生物易于生長，微生物內的脫羧酶表達導致火腿中游離氨基酸分解產(chǎn)生生物胺，使得產(chǎn)品存在一定的安全隱患[3]。不當貯藏引起的脫水、褪色、微生物超標和生物胺積累等嚴重影響了金華火腿的產(chǎn)品品質，制約了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4]。因此，通過一定的工藝處理提高產(chǎn)品可接受度和食用品質安全有著極大的意義。

研究表明，可食性薄膜和保護性涂層在肉制品氧化、褪色、水分損失和微生物污染引起的異味等方面起到了重要的抑制作用[5]。目前，西班牙和意大利火腿加工過程中，涂層法是常用的品質改良方法，在成熟期的火腿表面涂抹一層阻隔介質，可降低火腿半膜肌與空氣的接觸面積，從而減少火腿水分散失，維持產(chǎn)品的品質穩(wěn)定[6]。動植物油及淀粉、殼聚糖是常用的火腿涂層介質[7]，然而這些涂層存在成膜性差、保水性差以及抗菌范圍窄等不足[8]。植物精油是一類植物次生代謝產(chǎn)物，有研究表明其具有抑菌[9]及抗氧化[10]的作用，已被開發(fā)應用于肉制品的保藏[11]。其中，黑胡椒精油（black pepper essential oil，BPEO）作為世界上最受歡迎的肉類調料之一，主要成分是胡椒堿和胡椒堿異構體，還有單帖和半萜類化合物[12]，具有良好的抗菌和抗氧化作用[9,13-14]。王穎等[10]的研究結果表明BPEO具有良好的抗氧化活性，對食品污染菌也有著明顯的抑制作用。Zhang Jing等[15]研究BPEO對鮮豬肉貯藏品質的影響，結果表明革蘭氏陰性菌比革蘭氏陽性菌對BPEO更敏感。將精油與可食性膜制備成復合涂層，具備潛在預防脫水、褪色、微生物超標和生物胺積累等作用[16-17]。但是將BPEO用于火腿涂層中提高食用品質安全的研究較少。因此，本研究擬采用4 種涂層處理金華火腿表面，評價其貯存4 個月后色澤、水分質量分數(shù)、pH值、菌落總數(shù)以及生物胺含量等理化特性及食用品質安全的變化，以期為工業(yè)生產(chǎn)實際應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統(tǒng)金華火腿（NaCl質量分數(shù)為13%）購自于金華宗澤火腿有限公司，采用自然發(fā)酵條件下加工而成[18]。

BPEO（純度不低于98%，4 ℃避光保存） 意大利Moellhausen S.p.A.公司。在使用前，用體積分數(shù)20%的乙醇溶液將BPEO稀釋至體積分數(shù)分別為0.05%和0.1%。

丙酮（色譜純） 杭州高晶精細化工有限公司；乙腈（色譜純） 上海安譜實驗科技股份有限公司；高氯酸、丹磺酰氯等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Allerga冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特公司；WH966漩渦攪拌器；M124A電子精密天平、pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；恒溫水浴鍋 天瑞儀器有限公司；高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；CR-400色差儀 日本柯尼達美能達公司；Micropro2000Reader酶標儀 瑞士Tecan公司；XHF-D高速分散器 寧波新芝生物科技公司；Milli-Q型超純水制備系統(tǒng) 德國Merck公司。

1.3 方法

1.3.1 涂抹液的制備

根據(jù)不同的涂抹混合物，將20 只火腿分為4 組：對照組（不涂抹）、基礎配方涂層（base formula coating，BC）組、低劑量黑胡椒精油復合涂層（low-dose BPEO containing composite coating，LBPEOC）組、高劑量黑胡椒精油復合涂層（high-dose BPEO containing composite coating，HBPEOC）組。基礎配方包括750 g面粉、375 mL植物油、375 g豬油、75 g β-環(huán)糊精；LBPEOC、HBPEOC組在基礎配方上，再分別加上0.6 mL的0.05% BPEO和0.1% BPEO。

