徐如玉，左明雪，袁銀龍，孫 杰，顧文杰，盧鈺升，解開(kāi)治 ，徐培智

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，廣東 廣州 510640）

0 引言

【研究意義】叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）作為一種分布最為廣泛的古老真菌，自然條件下能夠與90%以上的陸生植物根系形成菌根共生關(guān)系[1-3]。這種共生體形成，一方面能夠促進(jìn)作物對(duì)氮、磷、鉀等營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，減少化肥施用量[4]；另一方面，AM真菌可影響植物根際土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)[5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在前人的研究中，AM真菌對(duì)水稻、甘蔗、茶樹(shù)等作物的化肥減量已有相關(guān)報(bào)道。張淑娟等[4]通過(guò)盆栽試驗(yàn)研究水稻接種摩西管柄囊霉（Funneliformis mosseae）的表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)接種AM真菌可以有效促進(jìn)水稻生長(zhǎng)，促進(jìn)水稻產(chǎn)量的提高，和不接菌相比，每生產(chǎn)100 kg稻谷，氮肥、磷肥、鉀肥施用量分別減少3.14 kg、1.88 kg、2.42 kg，對(duì)化肥的削減程度高達(dá)47%。伍榮冬等[6]、張金蓮等[7]在大田甘蔗施用AM真菌，發(fā)現(xiàn)接種AM真菌可以增加甘蔗的株高和有效莖數(shù)，提高甘蔗產(chǎn)量10%～24%，并減少30%以上的化肥用量。趙青華等[8]采用盆栽方法研究了不同施氮量下接種摩西管柄囊霉對(duì)茶樹(shù)生長(zhǎng)、礦質(zhì)吸收元素及茶業(yè)品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)茶樹(shù)的施氮量為0.53 kg時(shí)，接種AM真菌后的茶樹(shù)，茶葉品質(zhì)的效果最佳，總干物質(zhì)量最大，為對(duì)照的1.63倍，經(jīng)計(jì)算，此施氮水平下接種AM真菌使氮肥吸收利用率增加了21.57%。但關(guān)于AM真菌對(duì)玉米上施用化肥減量的研究較少。趙乾旭等[9]在設(shè)施盆栽條件下通過(guò)接種摩西管柄囊霉發(fā)現(xiàn)，與不接種相比較，接種AM真菌提高了間作玉米的菌根侵染率、株高、植株生物量和氮含量，而顯著降低了玉米根系土壤中的堿解氮含量，經(jīng)計(jì)算，接種AM真菌使玉米的氮吸收利用效率提高了19.51%。摩西管柄囊霉是球囊霉屬的叢枝菌根真菌菌種，具有環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)，應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。劉銘銘等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，盆栽試驗(yàn)條件下接種摩西管柄囊霉能夠更好地促進(jìn)寄主植物的生長(zhǎng)，其菌根侵染率和孢子密度均高于異形根孢囊霉（Rhizophagus intraradices），經(jīng)計(jì)算增施摩西管柄囊霉可使玉米的氮利用率提高27.8%，而增施異形根孢囊霉玉米的氮利用率僅提高9.5%。【本研究切入點(diǎn)】早期關(guān)于AM真菌在促進(jìn)化肥減量的研究主要集中在磷肥減施方面，對(duì)氮肥減施增效的研究甚少，且大多數(shù)的研究主要局限于盆栽試驗(yàn)。廣東省是我國(guó)甜玉米的主產(chǎn)區(qū)，也是世界上優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)之一。當(dāng)前廣東省甜玉米復(fù)種指數(shù)高、氮肥施用集中且施用量大、利用效率低、環(huán)境污染嚴(yán)重等問(wèn)題突出。廣東省甜玉米氮肥減施增效技術(shù)的創(chuàng)新應(yīng)用對(duì)我國(guó)鮮食玉米減肥具有典型性和引領(lǐng)性。在大田上通過(guò)增施AM真菌來(lái)促進(jìn)甜玉米氮肥減施增效的研究鮮有報(bào)道，嚴(yán)重制約了AM真菌共生體在甜玉米生產(chǎn)中對(duì)氮肥減施增效潛力的挖掘?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以甜玉米為研究對(duì)象，采用大田區(qū)組試驗(yàn)，利用土壤常規(guī)理化指標(biāo)分析方法和Illumina Hiseq 2500高通量測(cè)序平臺(tái)，研究增施摩西管柄囊霉對(duì)甜玉米氮肥減量增效及土壤AM真菌多樣性的影響，探索甜玉米根際土壤AM真菌群落結(jié)構(gòu)的變化與氮利用率之間的關(guān)系，以期為甜玉米氮肥減量增效以及AM真菌肥在大田作物上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

