黃藝寧，陳凌華，程祖鋅，黃昕穎，許 明，鄭金貴

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)福建省特種作物育種與利用工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2. 漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 漳州 363000；3. 福建農(nóng)林大學(xué)金山學(xué)院，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】有色稻是糙米帶有顏色的栽培稻，由于含有花色苷、原花青素等黃酮類(lèi)的活性物質(zhì)，因而具有抗氧化、降血脂、消炎和抑制癌細(xì)胞等生理功能[1-2]，有很高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值。我國(guó)種植的有色稻以黑稻和紅稻居多，但它們的原始品種存在產(chǎn)量低、抗病性弱等問(wèn)題。經(jīng)過(guò)多年的種質(zhì)創(chuàng)新研究，既育出了黑珍米、 晚秈紫寶等常規(guī)品種[3-4]，也利用雜種優(yōu)勢(shì)選育出了血黑A、香血粳A、186A等黑米水稻三系不育系[5]。然而，育種材料少、農(nóng)藝性狀差、基因連鎖導(dǎo)致無(wú)法同時(shí)改良多個(gè)數(shù)量性狀等因素始終限制著有色稻的種質(zhì)創(chuàng)新[6]。輻射誘變是獲得色稻材料的一種有效方法。輻射誘變技術(shù)已成功應(yīng)用于水稻的種質(zhì)創(chuàng)新[7]，通過(guò)輻射誘變農(nóng)藝性狀好的常規(guī)稻以獲得優(yōu)良的有色稻種質(zhì)資源有助于解決雜交育種中親本農(nóng)藝性狀差、優(yōu)良性狀難以集中改良等問(wèn)題。因此，研究利用輻射誘變將產(chǎn)量高、農(nóng)藝性狀好的常規(guī)稻直接轉(zhuǎn)化以獲得優(yōu)質(zhì)的有色稻種質(zhì)資源具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】輻射誘變育種具有變異頻率高、變異范圍大、后代穩(wěn)定快、育種年限短等特點(diǎn)[8]。誘變技術(shù)的應(yīng)用可產(chǎn)生自然界不存在或極為罕見(jiàn)的新性狀新個(gè)體，是創(chuàng)造新種質(zhì)、培育新品種的有效途徑[9-10]。據(jù)國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)，到目前為止全世界通過(guò)輻射誘變已經(jīng)獲得超過(guò)3 200個(gè)突變品種，其中水稻832個(gè)品種（http://mvd.iaea.org）。我國(guó)在水稻輻射誘變育種研究工作方面取得了很大成就，輻射誘導(dǎo)育種的主要方向是葉形、粒形、穗形、株高等農(nóng)藝性狀的改良[7]。γ射線是植物誘變育種中最常用的誘變劑，會(huì)誘發(fā)單核苷酸突變、插入缺失突變。在李珊的γ誘變?cè)囼?yàn)中，水稻種子接受輻射后的突變概率達(dá)到2.00×10-6～2.21×10-6[11]，即只要有足夠的突變樣本就可能獲得特定的突變?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】誘導(dǎo)水稻籽粒顏色變黑、花色苷含量增加的研究較少，沈圣泉等曾利用γ射線輻射得到黑稻與紅稻突變體，但未對(duì)其營(yíng)養(yǎng)的變化進(jìn)行研究[12]。9311具有產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)良、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是重要的推廣品種。其配合力好，也是水稻雜交的優(yōu)良材料（如以其為親本育成了兩優(yōu)培九、廣兩優(yōu)6號(hào)等品種）[13]。此外，9311的全基因組測(cè)序工作于2002年已經(jīng)完成[14]，所以它不僅是種植的主要品種，也是水稻基因功能研究的模式品種[15]。以9311作為親本進(jìn)行輻射以獲得優(yōu)質(zhì)的有色稻種植資源未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)輻射誘變獲得有色籽粒同時(shí)又保留9311原有的農(nóng)藝性狀的水稻品種，可豐富有色稻育種及遺傳研究材料?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)輻射9311進(jìn)行誘變獲得有色稻，考察突變體在農(nóng)藝性狀以及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的變化，為有色稻育種提供優(yōu)良的種質(zhì)資源，也為利用輻照突變技術(shù)進(jìn)行有色稻育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為9311（揚(yáng)稻6號(hào)）干種子，由福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)研究所提供。將經(jīng)過(guò)鈷源輻射（300 Gy，50 min）的9311（揚(yáng)稻6號(hào)）種子M0種植于稻田中，成熟時(shí)單株收獲并鑒定糙米顏色，保留果皮為黑色或紅色的突變體。從M1代起采用系譜法，自交選育并保留果皮顏色紅色或黑色的理想單株。經(jīng)過(guò)連續(xù)5代選育的紅米與黑米突變體的性狀已經(jīng)穩(wěn)定。選取 M6代農(nóng)藝性狀好的黑稻突變體與紅稻突變體各1個(gè)，分別命名為R9311-01和R9311-02。具體育種經(jīng)過(guò)如表1所示。

