韓 爽,張 健,井月欣,王 萍,3,王共明,劉 芳,劉 奎,劉海超,趙云蘋

(1.山東省海洋資源與環(huán)境研究院,山東煙臺 264006; 2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306; 3.煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東煙臺 264005)

目前,全球工業(yè)酶的銷售額超過數(shù)十億美元,且預(yù)計在未來會有進(jìn)一步的增長[1]。蛋白酶是三大工業(yè)酶之一,廣泛應(yīng)用于洗滌劑、皮革、醫(yī)藥等各個行業(yè)[2]。蛋白酶分布廣泛,主要來源于植物的莖葉、果實,動物的腺體、內(nèi)臟以及微生物[3]。隨著蛋白酶需求量的逐年攀升,動植物源的蛋白酶已經(jīng)難以滿足人們的需求,微生物源蛋白酶卻顯示出諸多優(yōu)勢[4]。與傳統(tǒng)的蛋白酶提取方法相比,采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)蛋白酶不僅不受原料限制、營養(yǎng)需求低,且提取工藝簡單、周期短、蛋白酶回收率高,更容易實現(xiàn)自動化大規(guī)模生產(chǎn),具有廣闊的市場價值和突出的社會環(huán)保效益[5]。

從20世紀(jì)80年代起,微生物蛋白酶取代了很多動植物蛋白酶,在食品制作、洗滌劑生產(chǎn)、皮革軟化、紙漿和紙張生產(chǎn)等行業(yè)都發(fā)揮著重要的作用[1]。近年來,我國著力于基礎(chǔ)研究,在微生物蛋白酶的理化性質(zhì)、作用機(jī)制以及純化技術(shù)等方面的研究均有重大突破。國外注重高產(chǎn)菌株以及蛋白酶新產(chǎn)品的開發(fā),在傳統(tǒng)實驗與誘變技術(shù)和基因工程技術(shù)的結(jié)合上發(fā)展迅速[6]。從極端環(huán)境中分離微生物并制得微生物蛋白酶,結(jié)合基因工程、酶工程及誘變技術(shù)優(yōu)化菌種選育方法、增加蛋白酶的開發(fā)利用將仍是研究熱點。本文針對微生物源的選擇、目的菌株的篩選培養(yǎng)方式、蛋白酶的純化方法、酶活力的調(diào)控及微生物蛋白酶的應(yīng)用等研究熱點,進(jìn)行了歸納總結(jié),并對下一步的研究進(jìn)行了展望。

1 蛋白酶的微生物源及其類型

動植物蛋白酶,在很多行業(yè)中發(fā)揮著重要的作用,但該類蛋白酶往往生產(chǎn)成本高、產(chǎn)酶效率低,難以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。微生物是目前蛋白酶的優(yōu)良來源、主要生產(chǎn)者[7]。產(chǎn)蛋白酶的微生物種類繁多,但作為工程菌需要滿足無毒、無致病性,可以在短時間內(nèi)生產(chǎn)大量蛋白酶[8]等要求。經(jīng)過多年的發(fā)展,目前用于生產(chǎn)蛋白酶的微生物主要有細(xì)菌、霉菌和放線菌[4-5,9],其常見的產(chǎn)蛋白酶菌株以及所產(chǎn)蛋白酶類型見表1。

表1 微生物源及其所產(chǎn)蛋白酶類型Table 1 Microbial sources and types of proteases produced

如表1所示,細(xì)菌中有相對較多的菌株可用于蛋白酶的生產(chǎn),但部分種屬的菌株存在毒性和致病性,在進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)時需經(jīng)篩選。霉菌的應(yīng)用歷史久遠(yuǎn),在醬類制品的制作中發(fā)揮著重要的作用[23]。有關(guān)放線菌所產(chǎn)蛋白酶的研究近年來也不斷增長,受到越來越多的關(guān)注。

蛋白酶的分類方法眾多,比較常見的是根據(jù)酶的最適pH及溫度進(jìn)行分類?；诓煌钸mpH,蛋白酶可以分為酸性、中性和堿性蛋白酶[9]。霉菌所產(chǎn)蛋白酶中,酸性蛋白酶種類更多,酶的特點也更為顯著。毛霉和根霉所產(chǎn)的酸性蛋白酶凝結(jié)活性強(qiáng),專一性較高;米曲霉所產(chǎn)的酸性蛋白酶酶活力高,有助于蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生風(fēng)味性物質(zhì)[18-19]。從煙曲霉中提取的酸性蛋白酶耐酸性較強(qiáng),穩(wěn)定性較好[24]。細(xì)菌源蛋白酶中,堿性蛋白酶的研究更充分、應(yīng)用范圍更廣闊。雖然可以分泌堿性蛋白酶的微生物種類繁多,可以從鹽堿土、沙地、深海等偏堿性環(huán)境中分離獲取[9],但目前工業(yè)上主要應(yīng)用的菌株仍是芽孢桿菌[11-13,16,25]。芽孢桿菌除了是堿性蛋白酶的主要來源外,也是中性蛋白酶的主要來源,截止至目前,全球的大約50%的中性蛋白酶由芽孢桿菌生產(chǎn)[26]。中性蛋白酶因可在中性pH條件下水解動植物蛋白生成小分子多肽[27-28],可用于釀造業(yè)等發(fā)酵行業(yè)[29]。放線菌蛋白酶是近年來新興的蛋白酶,主要類型有中性和堿性,這兩類酶在扇貝加工廢棄物處理中有所應(yīng)用[30]。當(dāng)前研究顯示,中性蛋白酶的開發(fā)較早,已較為成熟,目前有關(guān)堿性蛋白酶的研究較多,且發(fā)展迅速,而酸性蛋白酶的研究有限,有待進(jìn)一步的開發(fā)。

