龍家輝，藍(lán)家程，姜勇祥

(1.貴州師范大學(xué) 地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2.貴州師范大學(xué) 喀斯特研究院/國家喀斯特石漠化防治工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550001)

貴州是中國西南喀斯特分布的中心，也是石漠化最為嚴(yán)重的地區(qū)。從“九五”開始，國家和地方政府相繼實(shí)施了退耕還林和石漠化治理工程，旨在控制石漠化發(fā)展，解決生態(tài)與社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展的矛盾。大量研究表明，石漠化治理能夠提高土壤肥力，改善土壤結(jié)構(gòu)，增加土壤有機(jī)碳[1-2]。然而，石漠化治理生態(tài)修復(fù)對土壤微生物群落組成的影響報(bào)道尚少。土壤微生物參與有機(jī)質(zhì)的分解、腐殖質(zhì)的形成、養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化與循環(huán)等過程，是土壤有機(jī)質(zhì)和土壤養(yǎng)分(C、N、P、S等)轉(zhuǎn)化和循環(huán)的驅(qū)動力[3]，土壤微生物與土壤質(zhì)量和植物群落的關(guān)系密切，可以敏感反應(yīng)土壤質(zhì)量的變化[4]。因此，開展喀斯特石漠化地區(qū)退耕還林對土壤微生物群落的影響研究，可為喀斯特石漠化區(qū)土壤質(zhì)量恢復(fù)和退耕還林選擇模式提供科學(xué)依據(jù)。

研究表明，隨著退耕還林由低級階段向高級階段發(fā)展，土壤微生物數(shù)量逐漸提高[4]?？λ固厥瘏^(qū)退耕還林對土壤微生物碳、基礎(chǔ)呼吸有重要影響，相對于裸露地，退耕還林顯著提高了微生物量碳、微生物活性、微生物商、細(xì)菌種豐富度及基因多樣性[5]。在喀斯特峰叢洼地中由草叢-灌叢-次生林和原生林生態(tài)系統(tǒng)，土壤微生物生物量與土壤微生物碳熵呈增加趨勢。隨著植被演替，表層土壤微生物總量為頂級林>灌叢>喬幼林>灌草叢>草叢[6]。

從已有的研究來看，退耕還林對土壤微生物指標(biāo)的影響大多從自然恢復(fù)的角度進(jìn)行討論，缺乏人工林恢復(fù)的研究。人工林恢復(fù)和自然恢復(fù)模式是否改變了土壤細(xì)菌群落豐度和多樣性，是否有利于向生態(tài)恢復(fù)方向發(fā)展尚未報(bào)道。筆者以貴州喀斯特石漠化綜合治理示范區(qū)關(guān)嶺花江示范區(qū)為試驗(yàn)基地，以耕地為對照，選取人工花椒林和自然退耕還林地，運(yùn)用高通量測序技術(shù)，揭示不同退耕還林樣地土壤細(xì)菌群落的豐度和多樣性的變化特征，以期為喀斯特退耕還林地區(qū)土壤保護(hù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于貴州省關(guān)嶺縣花江鎮(zhèn)峽谷村喀斯特峽谷石漠化綜合治理示范區(qū)內(nèi)(105°36′30″～105°46′30″E, 25°39′13″～25°41′00″N)。該區(qū)屬典型的亞熱帶干熱河谷氣候，年均降雨量1 100 mm，年均氣溫18.4℃。該區(qū)地貌為典型的喀斯特高原峽谷地貌，海拔為450～1 300 m。高原峽谷地貌河谷深切發(fā)育，坡度陡峻，水土流失嚴(yán)重，巖石裸露率高、植被覆蓋率低，石漠化發(fā)育。土壤以碳酸鹽巖風(fēng)化發(fā)育的石灰土為主。

1.2 采樣設(shè)計(jì)與方法

以耕地(CL)為對照，選取研究區(qū)2種退耕還林模式(自然退耕還林SF、人工花椒林CP)為研究對象。每種地類設(shè)置3個(gè)樣地，每個(gè)樣地使用無菌袋采集0～10 cm土層原狀土壤，8～10個(gè)點(diǎn)混合為1個(gè)點(diǎn)。

1.3 DNA提取及純化

用DNA試劑盒提取土壤DNA。使用Nanodrop 2000光譜儀(Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE，United States)測量提取DNA的濃度和純度。土壤的DNA在使用前一直保存在-20℃。使用引物16S V3～V4區(qū)，上游引物338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA，下游引物806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增細(xì)菌16S核糖體RNA基因的V3～V4可變區(qū)。使用TransGen AP221-02:TransStart-Fastpfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并在GeneAmp 9700熱循環(huán)儀中進(jìn)行熱循環(huán)。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，退火溫度30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃保持10 min。每個(gè)樣本3個(gè)PCR重復(fù)。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增。使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit凝膠提取試劑盒(United States)純化擴(kuò)增產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物用QuantusTMFluorometer進(jìn)行檢測定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫，最后利用Illu mina公司的Miseq PE300平臺(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)對細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)進(jìn)行了測序。

