邵敏敏 毛 毛 梁 韜

茵陳草（Artemisia dracunculus L.）為菊科多年生叢生型芳香草本植物，別名白蒿，性微寒、味苦辛，具有清濕熱、退黃疽，保肝利膽的作用[1]。民間主要用于保肝利膽、肝纖維化的治療[2]。但其對抗肝纖維化的作用機制鮮見報道。本研究基于前期的預實驗基礎，采用四氯化碳誘導建立肝纖維化大鼠模型，探究茵陳草水提物對肝纖維化大鼠的保護作用及作用機制。

1 實驗材料

1.1 動 物 SD 大鼠，SPF 級，雌雄各半，體質量（180～220）g，浙江大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證∶SYXK（浙）2018-0016，實驗動物生產許可證∶SCXK（浙）2018-0006。大鼠飼養(yǎng)于通風良好的環(huán)境，室溫18～25℃，相對濕度40%～70%，12h 光照晝夜循環(huán)。實驗開始前大鼠進行適應性喂養(yǎng)1 周。

1.2 藥 物 茵陳草水提物制備∶茵陳草4kg 干燥粗粉，加入40L 蒸餾水90℃下加熱回流提取2h，紗布過濾，濾渣繼續(xù)加入40L 蒸餾水90℃下加熱回流提取2h，連續(xù)水煮3 次，紗布過濾后，將每次的濾液合并，然后采用微波真空干燥器濃縮至2L 濃縮液，茵陳草水提物的濃度（含生藥量）∶2g/mL。

1.3 試 劑 四氯化碳（分析純）∶成都市科隆化工試劑廠，批號20 170926；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）試劑盒，批號20190517、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑盒，批號20190606，南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒，批號190718，白介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒，批號190525，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；水飛薊素膠囊∶德國馬博士大藥廠，批號B180156。透明質酸（HA）試劑盒，批號 190324；III 型前膠原（PCIII）試劑盒，批號 190314；層粘連蛋白（LN）試劑盒，批號 190405；IV 型膠原（IV-C）試劑盒，批號190329，均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 主要儀器 9602A-酶標儀（北京艾普生設備有限公司）；UVmini-1240 型紫外-可見分光光度（島津國際貿易上海有限公司）；TGL-16G 高速臺式冷凍離心機（杭州匯爾儀器設備有限公司）。

2 實驗方法

2.1 大鼠肝纖維化模型建立[3]將70 只SD 大鼠隨機抽取10 只為正常組。其余大鼠腹腔注射四氯化碳與花生油混合溶液（1:1）1mL/kg，每周注射2 次，連續(xù)注射8 周。末次注射1 天后，抽取10 只大鼠，對其肝臟進行Masson 染色，觀察其病理學變化，確認大鼠肝纖維化造模成功。

2.2 分組及給藥 使用隨機數(shù)字表法隨機將50 只肝纖維化模型大鼠分為模型組、陽性藥水飛薊素40mg/kg 組[4-5]、茵陳草水提物2.5、5、10g/kg 劑量組，每組10 只。灌胃給藥，每天1 次，連續(xù)給藥56 天。模型組、正常組大鼠每天灌胃等體積生理鹽水。

2.3 HE 染色方法 石蠟切片（厚度3μm）在二甲苯中脫蠟10min，移入二甲苯與純酒精（1:1）的混合液中5min，用酒精按常規(guī)逐級脫水，蘇木精染液染色10min，水洗玻片上多余的染液，0.5%鹽酸酒精分色，蒸餾流水沖洗15min 后蒸餾水短洗，0.5%伊紅染液染色5min，酒精常規(guī)逐級脫水，二甲苯透明，封片。

2.4 Masson 染色法 石蠟切片在二甲苯中脫蠟10min，移入二甲苯與純酒精（1:1）的混合液中5min，用酒精按常規(guī)逐級脫水，蘇木精染液染色10min，水洗玻片上多余的染液，0.5%鹽酸酒精分色，蒸餾流水沖洗15min 后蒸餾水短洗，用Masson 麗春紅酸性復紅液10min，以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷鎢酸水溶液分化5min，不經水洗,直接用苯胺藍液染5min。以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。95%酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封固。

