林江波，王偉英，鄒 暉，戴藝民

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所，福建 漳州 363005）

0 引言

【研究意義】甾體皂苷是一類重要的生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗菌消炎、解痙攣和降血糖等多種藥理活性[1]，由甾體皂苷元骨架和1個或多個單糖或寡糖鏈縮合而成，結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，主要存在于百合科（Liliaceae）[2-4]、薯蕷科（Dioscoreaceae）[5]等植物中。根據(jù)甾體皂苷元上F環(huán)結(jié)構(gòu)的變化主要分為螺甾烷型、呋甾烷型和膽甾烷型等3類。呋甾皂苷 26-O-β-葡萄糖苷酶（furostanol glycoside 26-O-βglucosidase, F26G）催化呋甾烷型皂苷C-26糖苷鍵水解，形成螺甾烷型皂苷，是甾體皂苷代謝途徑中的一個關(guān)鍵酶[6]。克隆金線蓮（Anoectochilus roxburghii）F26G基因，分析其表達(dá)模式，對研究金線蓮甾體皂苷的合成與代謝具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】黃楚君等[7]從蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium Sw.）的束花石斛（Dendrobium chrysanthumWall. ex Lindl.）中分離到變形螺甾烷醇類甾體皂苷。劉海等[8]從吉祥草 [Reineckia carnea（Andr.）Kunth]分離到3個甾體皂苷對人腎癌786-O細(xì)胞具有毒活性。Barile等[9]從蔥屬（Allium）植物A.minutiflorum中分離到3種具有抗菌活性的甾體皂苷，抗菌活性試驗發(fā)現(xiàn)螺甾烷皂苷的抗菌活性比呋甾烷皂苷更強(qiáng)。閉鞘姜（Costus speciosus）的CSF26G基因編碼562個氨基酸，與pET-22b連接后利用E. coliBL21能表達(dá)出高活性的F26G酶，催化呋甾烷型皂苷形成螺甾烷型皂苷[10-11]。Nakayasu 等[12]從Dioscorea esculenta中分離到DeF26G1的cDNA序列，編碼566個氨基酸，屬于GH1家庭β糖苷酶，能體外催化呋甾烷型皂苷形成螺甾烷型皂苷。金線蓮是蘭科（Orchidaceae）開唇蘭屬（Anoectochilus）植物，含有多糖、生物堿、黃酮、金線蓮苷和甾體化合物等多種成分[13-16]，是我國珍貴的中藥材，具有保肝、降血壓血糖、抗氧化和抗腫瘤等藥理活性[17-18]。福建是全國金線蓮種植和消費最大的省份，南靖、永安、武平等地都有較大規(guī)模的種植。目前，有關(guān)金線蓮藥效成分代謝相關(guān)基因的研究較少?！颈狙芯壳腥朦c】F26G基因是甾體皂苷代謝途徑中的一個關(guān)鍵酶，迄今為止，國內(nèi)外還未有金線蓮呋甾皂苷26-O-β-葡萄糖苷酶基因（ArF26G）的相關(guān)研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過金線蓮轉(zhuǎn)錄組測序獲得含有ArF26G基因5′末端的cDNA序列，利用RACE技術(shù)克隆金線蓮ArF26G基因的cDNA全長，并分析不同溫度和種植時間該基因在金線蓮莖、葉中的表達(dá)，以期為進(jìn)一步了解金線蓮甾體皂苷的生物合成代謝調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

試驗材料由采自福建省龍巖市梅花山金線蓮的種子，經(jīng)過組織培養(yǎng)播種獲得的組培生根苗。選取長勢一致的組培生根瓶苗，用于種植和溫度處理。2017年11月種植于溫室大棚，基質(zhì)為經(jīng)過高壓消毒的泥炭土，光照強(qiáng)度3 000～5 000 lx，空氣相對濕度85%～90%，于種植 1、2、3、4、5、6個月各取樣1次；生根瓶苗用培養(yǎng)箱5、15、25、35℃處理6 d后取樣；每個樣品隨機(jī)選取長勢一致的植株10株，分別取莖和葉，混勻，液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 金線蓮ArF26G基因全長cDNA克隆

按照RNAiso Plus試劑說明書（TaKaRa）進(jìn)行總RNA的提取，并利用分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA的完整性和純度。參照PrimeScriptTMReverse Transcriptase試劑說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序信息設(shè)計3′RACE引物3F26-F1、3F26-F2 和 3′adaptor引物 dT-adapt、adapt，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（引物信息見表1，下同）。以3F26-F1和dT-adapt進(jìn)行第一輪PCR，再以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，以引物3F26-F2和adapt進(jìn)行巢式PCR，PCR程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸50 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收，與pMD19-T質(zhì)粒載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂平板后37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆于帶Amp抗性的液體LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過夜，菌液經(jīng)PCR鑒定后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3 生物信息學(xué)分析

在NCBI中用BLAST X和BLAST P程序分別搜索序列相似性和氨基酸保守結(jié)構(gòu)域。利用ProtParam和在線工具SSPro（http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/）預(yù)測ArF26G基因編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的理化性質(zhì)和二級結(jié)構(gòu)，利用TargetP1.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）預(yù)測蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位；采用MEGA 6.0軟件分析、構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[19]。

