戴如冰 陳 驊 凌書建

燒傷是一種因熱力，如火、熱氣、熱液體等所致的人體組織器官損傷，發(fā)病率居外傷疾病譜第四位，具有非常高的致死率及致殘、致畸率，給家庭和社會(huì)造成危害[1]。皮膚是燒傷最易損傷的組織，根據(jù)組織病變，皮膚創(chuàng)面可分為凝固區(qū)、瘀滯區(qū)和充血區(qū)三個(gè)區(qū)帶[2]，而微血栓形成及局部水腫所致瘀滯區(qū)組織進(jìn)行性壞死將導(dǎo)致創(chuàng)面加深[3]，從而增加治療難度并影響治療預(yù)后。所以改善創(chuàng)面組織微循環(huán)、挽救瘀滯區(qū)組織細(xì)胞，是提高燒傷預(yù)后的關(guān)鍵。既往研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物具有改善局部微循環(huán)的作用[4-5]。芹菜素是天然存在的一種具有多種生物學(xué)活性的黃酮類化合物。本實(shí)驗(yàn)以深I(lǐng)I 度燒傷大鼠模型為研究對(duì)象，研究芹菜素對(duì)大鼠燒傷創(chuàng)面微循環(huán)的影響并探索其可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 180 只無病原微生物級(jí)（SPF 級(jí)）雄性Wistar 大鼠，8 周齡，體質(zhì)量（220～250）g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)∶SCXK（冀）2018-004]；清潔級(jí)環(huán)境分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件∶12h 光照黑暗交替、溫度（25±1）℃、相對(duì)濕度（60±5）%，自由飲水進(jìn)食，1 周后開展實(shí)驗(yàn)。所有大鼠進(jìn)行編碼后按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假燒傷組，模型組，磺胺嘧啶銀軟膏單藥組，磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組（12.5、25、50mg/kg），各30 只。本實(shí)驗(yàn)通過中國人民武裝警察部隊(duì)海警總隊(duì)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，倫理批件號(hào)∶HJLL[K]字2019-026，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照倫理審批通過的方案執(zhí)行。

1.2 藥物與試劑 芹菜素購自陜西慧科植物開發(fā)有限公司（批號(hào)190524，純度≥98%）；磺胺嘧啶銀軟膏購自沈陽紅旗制藥有限公司（規(guī)格∶1%，批號(hào)181225）；乳酸鈉林格注射液購自安徽雙鶴藥業(yè)有限公司（批號(hào)20190426）；兔抗鼠表皮生長因子（EGF）、堿性成纖維細(xì)胞因子（bFGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、β-actin 單克隆抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)201904015、201905027、201905009、20190514）；ECL 超敏化學(xué)發(fā)光液購自美國Thermo Fisher Scientific 公司（批號(hào)EB190217）。

1.3 主要儀器 YLS-5Q 型燙傷儀（天津科技發(fā)展有限公司）；LISCA 型激光多普勒血液灌流成像儀（瑞典Perimed 公司）；Allegra 21R 型低溫離心機(jī)（美國Beckman 公司）；CUT 4050 型旋轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國Leica 公司）；Tetra Systerm 型垂直電泳槽、Power Pac Basic 轉(zhuǎn)膜槽（美國Bio-Rad 公司）；CKX41 型倒置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物制備 磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組，芹菜素給藥劑量分別為12.5、25、50mg/kg，為了保持注射給藥體積一致，均為2mL/kg，將芹菜素配制成濃度為6.25、12.5、25mg/mL 的溶液。