具體涂抹液的制作方法：將豬油在40 ℃熔化，加入面粉、植物油和β-環(huán)糊精，用玻璃棒攪拌均勻，最后將BPEO加入混合物中混勻制備成涂抹液。

1.3.2 火腿取樣、涂層和樣品制備

將火腿表面的氧化層剔除，然后按照分組用小刷子將制備的涂抹混合物均勻地涂在火腿表面，厚度約為0.5 cm，平攤，室溫25 ℃和相對濕度60%～70%下貯藏4 個月。各組均按照每100 g火腿2.1 mL涂抹液進行涂抹。貯存4 個月后，從每組5 條火腿中取出5 塊股二頭肌條，采集肌肉條進行指標測定。所有樣品待測定色澤后，切成小塊（約1 cm×1 cm×1 cm）測定水分質量分數(shù)、pH值、菌落總數(shù)及生物胺。

1.3.3 水分質量分數(shù)測定

按照GB/T 9695.15—2008《肉與肉制品 水分含量測定》測定水分質量分數(shù)。每組平行測定5 次。

1.3.4 色澤測定

使用色差儀對樣品進行亮度（L*）、紅度（a*）和黃度（b*）的測定，使用前對儀器進行校準。參數(shù)光源設置為D65，測定直徑8 mm。4 個處理樣品隨機取3 個點，每組樣品平行測定5 次。

1.3.5 pH值測定

pH值的測定參照楊帆等[19]的方法。稱取5 g絞碎的火腿樣品，加入20 mL蒸餾水，用高速勻漿機勻漿1 min，勻漿結束后，過濾，收集濾液，用pH計立即測定勻漿液的pH值。

1.3.6 菌落總數(shù)的測定

菌落總數(shù)測定參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》的方法進行。

1.3.7 生物胺含量測定

生物胺含量的測定參照Alberto等[20]的方法，并稍作修改。

標準溶液的配制：將8 種生物胺的標準品制成1 mg/mL儲備液備用。使用0.4 mol/L高氯酸溶液將以上標準品儲備液配成終質量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50 μg/mL的混合標準溶液。鋁箔避光，-20 ℃冰箱保存。8 種生物胺標準品的標準曲線以溶液的質量濃度為縱坐標，以各標準溶液生物胺和內標的峰面積比為橫坐標繪制。

樣品處理：將20 mL高氯酸溶液（0.4 mol/L）加入到5 g絞碎肉樣中，冰上勻漿，4 ℃離心（5 000 r/min、10 min）后收集上清液，沉淀重復提取一次。將兩次提取的上清液用0.4 mol/L高氯酸溶液定容到50 mL。

標準溶液和樣品的衍生化：分別取1 mL的混合標準溶液和樣液，加入200 μL NaOH溶液（2 mol/L）使之呈堿性，加入300 μL飽和NaHCO3溶液進行緩沖，然后加入2 mL的丹磺酰氯溶液（10 mg/mL，溶劑為色譜級丙酮，現(xiàn)配現(xiàn)用），于40 ℃水浴中暗反應處理30 min后加入100 μL氨水終止反應，去除殘留的丹磺酰氯溶液。最后用乙腈定容至5 mL，0.22 μm有機濾膜過濾，然后進行高效液相色譜分析。

色譜條件：ZORBAX XDB-C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫：40 ℃，流速：1.0 mL/min，進樣體積：20 μL，紫外檢測波長：254 nm，流動相：水（A相）、乙腈（B相）和0.1 mol/L乙酸銨（C相）。洗脫程序見表1。

表1 高效液相色譜儀分析生物胺的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for high performance liquid chromatography analysis of biogenic amines

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SAS 8.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗重復3 次，結果取平均值，采用One-way ANOVA（Duncan’s Multiple Range Test模型）進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同涂層處理對火腿水分質量分數(shù)的影響

圖1 不同涂層處理對金華火腿水分質量分數(shù)的影響Fig. 1 Effects of different coating treatments on moisture content of Jinhua ham

由圖1可知，貯存4 個月后，對照組以及BC、LBPEOC和HBPEOC涂層組的水分質量分數(shù)分別為33.88%、35.66%、37.48%和39.36%。相比于對照組，涂層處理顯著提高了產(chǎn)品的水分質量分數(shù)（P＜0.05），精油復合涂層組保水效果更好一些，且保水性改善效果取決于精油使用量。結果表明，涂抹處理顯著降低了火腿樣品水分流失。