定位試驗(yàn)位于廣東省惠州市惠陽(yáng)區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心試驗(yàn)基地（N23°8′46.19″, E113°20′47.84″），于2018年春季開(kāi)始，一年雙季栽培。試驗(yàn)區(qū)氣候類型為亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫為13～22℃，年平均降水量800～1 500 mm，土壤類型為磚紅壤，土壤理化性質(zhì)：堿解氮191.5 mg·kg-1、有效磷 59.1 mg·kg-1、速效鉀 224.1 mg·kg-1、pH 值 5.1、有機(jī)質(zhì)21.89 g·kg-1。

1.2 試驗(yàn)材料

供試甜玉米（Zea Mays L.）品種為粵甜28號(hào)，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供。

供試菌種為摩西管柄囊霉（Funneliformis mosseae,BGC NM04A），購(gòu)自北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源研究所，摩西管柄囊霉（F. mosseae）菌劑含被侵染的甜玉米植物根段、菌根真菌孢子及根外菌絲的根際砂土混合物，其孢子密度為40個(gè)·g-1，參考畢銀麗[11]的方法進(jìn)行室內(nèi)盆栽擴(kuò)繁，基質(zhì)采用風(fēng)化煤+砂土+蛭石+珍珠巖（1∶1∶1∶1）組合，接種前高壓滅菌（121℃，30 min）備用；甜玉米種子經(jīng)過(guò)10 min的10% H2O2消毒，洗凈置于培養(yǎng)箱28℃催芽備用，75%酒精盆缽消毒備用；將2.0 kg滅菌基質(zhì)放入盆缽中，澆水至土壤持水量75%，15 g菌劑平鋪，放入催芽后的甜玉米種子6粒，最后覆蓋約0.5 g基質(zhì)；出苗后7 d定苗4株·盆-1，采用自然光照、空調(diào)控溫的方式，溫度控制在白天為（25±2）℃，夜間（19±2）℃，相對(duì)濕度保持在65%。在播種后45 d每盆分別補(bǔ)施100 mL的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。最后收獲測(cè)定孢子含量備用。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)當(dāng)?shù)馗弋a(chǎn)栽培方式優(yōu)化最佳施肥量為：氮肥（N）330 kg·hm-2、磷肥（以 P2O5計(jì)）150 kg·hm-2、鉀肥（以K2O計(jì)）225 kg·hm-2。試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)施氮水平：（1）N0，不施氮肥；（2）N17.6，施氮肥264 kg·hm-2；（3）N19.8，施氮肥 297 kg·hm-2；（4）N22，施氮肥330 kg·hm-2；同一施氮水平下設(shè)增施摩西管柄囊霉（AMF+）315 kg·hm-2和不施（AMF-）2個(gè)裂區(qū)，共8個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，各小區(qū)面積67.5 m2（4.5 m×15 m），隨機(jī)區(qū)組排列。

各小區(qū)磷、鉀肥施用量相同，施磷肥（以P2O5計(jì)）150 kg·hm-2、鉀肥（以 K2O 計(jì)）225 kg·hm-2，磷肥品種為過(guò)磷酸鈣（P2O512%），鉀肥品種為硫酸鉀（K2O 50%）。氮肥使用尿素（N 46%），在基肥、苗期、拔節(jié)期分別以2∶3∶5的比例施入，磷肥一次性基施，鉀肥在基肥和拔節(jié)期分別以5∶5的比例施入。所有基肥按試驗(yàn)設(shè)計(jì)施用量起壟撒施旋耕。甜玉米幼苗移栽時(shí)接摩西管柄囊霉（F. mosseae）菌劑，每個(gè)定植穴接種7 g。甜玉米種植密度為45 000株·hm-2，起壟種植，其他栽培管理措施與當(dāng)?shù)亓?xí)慣相同。

1.4 樣品采集方法

供試土壤樣品采集于2019年秋季甜玉米生長(zhǎng)時(shí)期的成熟期，參照Z(yǔ)hao等[12]的根際土采集方法在每個(gè)小區(qū)采集4株長(zhǎng)勢(shì)均勻的植株根際土壤，然后把采集的根際土壤均勻混合，分成2份，1份約2 000 g室溫保存帶回用于土壤理化性質(zhì)和孢子含量的測(cè)定；1份約500 g放入無(wú)菌密封袋密封后用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室后-80℃保存，用于檢測(cè)AM真菌群落的多樣性。

供試植株根系樣品采集于成熟期的甜玉米根系，用細(xì)流量的清水沖洗干凈后，置于FAA固定液（70%的酒精、甲醛、冰醋酸按照體積比90∶5∶5的比例混合而成）中固定24 h以上，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