2.2 模型制備與給藥 參照鄭國鈺等[6]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法制備深I(lǐng)I 度燒傷大鼠模型。各組大鼠禁食禁水12h 后，腹腔注射水合氯醛溶液（濃度10%，劑量0.3mL/100g）實(shí)施麻醉，剃除背部毛發(fā)后用8%的Na2S 溶液脫毛，溫水沖洗并用75%乙醇消毒，假燒傷組立即腹腔注射乳酸鈉林格溶液5mL 抗休克；其余各組大鼠均采用燙傷儀制備深I(lǐng)I 度燒傷大鼠模型，參數(shù)設(shè)置為∶壓力0.03MPa、溫度106℃持續(xù)時(shí)間5s，通過病理切片證實(shí)造模成功（病理切片呈現(xiàn)∶部分真皮層內(nèi)細(xì)胞壞死，部分毛囊等附件殘存，毛細(xì)血管擴(kuò)張、管腔可見紅細(xì)胞及血液瘀滯）（見插頁圖1）。造模完成后各組大鼠立即腹腔注射乳酸鈉林格溶液5mL抗休克。假燒傷組和模型組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2mL/kg，每天1 次；磺胺嘧啶銀軟膏單藥組于燒傷皮膚涂抹磺胺嘧啶銀軟膏，每2 天換藥1 次，腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2mL/kg，每天1 次；磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組于燒傷皮膚涂抹磺胺嘧啶銀軟膏，每2 天換藥1 次，并分別腹腔注射濃度為6.25、12.5、25mg/mL 的芹菜素溶液2mL/kg，每天1次；療程14 天。

2.3 創(chuàng)面大體情況觀察及創(chuàng)面組織病理學(xué)檢查 治療14 天后觀察各組大鼠燒傷創(chuàng)面狀況，包括皮膚顏色、結(jié)痂狀況、分泌物、愈合狀況等；各組分別隨機(jī)取10 只大鼠，麻醉后頸椎脫臼致死，切取創(chuàng)面皮膚組織，置4%多聚甲醛溶液72h 實(shí)施固定，經(jīng)梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片（厚度5μm）后行HE 染色、梯度酒精脫蠟、二甲苯透明后中性樹脂封片，然后通過光學(xué)顯微鏡觀察。

2.4 創(chuàng)面愈合率計(jì)算 各組分別隨機(jī)取10 只大鼠，分別于給藥第0、14 天燒傷創(chuàng)面拍照，計(jì)算創(chuàng)面面積，創(chuàng)面愈合率（%）=（1-未愈創(chuàng)面面積/初始創(chuàng)面面積）×100%。

2.5 創(chuàng)面組織微循環(huán)血流灌注值（MPD）測定[7]取2.4 步驟的10 只大鼠，恒溫25℃環(huán)境下，通過激光多普勒血液灌流成像儀測定創(chuàng)面組織MPD 值，儀器參數(shù)設(shè)置∶掃描速度100ms/Line、掃描寬度64 像素、輪廓50 像素、視距12cm、顯示頻率5Hz，每只大鼠掃描5 次（掃描間隔為5s）取平均值。

2.6 創(chuàng)面組織微血管密度（MVD）測定[8]取2.3 步驟制備的創(chuàng)面組織HE 染色病理切片，在200 倍倒置光學(xué)顯微鏡下，每張切片于微血管豐富處選取互不重疊的5 個(gè)視野計(jì)數(shù)微血管數(shù)量，然后分別取平均值。

2.7 創(chuàng)面組織含水量測定 取2.5 步驟的10 只大鼠，麻醉后頸椎脫臼致死，切取創(chuàng)面皮膚組織，沖洗干凈后稱重（W1），置80℃烤箱烘烤24h 至恒重后稱量（W2），含水量（%）=[（W1-W2）/W1]×100%。

2.8 創(chuàng)面組織EGF、bFGF、VEGF 蛋白表達(dá)量測定各組分別取剩余的10 只大鼠，麻醉后頸椎脫臼致死，切取創(chuàng)面皮膚組織，于冰上剪碎后，加入9 倍量冷裂解液行研磨勻漿，恒4℃離心（12000rpm，15min）取上清，BCA 法測定總蛋白含量后，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、濕法轉(zhuǎn)PVDF 膜、5%脫脂奶粉37℃封閉1h，滴加兔抗鼠EGF、bFGF、VEGF 單抗（稀釋倍數(shù)1:3000）和兔抗鼠β-actin 單抗（稀釋倍數(shù)1:1000）后4℃孵育12h，洗膜后滴加山羊抗兔IgG 二抗（稀釋倍數(shù)1:500，37℃振蕩孵育1h，PBS 洗膜后滴加ECL 顯色發(fā)光，運(yùn)用凝膠成像系統(tǒng)獲得條帶；以β-actin 為內(nèi)參，以條帶灰度值對(duì)目標(biāo)檢測蛋白進(jìn)行半定量分析。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊分組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較行t 檢驗(yàn)，方差不齊采用Tamhane's t2檢驗(yàn)；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 芹菜素對(duì)深I(lǐng)I 度燒傷大鼠創(chuàng)面大體情況的影響 給藥治療14 天后觀察發(fā)現(xiàn)，假燒傷組大鼠創(chuàng)面毛發(fā)生長茂盛，毛發(fā)長度已基本恢復(fù)；模型組創(chuàng)面新生肉芽較少、結(jié)痂厚度不均勻，部分基底仍有黃色液體滲出；磺胺嘧啶銀軟膏單藥組創(chuàng)面縮小、大部分痂下愈合，無滲出；磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組創(chuàng)面呈不同程度縮小、大部分痂下愈合，無滲出，新愈合皮膚紅潤，毛發(fā)開始生長，其中磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素高劑量組效果最為顯著。

