林 勇，肖冬來(lái)，劉俊鋒，唐小巒

（1. 福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350101；2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意義】凝集素是一類非免疫起源、無(wú)酶活性、可專一識(shí)別多糖并與之非共價(jià)可逆結(jié)合的蛋白，含有一個(gè)或者多個(gè)非催化結(jié)構(gòu)，能凝集細(xì)胞、沉淀糖蛋白，具有多種生物學(xué)、生理學(xué)和免疫學(xué)功能[1-3]。凝集素具有結(jié)合特異性，能識(shí)別細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間或組織間的效應(yīng)分子。凝集素根據(jù)分子結(jié)構(gòu)可分為C-型凝集素、S-型凝集素、P-型凝集素、I-型凝集素。C-型凝集素是依賴Ca2+的凝集素；S-型凝集素可以和β-半乳糖苷鍵特異性結(jié)合；P-型凝集素對(duì)6-磷酸甘露糖具有特異識(shí)別能力；而I-型凝集素類似于免疫球蛋白。凝集素在動(dòng)物[4]、昆蟲(chóng)、植物、真菌以及不同的器官和組織中含量都比較豐富，甚至在細(xì)菌和病毒中也有凝集素的報(bào)道[5-7]。真菌凝集素普遍存在于大型真菌中，分子量為12～190 kD，一般由2～4個(gè)相同亞基組成，是食（藥）用真菌中一種重要的藥理成分，含量豐富，雖然從子實(shí)體、菌絲、菌核、孢子等器官中均能提取，但大多數(shù)蘑菇凝集素為從子實(shí)體和菌絲中提取，僅少量從菌核中提取，而且不同發(fā)育階段真菌中凝集素的含量也不同[8]。雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）又名白蘑菇、紐扣蘑菇，是一種常見(jiàn)的食用蘑菇，在世界范圍內(nèi)均有栽培種植，其具有風(fēng)味鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富等特性，在食用菌市場(chǎng)中占據(jù)著重要份額[9]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】前人研究表明，凝集素具有促進(jìn)植物有絲分裂以及防御病蟲(chóng)害、細(xì)胞免疫活性、殺菌、降血壓、活化淋巴細(xì)胞、抑制腫瘤生長(zhǎng)等功能[10-16]。凝集素參與了高等動(dòng)物的發(fā)育、癌變以及細(xì)胞識(shí)別與信息傳遞等重要過(guò)程；不僅在動(dòng)物自身的器官發(fā)育分化與防御機(jī)制中有重要作用，而且還能增強(qiáng)高等動(dòng)物的免疫能力。因此，蘑菇凝集素目前已成為細(xì)胞學(xué)、腫瘤學(xué)以及免疫學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。吳恩奇和圖力古爾（2006）綜述了蘑菇凝集素的分布、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、作用與功能、提取方法和應(yīng)用進(jìn)展[3]，目前已知大約80%以上蘑菇中的凝集素具有凝血活性[17-18]。張迪等對(duì)雙孢蘑菇2796凝集素提取和理化特性的初步研究發(fā)現(xiàn)，該凝集素在pH 3.0～10.0范圍內(nèi)均保持較高的凝集活性，且不依賴于二價(jià)金屬離子[19]，穩(wěn)定性強(qiáng)。目前關(guān)于凝集素基因研究的報(bào)道較多，主要體現(xiàn)在天南星和石蒜[13]、擬南芥[20]、綠藻石莼屬孔石莼[21]、新疆黃精[22]、家蠶[23]、大豆[24]、荔枝[25]、金針菇[26]、柞蠶[27]、掌葉半夏[28]等植物和昆蟲(chóng)凝集素基因的克隆和表達(dá)研究上，并探索凝集素基因與蘑菇原基形成的關(guān)系，挖掘其潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，以求闡明子實(shí)體形成的分子調(diào)控機(jī)理[26]。彭博等（2019）雖對(duì)雙孢蘑菇轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序并對(duì)褐變相關(guān)基因展開(kāi)挖掘，但并未對(duì)凝集素基因進(jìn)行相關(guān)研究[29]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】而雙孢蘑菇凝集素基因的擴(kuò)增及原核表達(dá)目前尚未有相關(guān)研究報(bào)道，其基因功能的研究更是缺乏理論依據(jù)。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究根據(jù)已報(bào)道的雙孢蘑菇凝集素基因序列設(shè)計(jì)引物，以總DNA為模板擴(kuò)增雙孢蘑菇凝集素基因，并構(gòu)建原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、Western blot技術(shù)鑒定，獲得凝集素重組蛋白，有助于目的基因的深入研究，也為進(jìn)一步深入挖掘凝集素家族基因、明確其生物學(xué)功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌 株 雙 孢蘑 菇Agaricus bisporus（Lange）Singer 2796菌株由福建農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。表達(dá)載體pET-28a、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、BL21（DE3）均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所保存。