甜玉米鮮苞產(chǎn)量采用全小區(qū)實(shí)收測(cè)產(chǎn)的方式進(jìn)行。

1.5 理化性質(zhì)的測(cè)定方法

土壤pH值采用酸度計(jì)，全氮采用凱氏定氮法，全磷和全鉀經(jīng)消煮后，采用鉬銻抗比色法和火焰光度法，有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法[13]；土壤呼吸采用室內(nèi)密閉培養(yǎng)法等進(jìn)行測(cè)定[14]；堿解氮采用堿解擴(kuò)散法，土壤速效磷采用氟化銨浸提（酸性土）鉬銻抗比色法，速效鉀采用乙酸銨浸提火焰光度法，硝態(tài)氮、銨態(tài)氮采用氯化鉀浸提流動(dòng)注射分析法進(jìn)行測(cè)定[15]。

1.6 菌根侵染率和孢子含量測(cè)定方法

菌根侵染率采用臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行染色、脫色、制片、鏡檢[16]。采用濕篩傾注蔗糖離心法檢測(cè)甜玉米根際土壤中孢子含量[17-18]。

1.7 擴(kuò)增子試驗(yàn)分析方法

采用土壤DNA提取試劑盒（MinkaGene Soil DNA Kit）對(duì)土壤樣品進(jìn)行總DNA的提取，利用NanoDrop One檢測(cè)DNA的完整性、純度和濃度。利用AM真菌特異性引物對(duì)24個(gè)樣品AM真菌的DNA擴(kuò)增采用巢式PCR。兩輪擴(kuò)增引物為：第一輪包括AML1F（5 ′-ATCAACTTTCGATGGTAGGATAGA-3 ′）和AML2R（5′-GAACCCAAACACTTTGGTTTCC-3′），第二輪包括 AMV4.5NF（5′-AAGCTCGTAGTTGAA TTTCG-3′）和 AMDGR（5′-CCCAACTATCCCTAT TAATCAT-3′）[19]，利用上述引物對(duì)AM真菌進(jìn)行目標(biāo)片段擴(kuò)增。第一輪PCR反應(yīng)體系為：2×PCR Mix 25 μL，50 ng DNA 模板，10 μmol·L-1正、反向引物各1 μL，加ddH2O至50 μL；第二輪PCR反應(yīng)體系為：2×PCR Mix 10 μL，50 ng DNA模板，10 μmol·L-1正、反向引物各 0.4 μL，加 ddH2O 至 20 μL。兩輪PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸30 s（第一輪重復(fù)20個(gè)循環(huán)，第二輪重復(fù)36個(gè)循環(huán)）；72℃延伸8 min，4℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的片段和濃度，Pooling及切膠純化，制備文庫(kù)后，委托廣東美格基因科技有限公司應(yīng)用Illumina Hiseq 2500平臺(tái)對(duì)構(gòu)建的擴(kuò)增子文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.8 參數(shù)計(jì)算方法

1.8.1 氮素利用效率相關(guān)參數(shù)的計(jì)算方法[20-22]

氮肥農(nóng)學(xué)效率（NAE，kg籽?！g-1N）=（施氮區(qū)產(chǎn)量-對(duì)照區(qū)產(chǎn)量）/施氮量

氮肥偏生產(chǎn)力（PFP，kg籽?！g-1N）=施氮區(qū)鮮苞產(chǎn)量/施氮量

氮肥吸收利用率（NRE，%）=（施氮區(qū)地上部分吸氮量-對(duì)照區(qū)地上部分吸氮量）×100/施氮量

氮素生理利用率（NPE，kg籽?！g-1N）=（施氮區(qū)鮮苞產(chǎn)量-對(duì)照區(qū)鮮苞產(chǎn)量）/（施氮區(qū)地上部吸氮量-對(duì)照區(qū)地上部吸氮量）

1.8.2 菌根侵染率計(jì)算方法[23]

菌根侵染率/%=有菌根根段數(shù)/總根段數(shù)×100

根系中的菌根侵染強(qiáng)度/%=（95×侵染率90%以上根段數(shù)+70×侵染率50%至90%的根段數(shù)+30×侵染率10%至50%的根段數(shù)+5×侵染率10%以下1%以上根段數(shù)+侵染率1%以下根段數(shù)）/總根段數(shù)×100

1.8.3 Alpha多樣性指數(shù)計(jì)算方法[24-26]

其中，Schao1為估計(jì)的OUT數(shù)，Sobs為實(shí)際觀測(cè)到的OTU數(shù)，n1為只含有一條序列的OTU數(shù)目，n2為只含有兩條序列的OTU數(shù)目，以此類推。