表1 有色稻突變體選育過(guò)程Table1 Breeding process of colored rice mutants

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 突變體農(nóng)藝性狀測(cè)定 R9311-01、R9311-02以及突變體原始親本9311-CK于2019年3月種植于福建福州，按區(qū)組排列種植，不同株系按區(qū)分開(kāi)，每個(gè)株系3個(gè)小區(qū)。小區(qū)內(nèi)秧苗按8×8進(jìn)行排列，株行距20 cm×20 cm，單本插秧。按照常規(guī)田間管理?？疾觳诿咨⒉コ闅v期、株高、有效穗、總穗數(shù)、平均穗長(zhǎng)、實(shí)粒數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、空粒數(shù)、總粒穗、結(jié)實(shí)率、千粒重、單株重等主要農(nóng)藝性狀。

1.2.2 突變體營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)測(cè)定 取R9311-01、R9311-02以及9311-CK的干糙米各3份，研細(xì)混勻。采用雙波長(zhǎng)比色法測(cè)定直鏈淀粉、支鏈淀粉含量[16]；采用分光光度法測(cè)定黃酮含量[17]；采用示差法測(cè)定花色苷含量[18]；采用GB 5009.5-2016測(cè)定粗蛋白；采用GB5009.6-2016測(cè)定脂肪；采用GB5009.124-2016測(cè)定氨基酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻輻射突變及突變體農(nóng)藝性狀

對(duì)突變獲得的R9311-01、R9311-02以及9311-CK的主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行比較。R9311-01的糙米色為黑色，平均穗長(zhǎng)顯著低于9311-CK（P＜0.05）。R9311-02的糙米色為紅褐色，其千粒重顯著高于9311-CK（P＜0.05）。R9311-01、R9311-02的其他農(nóng)藝性狀與9311-CK均未達(dá)到顯著差異（表2）。

表2 突變體R9311-01、R9311-02和原始親本9311-CK的主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)Table2 Main agronomic traits of grains from R9311-01, R9311-02, and their parent 9311-CK

2.2 一般營(yíng)養(yǎng)成分、花色苷及黃酮含量

R9311-01的粗蛋白含量與9311-CK差異不顯著，而脂肪、直鏈淀粉、支鏈淀粉、黃酮、花色苷等營(yíng)養(yǎng)成分含量均極顯著高于9311-CK（P＜0.01），其中R9311-01的黃酮含量和花色苷含量分別是9311的2.19倍、40.87倍。R9311-02的粗蛋白、直鏈淀粉含量與對(duì)照9311差異不顯著，而脂肪、支鏈淀粉、黃酮、花色苷等營(yíng)養(yǎng)成分含量均極顯著高于對(duì)照9311（P＜0.01），其中黃酮含量和花色苷含量分別是9311的1.7倍、8.95倍。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，突變體R9311-01、R9311-02的一般營(yíng)養(yǎng)成分、花色苷及黃酮含量?jī)?yōu)于對(duì)照9311-CK（表3）。

2.3 氨基酸組成及含量比較

2.3.1 氨基酸組成 從R9311-01、R9311-02及9311-CK分別檢測(cè)到16種氨基酸，總量分別為：44.60 mg·g-1、40.56 mg·g-1、41.32 mg·g-1，兩者的氨基酸總量均與9311-CK差異不顯著。從R9311-01、R9311-02及9311-CK均是谷氨酸Glu含量最高，其次為亮氨算Leu，蛋氨酸Met含量最低（表4）。

2.3.2 必需氨基酸 利用氨基酸分析儀在3個(gè)樣品中分別檢測(cè)到7種必需氨基酸Lys、Phe、Met、Thr、Ile、Leu、Val，2種兒童必需氨基酸His和Arg。R9311-01的7種必需氨基酸除了蘇氨酸Thr外，其余6種均高于9311-CK，其中稻米的第一限制性氨基酸賴(lài)氨酸Lys的含量與9311-CK達(dá)到了顯著差異（P＜0.05）。R9311-01的兒童必需氨基酸His、Arg含量比9311-CK也有一定程度的提高。R9311-02的必需氨基酸除了Met比9311-CK高以外，其他的均比9311-CK低。

表3 R9311-01、R9311-02及9311-CK的一般營(yíng)養(yǎng)成分、黃酮及花色苷含量Table3 Contents of nutrients, flavonoids, and anthocyanins in grains from R9311-01, R9311-02, and 9311-CK

表4 R9311-01、R9311-02及9311-CK的氨基酸種類(lèi)及含量Table4 Types and contents of amino acids in grains from R9311-01, R9311-02, and 9311-CK （單位：mg·g-1）