傳統(tǒng)金華火腿質構較硬，使得消費者的可接受程度大大降低[4]，因此，貯藏期間鎖住火腿的水分十分重要。動植物油具有良好的阻水特性，通常添加到多糖等可食性膜中，可提高膜的抗水性，減少食物水分流失；同時具有較好的機械性能和屏障作用[21]；BPEO涂抹液是一類黏稠的油狀液體，能阻隔火腿表面的水分過度揮發(fā)，提高樣品的持水性。Menon[22]、Zengin[23]和李文茹[24]等報道，BPEO主要化合物是萜類化合物，其多為有特殊氣味的疏水性物質，具有一定的阻水性。各涂層組火腿水分質量分數(shù)從小到大為BC組＜LBPEOC組＜HBPEOC組，可能是因為BPEO具有更強的抗氧化能力，使得大部分蛋白質水解程度降低，細胞的完整性遭到較少的破壞。然而對于對照組，肌纖維收縮，擠壓內部細胞，從而進一步加速胞內物質的流出，導致水分質量分數(shù)降低[25]。

2.2 不同涂層處理對火腿色澤的影響

表2 不同涂層處理對金華火腿色澤的影響Table 2 Effects of different coating treatments on color of Jinhua ham

色澤是衡量肉類食品非常重要的食用品質參考指標，直接從視覺上決定了肉制品的感官品質。色澤測定結果如表2所示。相比對照組和BC組，LBPEOC和HBPEOC組的亮度（L*值）和紅度（a*值）顯著升高（P＜0.05），而黃度（b*值）顯著降低（P＜0.05）。說明與對照和BC處理相比，BPEO復合涂層處理提高了金華火腿的亮度和紅度，降低了黃度。肉制品的色澤直接影響著消費者的感官感受，金華火腿中主要色素為亞硝基肌紅蛋白，該蛋白賦予干腌火腿鮮艷的玫瑰紅色[26]。隨著貯藏時間的延長和自由基生成，亞硝基肌紅蛋白容易轉化為高鐵肌紅蛋白[27]，一些還原性物質，如異抗壞血酸鈉可以起到穩(wěn)定亞硝基肌紅蛋白的作用。此外，干腌肉制品貯藏過程中的脂質氧化會導致黃度升高[26]。BPEO由于富含萜類化合物，具有較強的抗氧化作用，BPEO復合涂層處理可以在一定程度上穩(wěn)定亞硝基肌紅蛋白。郭莎莎等[27]發(fā)現(xiàn)將4 種抗氧化劑添加在火腿中，能顯著提高亞硝基肌紅蛋白穩(wěn)定性和抑制脂質氧化，使得火腿產(chǎn)品的紅度升高。Zhang Jing等[15]研究結果表明，使用BPEO降低了高鐵肌紅蛋白的含量，使得豬肉的整體亮度穩(wěn)定提升。BPEO復合涂層處理顯著降低了火腿的黃度，可能歸因于精油中萜類化合物可以有效減緩脂質氧化[26]。戴照琪等[6]研究結果表明，復合精油涂層對火腿半膜肌的脂質氧化有較好的抑制作用。

2.3 不同涂層處理對火腿pH值的影響

圖2 不同涂層處理對金華火腿pH值的影響Fig. 2 Effects of different coating treatments on pH of Jinhua ham

pH值與肉制品的保水性有關，肉制品pH值越偏離于肌原纖維蛋白的等點電，其保水性越好。由圖2可知，貯存4 個月后，與對照組相比，BC組和BPEO復合涂層組的pH值均升高，且HBPEOC組的pH值顯著升高（P＜0.05）。可能是由于萜類化合物能夠降低微生物膜電位，破壞其膜結構完整性[24,28-30]，特別是對于革蘭氏陽性細菌有較強的抑制作用[31]。乳酸菌廣泛存在于肉制品中，是一類典型的革蘭氏陽性細菌，其厭氧發(fā)酵在一定程度上受到了BPEO組高劑量復合涂層處理的抑制。Fan Wenjiao等[32]研究了殼聚糖涂層對冷藏期間鯉魚品質和保質期的影響，發(fā)現(xiàn)pH值的增加與在內源或微生物酶的作用下蛋白質、氨基酸等含氮物質被分解有關?？傊?，BPEO復合涂層處理金華火腿，能夠在火腿表面形成一層疏水性膜，抑制產(chǎn)品水分損失，同時也一定程度抑制了乳酸菌等微生物的發(fā)酵，從而使得pH值升高。

2.4 不同涂層處理對火腿菌落總數(shù)的影響

圖3 不同涂層處理對金華火腿菌落總數(shù)的影響Fig. 3 Effects of different coating treatments on aerobic plate count in Jinhua ham