Dominance=，其中，pi為OTUi在全部OTU中的比例。

其中，ni為含有i條序列的OTU數(shù)目，N為所有的序列數(shù)。

1.9 數(shù)據(jù)分析與處理

本試驗(yàn)圖表制作和統(tǒng)計(jì)分析采用Excel 2010和SPSS 20.0，施菌處理和施氮水平及其交互作用的差異顯著性采用雙因素方差分析（two-way ANOVA）進(jìn)行檢驗(yàn)，不同處理之間的差異顯著性采用Duncan’s多重檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)（P＜0.05）。Alpha多樣性指數(shù)和Anosim分析使用R軟件（R-3.2.2）進(jìn)行分析繪圖；Observed-species指數(shù)稀釋曲線數(shù)據(jù)計(jì)算采用QIIME軟件；冗余分析（RDA）首先使用R軟件進(jìn)行去趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析，然后使用進(jìn)行cca或rda分析并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)甜玉米侵染率、侵染強(qiáng)度、土壤孢子密度的影響

甜玉米收獲期侵染率測(cè)定結(jié)果表明（表1），甜玉米根系A(chǔ)M真菌的侵染率隨著施氮水平的提高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。在N19.8時(shí)侵染率最高，N22時(shí)侵染率下降，表明施氮量過(guò)高會(huì)不利于AM真菌對(duì)甜玉米根系的侵染。在AMF-裂區(qū)中，侵染率最大為78.67%，最小為58.00%，各處理間差異顯著（P＜0.05）；在AMF+裂區(qū)中，侵染率最大為93.00%，最小為81.00%，N19.8AM處理的侵染率最大，其他3個(gè)處理之間并無(wú)顯著差異。侵染強(qiáng)度在各處理間差異顯著（P＜0.05），其中，在N22AM處理中侵染強(qiáng)度最大，其次是N0AM處理。孢子密度和侵染率的變化規(guī)律一致，隨著施氮水平的提高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，N19.8時(shí)孢子密度最高，N22時(shí)孢子密度下降。

2.2 不同處理對(duì)甜玉米鮮苞產(chǎn)量和氮素養(yǎng)分吸收利用的影響

施菌和施氮水平及其交互作用的雙因素方差分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，施氮和施菌的交互作用對(duì)鮮苞產(chǎn)量的影響顯著（P=0.024＜0.05）。由圖1可見(jiàn)，在N22、N19.8、N17.6和N0施氮水平下，增施摩西管柄囊霉劑后，甜玉米的鮮苞產(chǎn)量均有所增加，分別較不施菌裂區(qū)組增加了0.8%、8.0%、16.7%和32.6%；在N22施氮水平下，增施摩西管柄囊霉劑后甜玉米的鮮苞產(chǎn)量與不施菌裂區(qū)組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05），在其他施氮水平下，增施摩西管柄囊霉劑后甜玉米的鮮苞產(chǎn)量差異顯著（P＜0.05）?？傮w而言，在高氮水平下增施摩西管柄囊霉劑效果不顯著，在低氮水平下效果顯著。

由表2可見(jiàn)，在AMF-裂區(qū)中，各處理的氮肥農(nóng)學(xué)效率（NAE）、氮肥偏生產(chǎn)力（PFP）、氮肥吸收利用率（NRE）、氮素生理利用率（NPE）均隨著施氮量的增加而增加。NPE在N22和N19.8處理之間并無(wú)顯著差異，但與N17.6處理差異顯著（P＜0.05）。在AMF+裂區(qū)中，N22AM處理的NAE、NPE均高于其他處理，PFP在3個(gè)施氮水平之間并無(wú)顯著差異。增施摩西管柄囊霉劑不同施氮水平的NAE、PFP、NRE和NPE均有所增加。在N17.6施氮水平時(shí)，NAE、PFP和NRE相比不施菌處理增加幅度最大，分別增加6.84%、6.85%和11.49%；在N22施氮水平時(shí)，增施摩西管柄囊霉劑NPE增加了6.19%；NRE以N17.6 AM處理最高，達(dá)到48.26%。

表1 不同處理甜玉米的侵染率、侵染強(qiáng)度和土壤孢子密度Table1 Infection rate and intensity of sweet corn plants and spore density in soil under various treatments

圖1 不同處理對(duì)甜玉米鮮苞產(chǎn)量的影響Fig.1 Yield of sweet corn as affected by various treatments

2.3 稀釋性曲線（Observed-species）分析

通過(guò)Illumina Hiseq 2500測(cè)序平臺(tái)，對(duì)24個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)序，共獲得1 558 461條高質(zhì)量序列，樣品內(nèi)的AM真菌全部為球囊菌綱（Glomeromycetes）。以97%的一致性將序列聚類成為15 771個(gè)AM真菌的OTUs，繪制成圖2的稀釋曲線。當(dāng)測(cè)序深度達(dá)到80 000條序列時(shí)，各處理的Observed-species指數(shù)上升速度緩慢，曲線逐漸趨向平緩，說(shuō)明測(cè)序深度可以反映樣品中絕大多數(shù)的AM真菌多樣性信息。