2.3.3 風(fēng)味氨基酸含量與組成 R9311-01、R9311-02和9311-CK的風(fēng)味氨基酸含量如表5所示，R9311-01的苦味氨基酸含量高于9311-CK且差異顯著（P＜0.05），其余的風(fēng)味氨基酸均與9311-CK無(wú)顯著差異。R9311-02的所有的風(fēng)味氨基酸與9311-CK均無(wú)顯著差異。

2.3.4 不同結(jié)構(gòu)氨基酸比較 R9311-01含硫氨基酸與芳香族氨基酸均高于對(duì)照9311-CK，差異顯著（P＜0.05）。R9311-02的含硫氨基酸ΣSAA、支鏈氨基酸ΣBCAA、芳香族氨基酸ΣAAA與9311-CK均無(wú)顯著差異（表6）。

表5 R9311-01、R9311-02及9311-CK風(fēng)味氨基酸含量Table5 Contents of flavor amino acid in grains from R9311-01, R9311-02, and 9311-CK

表6 R9311-01、R9311-02及9311-CK不同結(jié)構(gòu)氨基酸含量Table6 Contents of amino acids of differed configurations in grains from R9311-01, R9311-02, and 9311-CK

3 討論與結(jié)論

本研究探討了經(jīng)γ射線輻射誘變后的有色稻突變體的農(nóng)藝性狀以及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的變化。本試驗(yàn)用了500 g9311種子進(jìn)行輻射，按照李珊對(duì)γ射線輻射的產(chǎn)生突變的試驗(yàn)結(jié)果[11]，近20 000粒種子的突變位點(diǎn)合集變異密度大，相當(dāng)于在水稻基因組中每100 bp就有一個(gè)突變，平均每個(gè)基因都會(huì)有好幾個(gè)突變位點(diǎn)，在如此多的突變基數(shù)下導(dǎo)致果皮顏色改變是可能的。由于誘變的種子多，工作量巨大，所以并未統(tǒng)計(jì)突變概率。除了9311外，本研究還對(duì)閩恢3301、蜀恢527、明恢86、CDR22進(jìn)行了輻射誘變。其中CDR22同時(shí)得到了紅米與黑米，其余的3個(gè)品種則是獲得誘變紅米或者誘變黑米。

在農(nóng)藝性狀方面，突變體R9311-01、R9311-02與原始親本9311-CK在播抽歷期、株高、有效穗、結(jié)實(shí)率、單株重等無(wú)顯著差異，說(shuō)明突變體繼承了9311優(yōu)良的農(nóng)藝性狀。這可能是有兩個(gè)方面的原因，一方面是γ射線輻射導(dǎo)致的突變是隨機(jī)的且沒(méi)有熱點(diǎn)[11]，突變體影響糙米色的基因發(fā)生改變而影響其他性狀的基因變異少。另一方面，經(jīng)過(guò)多代的自交以及定向篩選后也使得一些雜合的不良變異基因被剔除。除了果皮顏色改變外，突變體的平均穗長(zhǎng)與千粒重與野生型9311存在差異，這是由于輻射突變并非只引起一個(gè)位置發(fā)生突變，而是有大量的突變位點(diǎn)[19]。這些突變位點(diǎn)除了可能改變水稻的農(nóng)藝性狀外，還可能改變生物進(jìn)程，使各基因的表達(dá)時(shí)間與表達(dá)量發(fā)生變化，進(jìn)而改變水稻的其他農(nóng)藝性狀。

在營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)方面，突變體的脂肪含量、支鏈淀粉含量、黃酮含量以及花色苷含量均有顯著提升，其中R9311-01和R9311-02的黃酮含量分別是9311-CK的2.19倍和1.7倍，花色苷含量分別是40.87倍和8.95倍，黃酮與花色苷的大量累積是突變體糙米皮顏色發(fā)生改變的根本原因[20-21]。有色稻突變體的脂肪含量與支鏈淀粉含量高于對(duì)照CK-9311，粗蛋白與總氨基酸含量則無(wú)顯著差異，與張威毅等的研究結(jié)果不一致[22]。這可能是由于張威毅等對(duì)比的有色稻與白米親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而本研究所用的有色稻是直接由對(duì)照白米輻射得到的原因。此外，R9311-01的賴(lài)氨酸顯著高于9311-CK，作為水稻的第一限制性氨基酸[23]，賴(lài)氨酸的提高說(shuō)明R9311-01的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)有所改善。R9311-01的含硫氨基酸也有顯著提高，此類(lèi)氨基酸與動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)、免疫相關(guān)[24]。

綜上，利用輻射誘變對(duì)農(nóng)藝性狀好的9311進(jìn)行誘變、篩選，以培育出具有生產(chǎn)價(jià)值的有色稻新品種是可行的。