3.2 芹菜素對(duì)深I(lǐng)I 度燒傷大鼠組織病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的影響 給藥治療14 天后行HE 染色發(fā)現(xiàn)，假燒傷組未見明顯異常，模型組可見壞死組織以及炎性細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)較薄的新生上皮組織；磺胺嘧啶銀軟膏單藥組和磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組上皮組織成熟較好、排列整齊，汗腺、皮脂腺等結(jié)構(gòu)較為完整但仍較表淺；其中磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素高劑量組可見表皮生成，上述效果相對(duì)最好。見插頁圖2。

3.3 芹菜素對(duì)深I(lǐng)I 度燒傷大鼠創(chuàng)面愈合率的影響磺胺嘧啶銀軟膏組和磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組愈合率均升高，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.01）；與磺胺嘧啶銀軟膏單藥組比較，磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素中、高劑量組愈合率顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見表1。

3.4 芹菜素對(duì)深I(lǐng)I 度燒傷大鼠創(chuàng)面MPD、MVD 的影響 模型組MPD、MVD 較假燒傷組顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，磺胺嘧啶銀軟膏單藥組和磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組MPD、MVD 均顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01）；與磺胺嘧啶銀軟膏單藥組比較，磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素中、高劑量組MPD、MVD 顯著增加（P＜0.01）。見表2。

表1 芹菜素對(duì)深I(lǐng)I 度燒傷大鼠創(chuàng)面愈合率的影響（%，）

表1 芹菜素對(duì)深I(lǐng)I 度燒傷大鼠創(chuàng)面愈合率的影響（%，）

注∶假燒傷組、模型組予腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2mL/kg；磺胺嘧啶銀軟膏單藥組予燒傷皮膚涂抹磺胺嘧啶銀軟膏并腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2mL/kg；磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組予燒傷皮膚涂抹磺胺嘧啶銀軟膏并分別腹腔注射6.25、12.5、25mg/mL 濃度的芹菜素溶液2mL/kg；與模型組比較，aP＜0.01；與磺胺嘧啶銀軟膏單藥組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01

3.5 芹菜素對(duì)深I(lǐng)I 度燒傷大鼠創(chuàng)面組織含水量的影響 模型組創(chuàng)面組織含水量較假燒傷組顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素中、高劑量組含水量顯著降低（P＜0.01）；磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素高劑量組含水量較磺胺嘧啶銀軟膏單藥組顯著降低（P＜0.05）。見表2。

3.6 芹菜素對(duì)深I(lǐng)I 度燒傷大鼠創(chuàng)面組織EGF、bFGF、VEGF 蛋白表達(dá)的影響 與假燒傷組比較，模型組、磺胺嘧啶銀軟膏單藥組和磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組EGF、bFGF、VEGF 蛋白表達(dá)量均顯著上調(diào)（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組比較，磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組EGF、bFGF、VEGF 表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05 或P＜0.01）；磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素中、高劑量組EGF、bFGF、VEGF 表達(dá)量較磺胺嘧啶銀軟膏單藥組顯著上調(diào)（P 均＜0.01）。見表3、插頁圖3。

4 討論

燒傷后創(chuàng)面微循環(huán)障礙是導(dǎo)致創(chuàng)面加深、遷延不愈而影響預(yù)后的重要原因，所以改善局部微循環(huán)對(duì)燒傷創(chuàng)面治療意義重大。胡澤華等[8]、林建昌等[9]、馮智才等[10]研究發(fā)現(xiàn)，通過藥物干預(yù)改善燒傷創(chuàng)面微循環(huán)對(duì)創(chuàng)面愈合具有促進(jìn)作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素能夠通過上調(diào)VEGF 表達(dá)以促進(jìn)血管新生以及改善血流動(dòng)力學(xué)、血液流變學(xué)、調(diào)節(jié)血脂等而改善局部微循環(huán)[11-13]。