1.1.2 酶和試劑 限制性內(nèi)切酶以及其他工具酶均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；克隆載體pMD18-T Vector Systems購(gòu)自日本TaKaRa公司，QIAEXⅡ Gel Extration Kit購(gòu)自QIAGEN公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雙孢蘑菇基因組DNA的提取 采用CTAB法[30]，從雙孢蘑菇中提取雙孢蘑菇基因組DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及序列擴(kuò)增 根據(jù)基因文庫(kù)設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物。引物序列如下：正向引物5′-GG ATCCATGTCTTACACCGTCAGCGTTCG-3′；反向引物 5′-CTCGAGTTATCCGATGATGAGATTGGC-3′。取上述提取的雙孢蘑菇DNA采用PCR法特異擴(kuò)增基因序列，反應(yīng)條件為：94℃5 min，預(yù)變性；94℃1 min，變性，55℃1 min，退火，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳（TAE電泳緩沖液、電壓120 V）后，與Marker對(duì)照判斷無(wú)誤后，切下特異性擴(kuò)增條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物按照QIAEXⅡGel Extration Kit（QIAGEN公司產(chǎn)品）回收純化說(shuō)明書(shū)進(jìn)行?；厥债a(chǎn)物連接到pMD18-T載體，篩菌驗(yàn)證后送華大基因測(cè)序，最終得到中間質(zhì)粒pMD18-lectin。

1.2.3 凝集素基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將pMD18-lectin和pET28-α原核表達(dá)載體限制性內(nèi)切酶XhoI/BamHI進(jìn)行雙酶切處理。取適量酶切產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收，回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至克隆菌株DH5α感受態(tài)中，挑取長(zhǎng)出的菌落，進(jìn)行菌液PCR鑒定，將檢測(cè)出目的條帶的菌液提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，最終得到表達(dá)質(zhì)粒pET28-lectin。

1.2.4 重組質(zhì)粒pET28-lectin在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 取1 μg上述測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入50～100 μL大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。挑取長(zhǎng)出的菌落，進(jìn)行菌液PCR鑒定，得到最終表達(dá)菌株。