表1 PCR引物及其序列Table1 PCR primers and sequences

1.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)

根據(jù)ArF26G基因開放閱讀框（ORF）設(shè)計擴(kuò)增上游引物F26-F（帶BamHI酶切位點）和下游引物F26-R（帶SacI酶切位點），PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸120 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。膠回收PCR產(chǎn)物，回收產(chǎn)物和載體pET-28a（+）經(jīng)BamHI和SacI雙酶切，經(jīng)膠回收、連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆過夜培養(yǎng)，PCR驗證后送上海生工生物工程有限公司測序。提取陽性克隆的質(zhì)粒，獲得重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-ArF26G。用凍融法把pET-28a-ArF26G轉(zhuǎn)化大腸桿菌（E. coli）BL21（DE3），誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白電泳參照林江波等[20]的方法。

1.5 表達(dá)分析

以提取的金線蓮莖、葉總RNA為模板，使用PrimeScriptTMReverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用超微量紫外可見光分光光度計（ND-1000）將cDNA濃 度定量為 100 ng·μL-1。根據(jù) TaKaRa TB GreenTMPremixEx TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）說明書及Roche LightCycler 96熒光定量PCR儀的操作要求進(jìn)行實時熒光定量PCR。以ArF26G基因全長cDNA序列設(shè)計熒光定量PCR引物F26G-F和F26G-R。選擇金線蓮Actin為內(nèi)參基因[21]，引物為ArACT-F和ArACT-R。反應(yīng)體系 20 μL：cDNA 模板3 μL，TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ddH2O 補(bǔ)充至 20 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，60℃退火20 s，45個循環(huán)，每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

方差分析利用DPS數(shù)據(jù)處理軟件，多重比較采用新復(fù)極差法（Duncan法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 金線蓮ArF26G基因全長cDNA和ORF的克隆

以金線蓮組培苗提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用巢式PCR擴(kuò)增法，經(jīng)二輪的PCR擴(kuò)增后獲得一條500 bp的清晰條帶（圖1A），經(jīng)過克隆和測序，結(jié)果表明獲得目的基因的3′末端。利用DNAMAN V6.0進(jìn)行序列拼接和ORF分析，結(jié)果表明：cDNA全長1 982 bp（圖2），含有1個1 764 bp的ORF，編碼587個氨基酸，5′末端非翻譯區(qū)60 bp，3′末端非翻譯區(qū) 158 bp。

圖1 PCR電泳結(jié)果Fig.1 PCR products by electrophoresis

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用引物F26-F和F26-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示在1 800 bp左右有一條亮帶（圖1B），測序結(jié)果表明：目的片段與拼接結(jié)果一致，獲得了帶BamHⅠ和SacⅠ酶切位點的ORF。

2.2 金線蓮ArF26G蛋白生物信息學(xué)分析

通過Protparam在線分析ArF26G基因編碼的氨基酸，結(jié)果表明：該蛋白質(zhì)分子式為C2999H4554N782O902S15，分子量為66.48 kD，帶負(fù)電氨基酸（Asp+Glu）76個，帶正電氨基酸（Arg+Lys）63個，理論等電點（pI）為5.31，脂肪系數(shù)為75.08，總平均疏水性為-0.465，不穩(wěn)定系數(shù)為37.92，屬穩(wěn)定蛋白。

SSPro（http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/）在線工具對ArF26G蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果（圖3）表明，形成無規(guī)則卷曲的氨基酸殘基有273個，占46.5%；形成α螺旋的氨基酸殘基有215個，占36.63%；形成β折疊的氨基酸殘基有99個，占16.87%。

圖2 金線蓮ArF26G基因cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 The cDNA and its deduced amino acid sequence of ArF26G from Anoectochilus roxburhii

利用NCBI的BLAST P在線搜索ArF26G蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，相匹配的是Glycosyl hydrolase 1（GH1）superfamily結(jié)構(gòu)域，E值為8.20×10-129，ArF26G蛋白的氨基酸序列與海棗（Phoenix dactylifera, XP_00 8791712）、蘆筍（Asparagus officinalis, XP_020250593）、閉鞘姜（Cheilocostus speciosus, Q42707）的F26G氨基酸序列相似性分別為67%、69%和65%。利用TargetP1.1預(yù)測ArF26G蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示ArF26G定位于葉綠體，N端的33個氨基酸殘基為葉綠體轉(zhuǎn)運肽。

采用MEGA6.0軟件對ArF26G的氨基酸序列和其他9個具有GH1保守結(jié)構(gòu)域物種的氨基酸序列進(jìn)行最大簡約法聚類分析，結(jié)果表明（圖4），10個物種聚為4類，金線蓮與桃紅蝴蝶蘭（Phalaenopsisequestris）和深圳擬蘭（Apostasia shenzhenica）等蘭科植物聚為一類，與深圳擬蘭的親緣關(guān)系最近，閉鞘姜、蘆筍和海棗聚為一類，藏紅花（Crocus sativus）單獨聚為一類，麻風(fēng)樹（Jatropha curcas）和荷花（Nelumbo nucifera）聚為一類。