2.5 指標檢測 末次給藥4h 后，3%苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，腹主動脈取血，離心提取血清。剝離肝臟，切取部分放置于10%福爾馬林溶液固定，包埋切片，HE 染色及Masson 染色觀察大鼠肝臟的病理學變化和纖維化程度。比色法檢測大鼠血清AST、ALT 含量，ELISA 法檢測TNF-α、IL-1β 表達量。比色法檢測肝臟透明質酸（HA），III 型前膠原（PCIII），層粘連蛋白（LN）、IV 型膠原（IV-C）含量。

2.6 肝臟纖維化程度分級 根據(jù)全國肝病會議（西安）通過的標準[6]，將肝臟纖維化病變程度分為5 個級別∶S0∶無肝臟纖維化病變；S1∶肝臟匯管區(qū)纖維化擴大，限局竇周及小葉內纖維化；S2∶肝臟匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結構保留；S3∶肝臟纖維間隔伴小葉結構紊亂，無肝硬化；S4∶出現(xiàn)早期肝硬化。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠肝組織病理學變化和纖維化程度 HE染色以及Masson 染色結果顯示，正常組大鼠肝小葉結構正常，匯管區(qū)血管壁清晰，未見有膠原纖維。模型組大鼠肝細胞排列紊亂，有明顯壞死及大量膠原纖維出現(xiàn)。水飛薊素、茵陳草水提物各劑量組肝細胞排列相對有序，細胞結構和形態(tài)有所恢復，膠原纖維均有所減少。見插頁圖1-2。

3.2 各組大鼠肝組織纖維化程度比較 各組大鼠肝組織病理分級比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

3.3 各組大鼠血清ALT、AST 水平比較 與正常組比較，模型組大鼠血清ALT、AST 水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，水飛薊素、茵陳草水提物各劑量組血清ALT、AST 水平降低（P 均＜0.05）。見表2。

表1 各組大鼠肝組織纖維化程度比較（例）

表2 各組大鼠血清ALT、AST 水平比較（U/mL，）

表2 各組大鼠血清ALT、AST 水平比較（U/mL，）

注∶正常組為健康大鼠，予生理鹽水；模型組為肝纖維化模型大鼠，予生理鹽水；水飛薊素組為肝纖維化模型大鼠予40mg/kg 水飛薊素混懸液；茵陳草水提物高劑量組為肝纖維化模型大鼠予10g/kg 茵陳草水提物混懸液；茵陳草水提物中劑量組為肝纖維化模型大鼠予5g/kg茵陳草水提物混懸液；茵陳草水提物低劑量組為肝纖維化模型大鼠予2.5g/kg 茵陳草水提物混懸液；ALT 為丙氨酸氨基轉移酶；ALT 為天門冬氨酸氨基轉移酶；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與水飛薊素組比較，cP＜0.05；與茵陳草水提物高劑量組比較，dP＜0.05

3.4 各組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β 表達量比較與正常組比較，模型組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β 含量顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，水飛薊素、茵陳草水提物各劑量組肝組織TNF-α、IL-1β 含量下降（P 均＜0.05）。見表3。

3.5 各組大鼠肝組織HA、PCIII、LN、IV-C 水平比較與正常組比較，模型組大鼠肝組織HA、PCIII、LN、IV-C 含量顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，水飛薊素、茵陳草水提物各劑量組肝組織HA、PCIII、LN、IV-C 含量下降（P 均＜0.05）。見表4。

4 討論

肝纖維化是各種致病因子造成肝臟受損后，肝組織在修復過程中代償反應而形成肝內纖維結締組織異常增生的病理生理過程，是各種慢性肝病向肝硬化、肝功能衰竭等肝臟疾病發(fā)展所共有的病理變化和必經之路[7]。ALT、AST 是衡量肝臟代謝功能重要的酶，當肝臟出現(xiàn)受損、壞死時，ALT、AST 會從肝細胞內溢出而進入到血液中，致血液中ALT、AST 含量升高[8]。本研究結果表明，茵陳草水提物干預后大鼠血清ALT、AST 的含量明顯下降，提示大鼠的肝臟代謝功能有所恢復。HE 染色結果表明，茵陳草水提物干預后肝臟炎癥細胞浸潤減少，細胞結構和形態(tài)較完整，排列相對整齊。這與大鼠肝臟代謝功能有所恢復的結果相一致。