取上述PCR鑒定正確的菌液30 μL分別接種到含有3 mL新鮮的LK液體培養(yǎng)基的玻璃管中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm≈0.6，在培養(yǎng)基中加入IPTG至終濃度1 mmol·L-1，以誘導(dǎo)外源基因在大腸桿菌中表達(dá)。以IPTG培養(yǎng)基作為未誘導(dǎo)的對(duì)照。上述處理后的菌液在37℃下250 r·min-1繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3 h或更長(zhǎng)時(shí)間，使外源基因在大腸桿菌中充分表達(dá)。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot檢測(cè) 制備SDS-PAGE凝膠（12%分離膠和5%濃縮膠），分別上樣經(jīng)ITPG誘導(dǎo)的菌體蛋白、未誘導(dǎo)的菌體蛋白以及空白菌體蛋白，電泳至溴酚藍(lán)跑出玻璃板即可終止。電泳結(jié)束前30 min，將PDVF在甲醇中浸潤(rùn)3～10 s，移至電轉(zhuǎn)液中放置20～30 min，在60 V恒壓、4℃條件下轉(zhuǎn)膜1 h至PVDF膜上，將電轉(zhuǎn)好的PDVF膜放在離子水中去除SDS，接著用PBST進(jìn)行洗滌10 min，洗滌4次；5%脫脂奶粉封閉1 h。制備的組氨酸（His）抗體作為一抗，室溫下?lián)u床孵育2 h，PBST進(jìn)行洗滌10 min，洗滌4次；用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，室溫下?lián)u床孵育2 h，PBST進(jìn)行洗滌10 min，洗滌4次；洗滌結(jié)束后去除洗滌液，加入DAB染色工作液染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增雙孢蘑菇凝集素基因

通過(guò)與雙孢蘑菇基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，凝集素基因不含有內(nèi)含子，所以無(wú)需通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增凝集素基因，可直接以雙孢蘑菇總DNA為模板，PCR擴(kuò)增凝集素基因。根據(jù)基因文庫(kù)設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物。瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)序結(jié)果表明，得到大小432 bp的條帶，與目的基因大小一致（圖1）。

2.2 凝集素基因克隆載體的構(gòu)建

割膠回收PCR擴(kuò)增的凝集素基因，與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布LB平板后于37℃下培養(yǎng)至克隆菌落出現(xiàn)，挑取菌落搖菌后提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定插入片段是否正確。瓊脂糖電泳后觀察酶切結(jié)果，發(fā)現(xiàn)插入片段與PCR產(chǎn)物大小一致（如圖2所示）。陽(yáng)性克隆送交公司測(cè)序。經(jīng)Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，測(cè)序結(jié)果序列與GenBank中已知序列高度同源（99%），確定插入片段為雙孢蘑菇凝集素基因，重組質(zhì)粒pMD18-lectin構(gòu)建正確。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)凝集素基因PCR產(chǎn)物Fig.1 Detecting PCR products of lectin gene with agarose gel electrophoresis

圖2 重組質(zhì)粒pMD-lectin雙酶切鑒定Fig.2 Restriction enzyme digestion of pMD-lectin

2.3 雙孢蘑菇凝集素基因表達(dá)載體的構(gòu)建

BamHⅠ和XhoⅠ酶切重組子pMD18-lectin，回收插入片段后將其與同樣酶切回收的pET-28α載體相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布LB平板后于37℃下培養(yǎng)至克隆菌落出現(xiàn)，挑取菌落搖菌后提取質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28-lectin。重組子pET28-lectin經(jīng)質(zhì)粒PCR確定插入片段大小正確（圖3）。

圖3 重組質(zhì)粒pET-lectin的PCR驗(yàn)證Fig.3 PCR verification of pET-lectin

2.4 凝集素基因在大腸桿菌中的表達(dá)

重組子pET28-lectin轉(zhuǎn)入BL21（DE3）后，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果顯示：重組凝集素蛋白在BL21（DE3）中的表達(dá)產(chǎn)物大約為18 kDa（圖4）。

圖4 凝集素融合基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS-聚丙烯酰胺電泳分析Fig.4 SDS-PAGE on expression product of lectin fusion gene

2.5 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析

原核表達(dá)載體中攜帶6個(gè)絲氨酸（His）的標(biāo)簽，其表達(dá)的凝集素中亦融合了6個(gè)His氨基酸的標(biāo)簽。所以用6×His抗體可以檢測(cè)凝集素的表達(dá)情況。結(jié)果表明（如圖5所示），凝集素融合基因的表達(dá)產(chǎn)物均能與His抗體特異性結(jié)合，說(shuō)明凝集素融合基因得到了表達(dá)。