表2 芹菜素對(duì)深I(lǐng)I 度燒傷大鼠創(chuàng)面MPD、MVD 和含水量的影響（）

表2 芹菜素對(duì)深I(lǐng)I 度燒傷大鼠創(chuàng)面MPD、MVD 和含水量的影響（）

注∶假燒傷組、模型組予腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2mL/kg；磺胺嘧啶銀軟膏單藥組予燒傷皮膚涂抹磺胺嘧啶銀軟膏并腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2mL/kg；磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組予燒傷皮膚涂抹磺胺嘧啶銀軟膏并分別腹腔注射6.25、12.5、25mg/mL 濃度的芹菜素溶液2mL/kg；MPD 為微循環(huán)血流灌注值；MVD 為微血管密度；與假燒傷組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與磺胺嘧啶銀軟膏單藥組比較，cP＜0.05，ccP＜0.01

表3 芹菜素對(duì)深I(lǐng)I 度燒傷大鼠創(chuàng)面組織EGF、VEGF、bFGF 蛋白表達(dá)的影響（）

表3 芹菜素對(duì)深I(lǐng)I 度燒傷大鼠創(chuàng)面組織EGF、VEGF、bFGF 蛋白表達(dá)的影響（）

注∶假燒傷組、模型組予腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2mL/kg；磺胺嘧啶銀軟膏單藥組予燒傷皮膚涂抹磺胺嘧啶銀軟膏并腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2mL/kg；磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組予燒傷皮膚涂抹磺胺嘧啶銀軟膏并分別腹腔注射6.25、12.5、25mg/mL 濃度的芹菜素溶液2mL/kg；EGF 為表皮生長因子；VEGF 為血管內(nèi)皮生長因子；bFGF 為堿性成纖維細(xì)胞因子；與假燒傷組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與磺胺嘧啶銀軟膏單藥組比較，cP＜0.01

按照“三度四分法”分級(jí)，根據(jù)燒傷深度可分為I度、淺II 度、深I(lǐng)I 度和III 度燒傷，其中深I(lǐng)I 度燒傷臨床最為常見。因此，本研究采用壓力0.03MPa、106℃持續(xù)5s 的方法制備深I(lǐng)I 度燒傷大鼠模型，結(jié)合外用磺胺嘧啶銀軟膏，探討芹菜素對(duì)燒傷創(chuàng)面微循環(huán)及創(chuàng)面愈合的影響[14]。結(jié)果顯示，與磺胺嘧啶銀軟膏單藥組比較，磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素治療能夠顯著改善創(chuàng)面愈合狀況、抑制創(chuàng)面組織病變、提高創(chuàng)面愈合率，能夠提高創(chuàng)面組織MPD、MVD 并降低創(chuàng)面組織含水量，提示芹菜素能夠改善大鼠深I(lǐng)I 度燒傷創(chuàng)面局部微循環(huán)并促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

在燒傷創(chuàng)面愈合的過程中，多種生長因子促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化、合成與分泌創(chuàng)面愈合所需物質(zhì)而發(fā)揮重要作用[15]。EGF 能夠促進(jìn)表皮角質(zhì)細(xì)胞、纖維細(xì)胞增殖并促進(jìn)血管新生和核酸蛋白質(zhì)合成[16]；bFGF 則能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和遷移，并促進(jìn)表面上皮組織生成[17]；VEGF 特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，具有較強(qiáng)的促血管新生作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，與磺胺嘧啶銀軟膏單藥組比較，磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素治療能夠顯著上調(diào)創(chuàng)面組織EGF、bFGF、VEGF 蛋白表達(dá)，這可能是芹菜素促進(jìn)大鼠深I(lǐng)I 度燒傷創(chuàng)面血管新生進(jìn)而改善創(chuàng)面微循環(huán)的重要機(jī)制。

綜上所述，芹菜素能夠通過改善局部微循環(huán)而促進(jìn)大鼠深I(lǐng)I 度燒傷創(chuàng)面愈合，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)相關(guān)生長因子表達(dá)而促進(jìn)血管新生有關(guān)。