菌落總數(shù)常作為一項重要指標，用于評價肉制品的安全性[33]。由圖3可知，與對照組和BC組相比，兩個精油復合涂層處理能夠顯著降低火腿的菌落總數(shù)（P＜0.05），主要由于BPEO的疏水性使其在微生物的細胞膜和線粒體的脂質中分配，增加了微生物細胞膜通透性，使得細胞內容物滲漏，從而有效使微生物致死[15,34]；另一方面由于面粉、β-環(huán)糊精和動植物油等載體可能有一定吸附BPEO的能力，起到緩慢釋放的效果，從而達到長效抑菌作用。對照組的菌落總數(shù)在4 組中最高。因此，涂層對火腿中微生物數(shù)量有一定的抑制作用，高劑量精油復合涂層組的抑菌效果最好。

2.5 不同涂層處理對生物胺含量的影響

圖4 生物胺混合標準品色譜圖Fig. 4 Chromatographic profiles of standard solution of biogenic amines

本實驗使用高效液相色譜儀測定了8 種生物胺的含量。8 種生物胺標準品的峰面積與其質量濃度呈良好的線性關系，R2均大于0.99。圖4為8 種生物胺標準品的高效液相色譜圖。在5 min內可以洗脫出全部溶劑峰和雜質峰，30 min內可以洗脫并有效分離全部生物胺標準品。因此該方法能較好地分析各生物胺的含量。對照單標色譜圖以及保留時間可以確定8 種生物胺的出峰順序。

表3 不同涂層處理對金華火腿生物胺含量的影響Table 3 Effects of different coating treatments on biogenic amine contents of Jinhua ham

不同涂層處理的金華火腿貯存4 個月后生物胺的含量如表3所示。對照組的總生物胺含顯著高于其他在4 個涂層處理組。在BPEO復合涂層處理組中，與對照組相比，苯乙胺、腐胺和尸胺的含量顯著降低，未檢測到色胺，且酪胺僅在高劑量組中未檢測到。在所有生物胺中，組胺的毒性最強，是發(fā)酵肉類產(chǎn)品中重要的生物胺，對人類健康具有很大的威脅[35]。在對照組中，組胺所占總生物胺的比例最低，涂層處理的火腿中均未檢測到組胺。精胺和亞精胺是存在于新鮮豬肉中的天然生物胺[36]。與對照相比，BPEO復合涂層處理能顯著降低精胺和亞精胺的含量。綜上所述，涂層處理對火腿中的生物胺產(chǎn)生具有較強的抑制作用，BPEO復合涂層組能起到很好的抑制效果，提高產(chǎn)品的安全性。

生物胺的產(chǎn)生歸因于存活的微生物和由微生物產(chǎn)生的脫羧酶的殘余活性[37]。在發(fā)酵肉制品中有生物胺產(chǎn)生能力的微生物主要有：乳桿菌屬、腸桿菌科、假單胞菌屬和腸球菌[38]。與對照組和BC組相比，BPEO復合涂層處理能使得火腿中的菌落總數(shù)顯著下降。Zhang Xin等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在新鮮香腸的貯存期間，肉桂精油可以降低微生物的數(shù)量防止生物胺的形成。此外，BPEO的抑菌作用也可能通過抑制氨基酸脫羧酶的活性進一步阻止生物胺的形成。Zhang Xin等[11]研究發(fā)現(xiàn)BPEO能顯著抑制大腸桿菌的繁殖，并進一步抑制賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶活性，從而抑制尸胺和腐胺的生成，使總生物胺水平顯著下降。高鹽食品中的氯化鈉含量高，可以提高精油的效果，增加細菌細胞的滲透性，降低脫羧酶的活性[39]。金華火腿13%的含鹽量一定程度上也能抑制微生物的生長，降低脫羧酶的活性，從而抑制生物胺的生成。朱志遠等[40]的研究結果表明使用高鹽量腌制對生物胺的產(chǎn)生有抑制作用。

3 結 論

本研究結果表明，BPEO復合涂層處理金華火腿，能通過在火腿表面形成一層疏水性膜并提高pH值，抑制產(chǎn)品水分損失；通過抑制色素、脂質氧化，改善了產(chǎn)品色澤；通過抑制微生物繁殖，極大程度上降低了生物胺帶來的安全風險。因此，BPEO復合涂層處理是一種有效的金華火腿貯藏方法。