劉艷萍 朱中原 劉濤陽(yáng)

摘 要 胡楊種子在自然狀態(tài)下極易失活，因此建立適合胡楊種子的保存方法十分必要。而超低溫可以實(shí)現(xiàn)種子的長(zhǎng)期保存?；诖?，用硅膠對(duì)胡楊種子進(jìn)行脫水處理，使種子的含水量形成不同梯度，再對(duì)不同含水量的種子進(jìn)行超低溫保存，然后對(duì)保存后的種子進(jìn)行化凍處理，確定種子的存活率，測(cè)定種子的各種生理生化指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，含水量是影響胡楊種子存活的重要因素，含水量為4.30%時(shí)胡楊種子的發(fā)芽率較高。影響胡楊種子的另外一個(gè)重要因素是化凍方法，采用快速化凍方法胡楊種子具有較高的存活率，且各種酶活性及種子的電導(dǎo)率、丙二醛含量都較低。對(duì)含水量為4.30%的胡楊種子進(jìn)行超低溫保存后，快速化凍對(duì)胡楊種子傷害較小，且對(duì)各種生理生化指標(biāo)影響較小，適合胡楊種子超低溫保存。

關(guān)鍵詞 胡楊種子;超低溫保存;種子活力;生理指標(biāo)

中圖分類號(hào)：S792.11 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.14.071

胡楊屬楊柳科落葉喬木，主要分布在中亞、西亞和地中海地區(qū)，在我國(guó)荒漠區(qū)有大面積天然分布，是生長(zhǎng)于極端干旱荒漠區(qū)的唯一優(yōu)勢(shì)成林樹(shù)種，但由于自然和人為因素的影響，胡楊面臨瀕危，并被列為我國(guó)三級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物。胡楊種子成熟后在自然狀態(tài)下生命力在30 d

內(nèi)就幾乎完全喪失，且種子萌發(fā)成苗過(guò)程中會(huì)遭受氣候、地下水位、土壤含水量和土壤鹽漬化等外界環(huán)境因素的干擾。如何讓胡楊種子在逆境脅迫下仍然保持活力，引起了學(xué)者的關(guān)注。張琴等[1]采用室溫未密封、室溫密封、4 ℃密封三種方式貯藏胡楊種子，測(cè)定種子劣變過(guò)程中的活力變化指標(biāo)，結(jié)果表明，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，種子含水量、發(fā)芽率、活力指數(shù)逐漸下降，活力下降速度為室溫未密封﹥室溫密封﹥4 ℃密封，三種貯藏方式中，以4 ℃密封貯藏方式效果最好，種子活力最高。張肖等[2]研究了胡楊種子萌發(fā)對(duì)溫度、光照和鹽旱脅迫的敏感性，結(jié)果表明，胡楊種子萌發(fā)對(duì)溫度、光照不敏感，適宜溫度下萌發(fā)快速集中，且萌發(fā)時(shí)對(duì)鹽旱脅迫具有一定的耐性。王海珍等[3]研究了胡楊和灰胡楊種子對(duì)不同鹽類的耐受限度和適應(yīng)萌發(fā)生境，結(jié)果表明兩種胡楊均具有較強(qiáng)的耐鹽性。伊麗米努爾等[4]研究表明，低濃度鹽對(duì)胡楊種子萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用，而高鹽濃度下，種子萌發(fā)受到明顯抑制。劉艷萍等[5]采用硅膠脫水的方法制備不同含水量的胡楊種子，再經(jīng)不同相對(duì)濕度溶液對(duì)種子進(jìn)行回濕處理，確定了最適含水量及最適回濕方法。張玲等[6]采用包埋玻璃化液氮冷凍法對(duì)胡楊休眠莖尖進(jìn)行冷凍保存，總結(jié)出包埋玻璃化法在液氮中保存胡楊的深冬休眠芽是可行的。目前，超低溫保存是實(shí)現(xiàn)生物種質(zhì)資源永久保存的理想方法，被廣泛應(yīng)用，已成功保存了近300種植物材料[7-8]。國(guó)內(nèi)外超低溫保存實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用主要集中在農(nóng)作物和蔬菜上，目前也已成功對(duì)部分種子、花粉、莖段、懸浮細(xì)胞等組織培養(yǎng)物進(jìn)行了保存試驗(yàn)[9-11]。