2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)

與不攜帶質(zhì)粒pET-28a-ArF26G誘導(dǎo)表達(dá)和攜帶質(zhì)粒pET-28a-ArF26G不誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌BL21（DE3）相比，攜帶重組質(zhì)粒pET-28a-ArF26G的大腸桿菌BL21（DE3）經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后出現(xiàn)1條約66.48 kD的粗蛋白條帶，表明ArF26G基因能在大腸桿菌中有效表達(dá)（圖5）。

圖3 ArF26G蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Predicted secondary structure of ArF26G

圖4 ArF26G與其他物種GH1結(jié)構(gòu)域蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of ArF26G and GH1 domain proteins of other plants

2.4 ArF26G的表達(dá)分析

圖5 ArF26G基因在大腸肝菌中表達(dá)的SDS-PAGE電泳Fig.5 SDS-PAGE of ArF26G expressed in Esherichia coli.

圖6 不同處理溫度和種植時間ArF26G在莖和葉中的相對表達(dá)量Fig.6 Relative expression of ArF26G in stem and leaf under different treatment temperature and planting time.

以25℃處理金線蓮組培苗莖為參照，設(shè)ArF26G基因相對表達(dá)量為1，比較不同處理溫度和種植時間ArF26G基因在莖和葉中的表達(dá)量。從圖6可以看出，莖和葉都能檢測到ArF26G基因的表達(dá)，但在葉片中的表達(dá)量很低。4種處理溫度下，葉的ArF26G基因表達(dá)量差異不顯著，莖25℃時表達(dá)量最高，與其他3個溫度的表達(dá)量極顯著差異。不同種植時間，葉ArF26G基因的表達(dá)量差異不顯著，莖的ArF26G基因表達(dá)量差異極顯著。種植后的前3個月ArF26G基因在莖中的表達(dá)量差異不顯著，種植4個月，莖ArF26G基因的表達(dá)量急劇上升，4、5、6個月的表達(dá)量分別是25℃處理組培瓶苗的11.9、23.3和19.0倍，與種植1-3個月的表達(dá)量極顯著差異。

3 討論與結(jié)論

本研究克隆了金線蓮ArF26G基因，編碼587個氨基酸，細(xì)胞定位于葉綠體，N端的33個氨基酸殘基為葉綠體轉(zhuǎn)運肽，其推導(dǎo)的氨基酸序列具有1個GH1 superfamily，E值為 8.20×10-129，與海棗、蘆筍、閉鞘姜的F26G氨基酸序列相似性分別為67%、69%和65%，推斷該基因為金線蓮的ArF26G基因。金線蓮ArF26G基因在莖中的表達(dá)量極顯著高于葉，金線蓮組培苗經(jīng)25℃處理的表達(dá)量最高。當(dāng)金線蓮種植時間達(dá)4個月時，ArF26G基因在莖中的表達(dá)量是25℃處理組培苗莖的11.9倍，種植5個月達(dá)到23.3倍，推測種植4個月后金線蓮莖有螺甾烷型皂苷累積，這需要進(jìn)一步分析金線蓮甾體皂苷類化合物的組成和種植過程含量的變化來進(jìn)一步驗證。

植物GH1類β-葡萄糖苷酶參與了對微生物、昆蟲和食草動物的防御反應(yīng)[22]。甾體皂苷由作為糖苷配基的甾體骨架和與C3、C26羥基相連的低聚糖單元組成，當(dāng)細(xì)胞受到損傷，F(xiàn)26G水解呋甾烷型皂苷C-26糖苷鍵，形成具有生物活性的螺甾烷型皂苷[12]。F26G的活性不受C-22的羥基、甲氧基、雙鍵或C-3的葡萄糖鏈的影響，但C-23甲氧基會降低F26G的活性[23]，不同植物來源F26G催化的底物和催化活性存在差異。閉鞘姜的CsF26G1以原纖細(xì)薯蕷皂苷和原薯蕷皂苷為底物水解形成纖細(xì)薯蕷皂苷和薯蕷皂苷[10]。NAKAYASU等[12]克隆了Dioscorea esculenta的DeF26G1基因，編碼566個氨基酸，N端的80個氨基酸殘基是葉綠體轉(zhuǎn)運肽，成熟蛋白含486個氨基酸殘基，屬GH1 superfamily，水解原薯蕷皂苷C26糖苷鍵形成薯蕷皂苷，但不能水解C3糖苷鍵，成熟蛋白的催化活性強(qiáng)于完整蛋白；DeF26G1基因在葉中的表達(dá)量是塊莖的6倍，表達(dá)模式與催化底物原薯蕷皂苷的分布模式一致。本研究克隆的金線蓮ArF26G基因編碼的氨基酸的N端也有葉綠體轉(zhuǎn)運肽，但氨基酸殘基比DeF26G1少，其催化活性和在金線蓮中的催化底物及合成產(chǎn)物有待進(jìn)一步研究。