2.4 Alpha多樣性指數(shù)分析

Alpha多樣性參數(shù)值見(jiàn)表3，N22AM處理的Chao1指數(shù)和Richness指數(shù)顯著高于其他處理（P＜0.05）,表明N22AM處理的AM真菌菌群的豐富度最高，其次是N19.8、N19.8AM和N17.6AM處理；增施摩西管柄囊霉劑后，各施氮水平的Dominance指數(shù)較不施菌裂區(qū)均有所增加，說(shuō)明增施摩西管柄囊霉劑后各處理的AM真菌物種分布較不施菌裂區(qū)更為集中；各處理的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在增施摩西管柄囊霉劑后均有所降低，這說(shuō)明增施摩西管柄囊霉劑，各處理的AM真菌群落組成的優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)集中。其中，N0AM處理的Dominance指數(shù)顯著高于其他處理，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)顯著低于其他處理（P＜0.05），說(shuō)明N0AM處理的AM真菌群落組成的優(yōu)勢(shì)菌種相對(duì)集中。

2.5 AM真菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

各處理相對(duì)豐度≥1%的AM真菌屬組成情況如圖3所示。各處理中AM真菌群落主要由球囊霉屬（Glomus）、近明球囊霉屬（Claroideoglomus）和類球囊霉屬（Paraglomus）組成，占各處理AM真菌總豐度的38.51%以上，而這3個(gè)菌屬在N0AM處理中所占比例最大，達(dá)到了74.22%；增施摩西管柄囊霉劑后，球囊霉屬在N17.6AM處理增加了9.18%，與其他處理差異顯著（P＜0.05）；近明球囊霉屬在N0AM處理增加了17.85%，與其他處理差異顯著（P＜0.05）；類球囊霉屬在增施摩西管柄囊霉劑后在N0AM、N17.6AM和N22AM處理中均有所下降，在N17.6AM下降幅度最大，下降了12.62%，但無(wú)顯著差異（P＞0.05）；無(wú)梗囊霉屬（Acaulospora）在N22處理中所占的比例最大；原囊霉屬（Archaeospora）在各處理之間無(wú)顯著差異。

表2 不同處理的甜玉米氮素利用效率Table2 N utilization efficiencies of sweet corn plants grown under various treatments

圖2 Observed-species的稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves of observed species

2.6 AM真菌群落結(jié)構(gòu)與根際土壤環(huán)境因子的冗余分析（RDA）

冗余分析可綜合反應(yīng)土壤理化因子與AM真菌群落間的關(guān)系及相關(guān)程度。由圖4所示，圖4（a）第一排序軸和第二排序軸分別解釋了91.59%和5.20%，圖4（b）第一排序軸和第二排序軸分別解釋了83.35%和12.35%，都較好地解釋了AM真菌群落特征與根際土壤理化性質(zhì)間的關(guān)系。不同的環(huán)境因子對(duì)AM真菌屬的影響不同，在AMF-裂區(qū)中，球囊霉屬相對(duì)豐度與全鉀（Total potassium）、速效鉀（Available potassium）、pH、銨態(tài)氮（Ammonium nitrogen）、硝態(tài)氮（Nitrate nitrogen）、堿解氮（Alkaline nitrogen）、速效磷（Available phosphorus）呈正相關(guān)，與其他理化指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)；原囊霉屬、無(wú)梗囊霉屬、類球囊霉屬、近明球囊霉屬相對(duì)豐度與全鉀含量和速效鉀含量呈正相關(guān)，與其他理化指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)。其中，土壤呼吸（Soil respiration）、堿解氮、pH、速效鉀與AM真菌群落特征的相關(guān)性較大。在AMF+裂區(qū)中，球囊霉屬相對(duì)豐度與全鉀、速效磷、堿解氮、全氮（Total nitrogen）、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、土壤呼吸和有機(jī)質(zhì)（Organic matter）呈正相關(guān)，與其他理化指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)；原囊霉屬、無(wú)梗囊霉屬、類球囊霉屬和近明球囊霉屬相對(duì)豐度與pH、速效鉀、全鉀、速效磷和全磷（Total phosphorus）呈正相關(guān)，與其他理化指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，其中，pH、全磷、速效磷、速效鉀、堿解氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和土壤呼吸與AM真菌群落特征的相關(guān)性較大。

2.7 AM真菌多樣性指數(shù)與菌根侵染率、侵染強(qiáng)度、土壤孢子密度和氮素利用率之間的關(guān)系

由表4可知，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)與菌根侵染率、孢子密度和4種氮素利用率之間均有一定的相關(guān)性。特別是增施摩西管柄囊霉劑后，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)與菌根侵染率、孢子密度、氮肥農(nóng)學(xué)效率（NAE）、氮肥偏生產(chǎn)力（PFP）、氮肥吸收利用率（NRE）和氮素生理利用率（NPE）呈顯著或者極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05或P＜0.01）。增施摩西管柄囊霉劑顯著增加了AM菌多樣性指數(shù)與菌根侵染率、土壤孢子密度和氮素利用率之間的相關(guān)性。