1.4 OUT分類

根據(jù)學(xué)注稀結(jié)果，按照門、綱、屬3個(gè)水平分別提取序列信息，并計(jì)算各物種的相對豐度，同時(shí)選取相對豐度在1%以上的物種繪制物種相對豐度分布圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序數(shù)據(jù)的優(yōu)化

質(zhì)控去除不合格序列后，3個(gè)土壤樣品中共獲得細(xì)菌總優(yōu)化序列 2 372 533條?；?7%相似度，樣品CL、CP、SF的OTU數(shù)量分別為896 629、757 286和718 618。如圖1所示，當(dāng)序列數(shù)達(dá)到12 000以上時(shí)，曲線逐漸趨于平緩。測序各樣品測得序列數(shù)均遠(yuǎn)大于12 000，說明能較好地反映土壤樣品中微生物多樣性的主要信息。Core物種分析曲線隨樣本數(shù)量的增加趨于平緩，表明此次檢測樣本數(shù)量充足，數(shù)據(jù)具有可靠性。

2.2 土壤細(xì)菌群落分布

由圖2可知，CL獨(dú)有物種多集中在放線菌門7.65%，變形桿菌門 1.58%，芽單胞菌門1.16%，酸桿菌門1.07%，綠彎菌門1.02%；CP獨(dú)有物種多集中在擬桿菌門2.15%為最多，疣微菌門占有1.27，厚壁菌門1.14%，酸桿菌門1.01%,芽單胞菌門1.01%，Patescibacteria占有1.01%，綠彎菌門1.01%；SF獨(dú)有物種多集中在擬桿菌門11.16%為最多，放線菌門3.28%，Entotheonellaeota 2.26%，變形桿菌門5.33%，Patescibacteria 1.46%。3種樣地共有核心物種(在OUT水平下)有2 220個(gè)，獨(dú)有物種不同，可以說明3種樣地在物種組成上具有明顯差別。

由圖3可知，耕地物種中綠彎菌門(17.79%)顯著比其他樣地多，花椒地物種在酸桿菌門(18.50%)顯著比其他樣地多，喬木林物種在放線菌門(43.44%)、變形桿菌門(24.20%)顯著比其他樣地多。在生態(tài)恢復(fù)之后，花椒地與耕地相比酸桿菌門具有增加的趨勢(5.4%)，喬木林中的放線菌門、變形桿菌門具有增加的趨勢，分別增加7.75%和3.99%；厚壁菌門、擬桿菌門、已科河菌門變化不顯著；喬木林中芽單胞菌門、綠彎菌門有減少的趨勢，分別減少2.11%和5.92%。表明，退耕還林顯著提高了土壤中的擬桿菌門、放線菌門的相對豐度，降低了綠彎菌門、芽單胞菌門的相對豐度，而退耕種植花椒顯著提高了酸桿菌門的相對豐度。

2.3 土壤細(xì)菌群落多樣性

由表1可知，不同植被類型土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)均無顯著差異，樣本中觀察到的物種數(shù)目指數(shù)、香農(nóng)-威納指數(shù)、辛普森指數(shù)、群落中含有OTU數(shù)目指數(shù)和菌種豐富的指數(shù)表現(xiàn)為耕地>花椒>次生林，表明退耕還林對土壤細(xì)菌多樣性影響不顯著?；诰嚯x算法對不同退耕還林模式土壤細(xì)菌群落組成進(jìn)行NMDS分析(圖4)表明，3種土地利用類型土壤的細(xì)菌群落部分組成存在差異，而在花椒地中的部分與耕地的差異并不明顯，可能的原因是當(dāng)?shù)鼗ń贩N植年限少，部分退耕年限小于5年，群落構(gòu)建時(shí)間短，所以與耕地細(xì)菌群落差異性不明顯，而喬木林退耕年限長基本在10年以上，對細(xì)菌群落的影響較為顯著。

表1 不同植被類型下土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)特征

3 結(jié)論

1) 喀斯特石漠化區(qū)退耕還林均使得土壤細(xì)菌群落中的獨(dú)有物種和核心物種發(fā)生了變化。

2) 生態(tài)恢復(fù)顯著提高了土壤中的擬桿菌門、放線菌門的相對豐度，降低了綠彎菌門、芽單胞菌門的相對豐度，退耕種植花椒顯著提高了酸桿菌門的相對豐度。

3) 生態(tài)恢復(fù)之后，土壤細(xì)菌群落的多樣性并沒有發(fā)生顯著變化。

4) 土壤細(xì)菌群落組成和豐度相比群落多樣性對退耕還林的響應(yīng)更為敏感。