大多數(shù)植物材料在超低溫環(huán)境中細(xì)胞的新陳代謝活動(dòng)會(huì)基本停止，從而使細(xì)胞活力能夠得到穩(wěn)定保存[12]。為了探尋胡楊種子長(zhǎng)期低成本保存的新方法，本研究以胡楊種子為材料，對(duì)其進(jìn)行超低溫保存后種子的萌發(fā)特性、膜脂過(guò)氧化以及抗氧化保護(hù)系統(tǒng)研究。通過(guò)對(duì)不同含水量的胡楊種子進(jìn)行保存，確定適合的胡楊種子超低溫保存含水量，并對(duì)保存后的種子進(jìn)行化凍處理，測(cè)定超低溫保存后的各種生理生化指標(biāo)，篩選出適合胡楊種子超低溫保存的化凍方法，探究適合胡楊種子超低溫保存的方法，為胡楊資源的永續(xù)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料的采集

于2018年8月在新疆阿拉爾市塔里木大學(xué)周邊采集胡楊種子，自然晾干后，用紗網(wǎng)手工揉捏、過(guò)篩，剔除雜質(zhì)，得到所需的種子，保存到4 ℃冰箱里備用。

經(jīng)測(cè)定，所得胡楊種子初始含水量6.06%，發(fā)芽率為46.7%。

1.2 硅膠干燥法對(duì)胡楊種子的干燥處理

稱取15組胡楊種子，每組7 g，采用硅膠干燥法干燥種子。將稱取好的種子和變色硅膠置于同一干燥器中對(duì)胡楊種子進(jìn)行干燥，變色硅膠和種子質(zhì)量比為5∶1，干燥時(shí)間分別為1 d、2 d、3 d、4 d、5 d。干燥后按時(shí)取出種子，將不同含水量的種子密封放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 不同化凍方法對(duì)胡楊種子的處理

將不同含水量的種子置于液氮中冷凍24 h后，采用兩種不同化凍辦法對(duì)種子進(jìn)行化凍處理，分為兩組：第一組取出后置于25 ℃溫水中快速化凍15 min后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?第二組先置于-10 ℃冰箱化凍10 min后置于4 ℃冰箱繼續(xù)化凍后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 種子含水量測(cè)定

采用分析天平隨機(jī)稱取1 g鮮種子于玻璃皿中，轉(zhuǎn)入恒溫烘箱并調(diào)節(jié)溫度至121 ℃烘干17 h，冷卻至室溫后用分析天平稱取干重，計(jì)算種子含水量（重復(fù)三次），測(cè)出種子初含水量為6.06%。計(jì)算公式如下。

1.5 發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)測(cè)定

在培養(yǎng)皿內(nèi)墊紙4層，用蒸餾水潤(rùn)濕芽床均勻放置30粒種子，移入人工氣候培養(yǎng)箱，調(diào)節(jié)溫度至24 ℃左右，設(shè)置光照15 h;溫度15 ℃左右，黑暗9 h。分別記錄第2天、第3天、第4天的種子發(fā)芽數(shù)。計(jì)算種子發(fā)芽率以及發(fā)芽指數(shù)，發(fā)芽率計(jì)算公式見(jiàn)公式（1），發(fā)芽指數(shù)計(jì)算公式見(jiàn)公式（2）。

公式（2）中GI為種子發(fā)芽指數(shù)，Gt為當(dāng)天種子發(fā)芽數(shù)，Dt為種子發(fā)芽天數(shù)。

1.6 相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定

電導(dǎo)率的測(cè)定：隨機(jī)稱取1 g胡楊種子，放于燒杯中，倒入50 mL去離子水，用玻璃棒攪拌充分后，在25 ℃條件下靜置1 d，次日再次用玻璃棒攪拌均勻后用電導(dǎo)儀測(cè)其浸出液，測(cè)出單位質(zhì)量電導(dǎo)率。

超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定采用鄰苯三酚自養(yǎng)化法，具體方法參照何樂(lè)韻等[13]的研究方法，本次稍有改動(dòng)。

過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定采用高錳酸鉀滴定法，丙二醛含量（MDA）測(cè)定采用硫代巴比妥酸法。可參照劉艷萍等[5]的測(cè)定方法，本次稍有改動(dòng)。

各項(xiàng)指標(biāo)均設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)測(cè)定3次，求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件DPS和Excel處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)胡楊種子活力的影響

2.1.1 超低溫保存對(duì)種子活力的影響

由表1可知，未冷凍處理的種子發(fā)芽率受種子含水量影響，隨著含水量的降低，種子發(fā)芽率逐漸降低。經(jīng)液氮超低溫處理后并采用快速化凍方法化凍處理，隨著種子含水量的降低，種子發(fā)芽率先升高后降低，當(dāng)種子含水量在4.30%時(shí)，冷凍組種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)與對(duì)照組差異不顯著，但均高于對(duì)照組。因此胡楊種子超低溫保存的臨界含水量為4.30%時(shí)對(duì)種子萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用。