表3 土壤樣品的AM真菌α多樣性指數(shù)分析Table3 Diversity indices of AM fungi in soil samples

圖3 屬水平上相對(duì)豐度≥1%的物種組成Fig.3 Relative abundances of microbial genera with relative abundance ≥1%

圖4 土壤樣品AM真菌群落與土壤理化因子的RDA分析Fig.4 RDA analyses on AM fungal community in and chemical properties of soil samples

表4 AM真菌多樣性指數(shù)與菌根侵染率、土壤孢子密度和氮素利用率之間的關(guān)系Table4 Relationship between AM fungal diversity index and mycorrhizal infection rate, spore density, and N utilization rate of soil

2.8 增施摩西管柄囊霉劑對(duì)甜玉米化學(xué)氮肥減施增效的機(jī)理

通過(guò)對(duì)增施摩西管柄囊霉劑和不增施兩個(gè)裂區(qū)甜玉米生長(zhǎng)指標(biāo)的影響比較發(fā)現(xiàn)（圖5），4個(gè)施氮水平的N0、N17.6和N19.8水平，在增施摩西管柄囊霉劑后侵染率、侵染強(qiáng)度、孢子密度、氮利用率（NAE、PFP、NRE和 NPE）、真菌多樣性指數(shù)（Shannon和Simpson）、鮮苞產(chǎn)量和收獲期地上部分氮積累量均和不施菌裂區(qū)有顯著或極顯著的差異，孢子密度分別與氮肥農(nóng)學(xué)效率和甜玉米鮮苞產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.991、0.977。說(shuō)明增施摩西管柄囊霉劑能極顯著提高N0、N17.6和N19.8施氮水平的AMF侵染率、侵染強(qiáng)度和孢子密度，進(jìn)而影響氮利用率指標(biāo)（NAE、PFP、NRE和NPE）的顯著提高，改善甜玉米根際土壤AMF群落結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)化學(xué)氮肥減施增效，甜玉米穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)與品質(zhì)提升。

3 討論

AM真菌作為一種古老的共生真菌對(duì)甜玉米根系土壤中氮素的吸收利用產(chǎn)生了重要的影響，反之不同的施氮量也影響了甜玉米根系土壤AM真菌群落結(jié)構(gòu)的組成，進(jìn)而影響甜玉米植株氮素代謝。

3.1 增施AM真菌對(duì)菌根侵染率、侵染強(qiáng)度、孢子密度、玉米產(chǎn)量和氮素吸收利用的影響

圖5 增施摩西管柄囊霉劑對(duì)甜玉米化學(xué)氮肥減施增效機(jī)理Fig.5 Mechanism of F. mosseae on N utilization by sweet corn plants

已有研究結(jié)果表明，土壤中氮素含量過(guò)高將會(huì)降低AM真菌對(duì)寄主植物的侵染率，反之在氮含量較少的土壤中更有利于其對(duì)寄主植物的侵染[27-29]，這與本研究結(jié)果一致。甜玉米根系的侵染率在一定范圍內(nèi)隨著施氮水平的升高而升高，當(dāng)在N19.8時(shí)侵染率最高，N22施氮水平時(shí)，侵染率下降，表明施氮量過(guò)高不利于AM真菌對(duì)甜玉米根系的侵染；土壤孢子密度和菌根侵染率規(guī)律一致，孢子密度隨著施氮水平的升高而增加，當(dāng)在N19.8時(shí)孢子密度最高，N22施氮水平時(shí)孢子密度下降，這說(shuō)明土壤中氮素含量豐富時(shí)，AM真菌的孢子密度將會(huì)降低，原因可能是氮豐富的土壤中存在大量的硝酸根離子，會(huì)影響土壤pH的變化，從而刺激或者抑制AM真菌的產(chǎn)孢性能，這與Delowarn K[30]和任愛(ài)天[31]的研究結(jié)果一致。