表3 各組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β 表達量比較（pg/mL，）

表3 各組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β 表達量比較（pg/mL，）

注∶正常組為健康大鼠，予生理鹽水；模型組為肝纖維化模型大鼠，予生理鹽水；水飛薊素組為肝纖維化模型大鼠予40mg/kg 水飛薊素混懸液；茵陳草水提物高劑量組為肝纖維化模型大鼠予10g/kg 茵陳草水提物混懸液；茵陳草水提物中劑量組為肝纖維化模型大鼠予5g/kg茵陳草水提物混懸液；茵陳草水提物低劑量組為肝纖維化模型大鼠予2.5g/kg 茵陳草水提物混懸液；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-1β為白介素-1β；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與水飛薊素組比較，cP＜0.05；與茵陳草水提物高劑量組比較，dP＜0.05

肝損傷是肝纖維化發(fā)生的始動因素，而肝纖維化是肝炎發(fā)展為肝硬化的中心環(huán)節(jié)[9]。受損的肝細胞通常會釋放多種炎癥因子，肝星狀細胞受炎癥因子刺激后釋放大量的細胞外基質（ECM），導致大量膠原因子活化及沉積，造成肝纖維化形成[10]。ECM 在肝臟中的平衡與降解是一個動態(tài)的過程，這一過程對肝纖維化的形成起著關鍵的作用，而對肝纖維化指標的檢測可直觀的體現(xiàn)這一動態(tài)過程[11]。HA、LN 的活化為肝星狀細胞受炎癥因子刺激后而大量形成，其生產的速度遠大于機體對HA 的清除速度時，造成HA、LN 在肝臟中的堆積[12-13]。PCIII、IV-C 含量與肝纖維化程度密切相關，能夠反映其合成狀況，也是炎癥活動性指標[14-15]。本研究結果表明，茵陳草水提物干預后大鼠肝組織炎癥因子TNF-α、IL-1β 和膠原因子HA、PCIII、LN、IV-C 含量顯著下降，表明茵陳草水提物可下調肝臟中炎癥因子和膠原因子的含量，這與Masson 染色結果中茵陳草水提物干預組的膠原纖維減少相一致。本研究結果還顯示，隨著茵陳草水提物給藥劑量的加大，TNF-α、IL-1β、HA、PCIII、LN、IV-C 含量下降幅度也隨著增大，表明劑量與各指標的值存在一定的線性關系。

表4 各組大鼠肝組織HA、PCIII、LN、IV-C 水平比較（μg/L，）

表4 各組大鼠肝組織HA、PCIII、LN、IV-C 水平比較（μg/L，）

注∶正常組為健康大鼠，予生理鹽水；模型組為肝纖維化模型大鼠，予生理鹽水；水飛薊素組為肝纖維化模型大鼠予40mg/kg 水飛薊素混懸液；茵陳草水提物高劑量組為肝纖維化模型大鼠予10g/kg 茵陳草水提物混懸液；茵陳草水提物中劑量組為肝纖維化模型大鼠予5g/kg 茵陳草水提物混懸液；茵陳草水提物低劑量組為肝纖維化模型大鼠予2.5g/kg 茵陳草水提物混懸液；HA 為透明質酸；PCIII 為III 型前膠原；LN 為層粘連蛋白；IV-C 為IV 型膠原；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與水飛薊素組比較，cP＜0.05；與茵陳草水提物高劑量組比較，dP＜0.05

總之，茵陳草水提物能使纖維化大鼠肝功能和病理損傷得到明顯的改善，其作用機制可能為通過減少肝纖維化大鼠中膠原因子HA、PCIII、LN、IV-C的含量，減少膠原纖維的形成，同時減少炎癥因子TNF-α、IL-1β 的含量，緩解肝組織炎癥損傷，從而達到對纖維化模型大鼠肝組織纖維化改善作用。