2.1.2 不同化凍方法對(duì)種子活力的影響

由表2可知，對(duì)比采用兩種不同化凍方法對(duì)胡楊種子進(jìn)行化凍處理，其中采用快速化凍方法對(duì)胡楊種子進(jìn)行化凍，種子整體活力水平均高于采用慢速化凍胡楊種子的活力，說(shuō)明采用快速化凍比慢速化凍對(duì)種子造成的傷害小。兩種不同化凍方法處理的胡楊種子，隨著含水量的降低，胡楊種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(shì)，并且在種子含水量為4.30%時(shí)種子活力最高。

2.2 不同處理對(duì)胡楊種子膜脂過(guò)氧化的影響

2.2.1丙二醛（MDA）含量

丙二醛（MDA）是膜脂過(guò)氧化作用最終分解產(chǎn)物，會(huì)抑制細(xì)胞保護(hù)酶的活性，降低抗氧化物含量，可以用來(lái)反映膜脂的過(guò)氧化程度[14-16]。圖1顯示種子經(jīng)過(guò)液氮超低溫處理后，不論采用何種化凍方式，含水量為4.30%時(shí)，種子中丙二醛含量均較低，其他含水量種子MDA含量均有明顯升高，說(shuō)明在超低溫保存過(guò)程中對(duì)種子造成了一定傷害，選擇合適含水量對(duì)胡楊種子進(jìn)行超低溫保存是有必要的[5]。

2.2.2 胡楊種子電導(dǎo)率的變化

由圖2可知，經(jīng)過(guò)超低溫處理，且采用快速化凍方法化凍的胡楊種子整體水平電導(dǎo)率明顯低于慢速化凍，并且當(dāng)胡楊種子含水量在3.66%～5.02%，采用快速化凍種子電導(dǎo)率與對(duì)照組電導(dǎo)率相近，且當(dāng)種子含水量在4.30%時(shí)，其電導(dǎo)率達(dá)到最低。因此，采用快速化凍方法對(duì)種子進(jìn)行化凍，且含水量應(yīng)控制在4.30%時(shí)，對(duì)種子的傷害程度較小。

2.3 不同處理對(duì)胡楊種子抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的影響

2.3.1 過(guò)氧化物酶（POD）活性

如圖3所示，隨著種子含水量的降低，采用慢速化凍的種子POD活性上升幅度比采用慢速化凍明顯且在含水量4.30%時(shí)達(dá)到峰值，接近未處理的種子活性，當(dāng)含水量低于4.30%時(shí)采用慢速化凍的種子POD活性下降程度很大。相對(duì)而言，采用快速化凍方法對(duì)種子進(jìn)行化凍，對(duì)種子POD活性影響不大。

2.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性

超氧化物歧化酶（SOD）可以催化超氧化物歧化反應(yīng)[17]，是活性氧清除體系中第一個(gè)發(fā)揮作用的抗氧化酶。植物在低溫寒冷等逆境脅迫下會(huì)產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞有害的活性氧和自由基，SOD通過(guò)催化歧化反應(yīng)使活性氧生成過(guò)氧化氫和氫氣，減輕細(xì)胞活性氧傷害。由圖4可知，經(jīng)超低溫處理后無(wú)論采用何種化凍方式，不同含水量的胡楊種子超氧化物歧化酶活性均有所下降，說(shuō)明超低溫冷凍處理對(duì)種子具有一定的傷害。相對(duì)而言，采用快速化凍方法對(duì)種子進(jìn)行化凍比慢速化凍傷害小。不同含水量種子的超氧化物歧化酶活性也不同，在含水量4.30%時(shí)其活性最高。

2.3.3 過(guò)氧化氫酶（CAT）活性

過(guò)氧化氫酶（CAT）是植物體內(nèi)與抗性相關(guān)的酶，不僅可以保護(hù)生物膜，還可以促進(jìn)種子代謝，增加種子的抗逆性。采用快速化凍的種子和慢速化凍種子CAT活性均隨含水量的降低呈先上升后下降的趨勢(shì)，但采用快速化凍的種子CAT活性始終高于慢速化凍（圖5）。因此，采用快速化凍的方法對(duì)種子進(jìn)行化凍優(yōu)于慢速化凍。