增施AM真菌能促進(jìn)玉米的生長(zhǎng)和氮素利用率的提高。姜德鋒等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在不施P肥的條件下，接種AM真菌可使玉米增產(chǎn)23%。羅廣寧等[33]研究發(fā)現(xiàn)，AM真菌對(duì)玉米增產(chǎn)起重要作用，增產(chǎn)率達(dá)18.02%～26.6%。趙乾旭等[9]研究發(fā)現(xiàn)，接種AM真菌能更好地促進(jìn)玉米的生長(zhǎng)及氮肥利用效率的提高，接種AM真菌使玉米的氮吸收利用效率提高了19.51%。李芳等[34]研究結(jié)果表明，玉米接種AM菌后，可以顯著提高籽粒產(chǎn)量和養(yǎng)分含量。江彬等[35]研究發(fā)現(xiàn)土壤缺氮條件下，增施AM真菌更能促進(jìn)植株對(duì)養(yǎng)分的吸收。本研究結(jié)果表明增施摩西管柄囊霉劑后，4個(gè)施氮水平的甜玉米鮮苞產(chǎn)量均有所增加。在N0、N17.6和N19.8施氮水平下，裂區(qū)間甜玉米的鮮苞產(chǎn)量差異顯著（P＜0.05），相比不增施摩西管柄囊霉劑的處理，甜玉米鮮苞產(chǎn)量分別增加了32.6%、16.7%和8.0%，與前人研究結(jié)果一致。但在N22施氮水平下，裂區(qū)間甜玉米的鮮苞產(chǎn)量無(wú)顯著性差異。本研究中，增施摩西管柄囊霉劑后，不同施氮水平的氮肥農(nóng)學(xué)效率、氮肥偏生產(chǎn)力和氮素生理利用率均有所增加，且在N17.6施氮水平時(shí)，氮肥農(nóng)學(xué)效率、氮肥偏生產(chǎn)力和氮肥吸收利用率增加幅度最大，分別較不施菌裂區(qū)增加6.84%、6.85%和11.49%。這說(shuō)明增施AM真菌能促進(jìn)植物對(duì)氮素的吸收和利用[36-38]。但增施摩西管柄囊霉劑對(duì)甜玉米產(chǎn)量和氮素養(yǎng)分吸收利用效率的具體貢獻(xiàn)值尚需結(jié)合供試菌株基因標(biāo)記和同位素示蹤等方法進(jìn)行進(jìn)一步探討。

3.2 不同施肥量對(duì)植物根際土壤微AM真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響

施肥能夠顯著影響土壤微生物的多樣性[39-41]。蔣雨含[42]在研究不同施肥處理對(duì)設(shè)施番茄生長(zhǎng)及叢枝菌根真菌群落的影響表明，在不同施肥處理下，番茄根際土壤中的叢枝菌根真菌群落多樣性差異顯著。李冬冬等[43]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期定位施肥能夠改變土壤的理化性質(zhì)，從而改變了AM真菌生長(zhǎng)的環(huán)境，進(jìn)而對(duì)AM真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。在本研究中，N22AM處理的Chao1和Richness指數(shù)最高，說(shuō)明優(yōu)化施肥增施摩西管柄囊霉劑后甜玉米根際土壤的AM真菌菌群的豐富度最高；各處理的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在增施AM真菌后均有所下降，說(shuō)明增施摩西管柄囊霉劑后，各處理的AM真菌群落組成的優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)集中。

已有研究表明，農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，肥料的使用會(huì)影響AM真菌群落結(jié)構(gòu)的組成，尤其是氮素的過(guò)量投入，會(huì)改變AM真菌群落的組成[44-45]。但在不同的生境條件下，AM真菌同屬的豐度差異明顯。郝杰等[46]在研究施氮對(duì)黃土高原旱地小麥根際AM真菌群落結(jié)構(gòu)的影響中發(fā)現(xiàn)，不同施氮處理下，類球囊屬（Paraglomus）、球囊霉屬（Glomus）、近明球囊霉屬（Claroideoglomus）為黃土高原小麥根際土壤中AM真菌群落的優(yōu)勢(shì)屬，相對(duì)豐度占到總菌群的95%以上。宋福強(qiáng)等[47]在研究黑土農(nóng)田中施加AM菌劑對(duì)大豆根際菌群結(jié)構(gòu)的影響中發(fā)現(xiàn)，施加AM真菌后，從大豆根際土壤中共分離獲得3種無(wú)梗囊霉屬（Acaulospora）和7種球囊霉屬的AM真菌。王慶峰等[48]在分析長(zhǎng)期施用氮肥和磷肥對(duì)東北黑土叢枝菌根真菌群落組成的影響中表明，長(zhǎng)期施用氮肥以及氮、磷肥混施顯著改變AM真菌群落的組成，在屬水平上，球囊霉屬、近明球囊霉屬、類球囊霉屬和巨孢囊霉屬（Gigaspora）相對(duì)豐度在各處理間具有顯著差異。本研究對(duì)AM真菌群落結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，球囊霉屬、近明球囊霉屬、類球囊霉屬、無(wú)梗球囊霉屬和原囊霉屬是8個(gè)處理共有的5個(gè)AM真菌屬，球囊霉屬、近明球囊霉屬和類球囊霉屬是8個(gè)處理共有的優(yōu)勢(shì)AM真菌屬，其中，球囊霉屬在N17.6AM處理中所占的比重最高，為44.14%。不同生境下AM真菌屬水平的豐度差異可能主要是由宿主的種類、土壤理化性質(zhì)和氣候條件等因素導(dǎo)致的。