圖5 凝集素融合蛋白Western blot分析Fig.5 Western blot on lectin fusion protein

3 討論與結(jié)論

本研究獲得的凝集素基因大小為432 bp，均小于目前已知的荔枝凝集素基因468 bp[25]、新疆黃精凝集素基因550 bp[22]、大豆凝集素基因800 bp[24]、掌葉半夏凝集素基因729～777 bp[28]以及家蠶凝集素基因810 bp[23]，但是凝集素基因序列大小與其生物學(xué)功能差異機(jī)理目前尚不清楚。本研究應(yīng)用的pET-28α載體是帶有載體6個(gè)His標(biāo)簽的融合表達(dá)系統(tǒng)，而融合蛋白中的His標(biāo)簽不會(huì)影響蛋白的活性，便于蛋白純化。根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，其他植物凝集素基因中還存在家族成員且同源性較高，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)現(xiàn)在相同時(shí)間、相同濃度的IPTG誘導(dǎo)下，融合蛋白的表達(dá)量各不相同[28]，因此，項(xiàng)目組后續(xù)還需通過(guò)生物信息學(xué)手段進(jìn)一步挖掘其基因組中家族成員基因及其他潛在的功能基因，為分析雙孢蘑菇子實(shí)體形成的分子調(diào)控機(jī)理提供理論依據(jù)。

雙孢蘑菇子實(shí)體中存在大量的凝集素，而凝集素的含量和分布與雙孢蘑菇不同的發(fā)育階段也有一定的相關(guān)性，在原基期含量很少，在子實(shí)體成熟期內(nèi)數(shù)量增加[8]。因此，可以推測(cè)在子實(shí)體形成過(guò)程中凝集素基因的表達(dá)量也逐漸增加，凝集素基因的表達(dá)量是否與子實(shí)體中營(yíng)養(yǎng)成分含量有關(guān)有待進(jìn)一步研究。大量的研究表明，許多植物中分離的凝集素或被克隆和鑒定出來(lái)的凝集素基因表達(dá)產(chǎn)物均具有抗蟲(chóng)活性[31-33,16]，但是凝集素基因相關(guān)研究在雙孢蘑菇中未見(jiàn)報(bào)道，僅見(jiàn)于提取雙孢蘑菇凝集素對(duì)血紅細(xì)胞凝集活性的研究[27]。課題組前期開(kāi)展了雙孢蘑菇凝集素的抗氧化活性、對(duì)植物病菌和海洋微藻的抑制等方面的工作，均具有較好的作用效果。因此，本研究后續(xù)研究將重點(diǎn)開(kāi)展雙孢蘑菇凝集素基因功能方面的工作，比如凝集素基因與雙孢蘑菇品質(zhì)改良基因的相關(guān)性研究；同時(shí)，雙孢蘑菇凝集素的應(yīng)用也可借鑒植物凝集素的應(yīng)用研究方法，特別是通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將雙孢蘑菇凝集素基因轉(zhuǎn)化到作物中，發(fā)揮其抗蟲(chóng)性和抗病性方面的巨大潛力。也可利用基因編輯技術(shù)從雙孢蘑菇中克隆編碼具有免疫調(diào)節(jié)或抗腫瘤功能的凝集素基因，通過(guò)導(dǎo)入微生物合成重組蛋白并檢測(cè)蛋白的免疫或抗腫瘤生理活性，為進(jìn)一步篩選和開(kāi)發(fā)新型先導(dǎo)藥物提供依據(jù)。

本研究選擇最常見(jiàn)的雙孢蘑菇作為研究對(duì)象，通過(guò)PCR擴(kuò)增雙孢蘑菇凝集素基因，構(gòu)建雙孢蘑菇凝集素基因克隆載體和基因表達(dá)載體等手段使雙孢蘑菇凝集素基因在大腸桿菌中表達(dá)，為今后穩(wěn)定、大量獲得雙孢蘑菇凝集素奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步深入研究凝集素基因和蛋白功能特性提供依據(jù)。