3 結(jié)論與討論

超低溫冷凍過(guò)程中，種子的含水量是影響其生命力的一個(gè)關(guān)鍵因素。理論上講，含水量過(guò)高會(huì)使種子在冷凍和解凍過(guò)程中受到傷害甚至死亡，過(guò)低又會(huì)造成脫水傷害影響其活力[17]。種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)是反映種子活力的綜合指標(biāo)，未冷凍處理的種子發(fā)芽率受種子含水量影響，隨著含水量的降低種子發(fā)芽率逐漸降低。經(jīng)超低溫處理后并采用快速化凍方法化凍，隨含水量降低，種子發(fā)芽率先升高后降低，在快速化凍種子含水量達(dá)到4.30%時(shí)，其發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均高于對(duì)照組，且采用快速化凍方法對(duì)胡楊種子進(jìn)行化凍其活力整體水平均高于采用慢速化凍后胡楊種子的活力。說(shuō)明超低溫保存對(duì)胡楊種子萌發(fā)有促進(jìn)作用，且胡楊種子超低溫保存的臨界含水量為4.30%。同時(shí)，快速化凍方法對(duì)胡楊種子進(jìn)行化凍減少了對(duì)種子的傷害，可使種子保持較好的活力。

植物在逆境或衰老過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)自由基代謝的平衡被破壞，有利于自由基產(chǎn)生，自由基過(guò)剩會(huì)引發(fā)或加劇膜脂過(guò)氧化，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷，導(dǎo)致細(xì)胞膜透性增大，同時(shí)使膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物MDA含量增加，而MDA是膜脂過(guò)氧化作用的最終產(chǎn)物，是膜系統(tǒng)受傷害的重要標(biāo)志[18]。當(dāng)細(xì)胞原生質(zhì)膜受到破壞時(shí)，膜透性就會(huì)增加，細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)外滲，導(dǎo)致相對(duì)電導(dǎo)率增加，相對(duì)電導(dǎo)率反映了外滲程度和膜受損傷的程度[19]。本研究中，對(duì)胡楊種子進(jìn)行超低溫處理，采用快速化凍方法化凍胡楊種子，當(dāng)種子含水量在4.30%時(shí)，對(duì)胡楊種子的傷害最小，說(shuō)明在超低溫保存過(guò)程中對(duì)種子造成了一定的傷害，當(dāng)含水量降至4.30%時(shí)，MDA含量與對(duì)照組無(wú)差異，說(shuō)明適宜的含水量可以緩解低溫處理對(duì)細(xì)胞膜的傷害。

過(guò)氧化物酶（POD）是植物種子重要的保護(hù)酶，為植物細(xì)胞提供高效專一的活性氧清除體系，其活性與植物種子的超低溫耐性相關(guān)[20]。植物在低溫寒冷等逆境脅迫下會(huì)產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞有害的活性氧和自由基，超氧化物歧化酶（SOD）通過(guò)催化歧化反應(yīng)使活性氧生成過(guò)氧化氫和氫氣，減輕細(xì)胞活性氧傷害。過(guò)氧化氫酶（CAT）是植物體內(nèi)與抗性相關(guān)的酶類，不僅可以保護(hù)生物膜，還可以促進(jìn)種子代謝，從而增加種子的抗逆性。

比較慢速化凍和快速化凍兩種方法化凍后胡楊種子的抗氧化保護(hù)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，快速化凍的種子POD、SOD、CAT活性指標(biāo)均高于慢速化凍的種子的相應(yīng)指標(biāo)，說(shuō)明快速化凍的種子這幾種酶組成了完整的防氧鏈條，能夠降低細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，保持細(xì)胞膜的完整性，減緩低溫對(duì)植物種子的傷害，促進(jìn)種子在低溫脅迫后萌發(fā)。環(huán)境脅迫破壞了植物體自由基的產(chǎn)生和清除之間的平衡，會(huì)導(dǎo)致自由基在植物體內(nèi)積累，造成膜脂過(guò)氧化作用，對(duì)植物造成損傷[21- 22]，因此采用慢速化凍的方法，對(duì)胡楊種子細(xì)胞膜造成損傷較重，這與宋紅[23]超低溫保存玉蟬花（Iris ensata）種子生理生化研究結(jié)果一致。

綜上，胡楊種子不僅要在合適含水量范圍內(nèi)，還要采用合適的化凍方法對(duì)超低溫冷凍處理后的種子進(jìn)行化凍，才能有效減少超低溫保存過(guò)程中對(duì)種子造成的傷害。超低溫保存后，快速化凍對(duì)胡楊種子傷害較小，適度降低胡楊種子含水量可以提高超低溫保存后種子的發(fā)芽率，最適含水量為4.30%。

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（責(zé)任編輯：趙中正）