3.3 AM真菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子之間的相關(guān)性

冗余分析結(jié)果顯示，增施摩西管柄囊霉劑和不增施裂區(qū)各解釋了96.79%和95.7%的AM真菌群落與環(huán)境變量之間的關(guān)系，說(shuō)明所選理化性質(zhì)能夠較好地分析AM真菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的相關(guān)程度。Monte Carlo檢驗(yàn)顯示，在不增施摩西管柄囊霉劑的處理中，土壤呼吸（P=0.044，解釋量為47.84%）對(duì)AM真菌群落組成的影響最為顯著；在增施摩西管柄囊霉劑的處理中，土壤全磷（P=0.026，解釋量為57.84%）、速效鉀（P=0.004，解釋量為69.70%）和土壤呼吸（P=0.018，解釋量為62.18%）對(duì)AM真菌群落組成的影響最為顯著。胡從從等[49]和劉佳[50]研究表明AM真菌多樣性與有效磷存在正相關(guān)關(guān)系，這與本文研究結(jié)果一致。土壤呼吸反映了土壤微生物的活性[51]，在增施摩西管柄囊霉劑的處理中土壤呼吸的解釋量遠(yuǎn)大于不增施處理，這說(shuō)明增施摩西管柄囊霉劑后增加了土壤AM真菌的微生物活性。肖龍敏[52]研究發(fā)現(xiàn)AM真菌物種豐度與速效鉀呈顯著正相關(guān)，這與本文的研究結(jié)果一致。

不同種類的AM真菌對(duì)土壤酸堿度的耐受性不同，張美慶等[53]和Verena S等[54]研究發(fā)現(xiàn)，球囊霉屬在pH為5～9的土壤中分布廣泛，與pH呈正相關(guān)關(guān)系；蔡曉布等[55]研究發(fā)現(xiàn)球囊霉屬與pH呈正相關(guān)關(guān)系，無(wú)梗球囊霉屬與pH呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，無(wú)梗球囊霉屬在有機(jī)質(zhì)含量為0.9～19.6 g·kg-1時(shí)，與有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān)關(guān)系，球囊霉屬和無(wú)梗球囊霉屬與有效磷含量呈正相關(guān)，與本研究結(jié)果基本一致。不同的是本研究無(wú)梗球囊霉屬與pH呈正相關(guān)關(guān)系。

3.4 AM真菌多樣性與菌根侵染率、侵染強(qiáng)度、孢子密度、氮素生理利用率的相關(guān)性

在增施摩西管柄囊霉劑后，顯著增加了Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)與菌根侵染率、孢子密度、4種氮利用率（NAE、PFP、NRE和NPE）之間的相關(guān)性。這說(shuō)明，增施摩西管柄囊霉劑后，改善了AM真菌群落結(jié)構(gòu)，各處理的AM真菌群落組成的優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)集中，顯著增加了孢子密度、侵染率的相關(guān)性。增施摩西管柄囊霉劑后，各施氮水平上的Dominance指數(shù)均有所上升，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均有所下降，這說(shuō)明增施摩西管柄囊霉劑后的處理，AM真菌群落組成的優(yōu)勢(shì)菌屬分布更為集中。摩西管柄囊霉劑能促進(jìn)植株對(duì)土壤氮素養(yǎng)分的吸收，從而提高了氮素利用率，這與趙青華等[8]和趙乾旭[9]研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

（1）增施摩西管柄囊霉劑可提高甜玉米的鮮苞產(chǎn)量。N19.8水平AM真菌侵染率、孢子密度最高，且與增施摩西管柄囊霉劑存在正交互效應(yīng)（P＜0.001）。N19.8AM處理田間鮮苞產(chǎn)量與N22處理無(wú)顯著差異，可作為甜玉米氮肥減施的推薦施肥方式。

（2）增施摩西管柄囊霉劑能在一定程度上改善植物的氮素營(yíng)養(yǎng)狀況，促進(jìn)植物對(duì)氮素的吸收和利用。在N17.6施氮水平時(shí)，氮肥農(nóng)學(xué)效率、氮肥偏生產(chǎn)力和氮肥吸收利用率增加幅度最大，分別較未增施裂區(qū)增加6.84%、6.85%和11.49%。

（3）增施摩西管柄囊霉劑后各處理的AM真菌群落組成的優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)集中，球囊霉屬在N17.6AM處理增加了9.18%，與其他處理差異顯著（P＜0.05）。增施摩西管柄囊霉劑后，顯著增加了Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)與侵染率、孢子密度和4種氮素利用率（NAE、PFP、NRE和NPE）之間的相關(guān)性（P＜0.05）。