根據(jù)最適溫度不同,可以將蛋白酶分為高溫蛋白酶、中溫蛋白酶和低溫蛋白酶。由于高溫和低溫蛋白酶在特殊溫度條件下的良好穩(wěn)定性,近年來的相關(guān)研究呈明顯的上升趨勢。低溫蛋白酶可以從嗜冷微生物中獲得,由于生長環(huán)境特殊,大多海洋微生物具有耐鹽、耐高壓和嗜低溫等獨(dú)特的生理特征,可以大量分泌低溫蛋白酶,是其良好來源。秦皇島海域海水樣品中篩得的假交替單胞菌,可以產(chǎn)低溫中性蛋白酶,該酶遺傳性能穩(wěn)定,發(fā)酵周期短,環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng),發(fā)酵液酶活可達(dá)1140 U/mL[14]。除低溫蛋白酶外,高溫蛋白酶也是一類比較特殊的蛋白酶,最適溫度在60 ℃以上,往往取自極端環(huán)境的微生物中。由于特殊的適應(yīng)性,此類蛋白酶都具有熱穩(wěn)定性好、耐有機(jī)溶劑、耐變性劑和半壽期長等優(yōu)良的性質(zhì)[31]。有學(xué)者從海洋細(xì)菌FirmusbacillusCAS7中分離得到高溫蛋白酶,該酶有高度的穩(wěn)定性,比活力為473.4 U/mg[15]?？莶菅挎邨U菌所產(chǎn)的耐高溫的絲氨酸蛋白酶,在60 ℃下仍可以保持穩(wěn)定性,加入洗滌劑后極大地提高了洗滌劑的清潔能力[17]。除細(xì)菌外,高溫放線菌也可產(chǎn)高溫蛋白酶,該蛋白酶在60 ℃仍保持活性,可以用于含角蛋白廢棄物的處理[19]。在目前的工業(yè)生產(chǎn)中,中溫蛋白酶是主要的工程酶,具有成本相對較低、開發(fā)相對成熟的優(yōu)點,但也暴露出了穩(wěn)定性不佳、適應(yīng)性差等問題。由于低溫以及高溫蛋白酶具有穩(wěn)定性高、適應(yīng)性強(qiáng)等特點,逐漸成為研究熱點。

另外,還可根據(jù)作用底物的不同進(jìn)行分類,例如以彈性蛋白為底物的彈性蛋白酶,具有維護(hù)血管彈性、延緩皮膚衰老和保持肉類口感等多種作用,得到許多行業(yè)的青睞。而目前我國彈性蛋白酶的生產(chǎn)主要來源于動物的胰臟,其提取、分離和純化工藝較復(fù)雜,使得彈性蛋白酶的得率和質(zhì)量相對較低,導(dǎo)致其價格昂貴[32]。尋找新的彈性蛋白酶源是人們多年一直關(guān)注的問題,微生物無疑是一個很好的選擇。也可根據(jù)活性中心的不同進(jìn)行分類,例如活性中心含有金屬離子的蛋白酶被稱為金屬蛋白酶。細(xì)菌所產(chǎn)的金屬蛋白酶種類眾多、易于分離、產(chǎn)量大,研究前景廣闊[33]。

充分利用生產(chǎn)蛋白酶的傳統(tǒng)工程菌,不斷篩選優(yōu)化傳統(tǒng)菌株并繼續(xù)尋找新的微生物源,是微生物蛋白酶的一大發(fā)展方向。

2 微生物源的篩選及培養(yǎng)

在自然界中目標(biāo)菌株幾乎不會以單一菌株的形式存在,需要對菌株進(jìn)行分離純化后才可將之用于提取所需的蛋白酶,目標(biāo)菌株的分離純化過程通常如下所示:

菌種采集→無菌環(huán)境下接種→分離純化→置于適宜環(huán)境下培養(yǎng)→得到純種菌株,進(jìn)行保藏

微生物篩選的過程包含初篩和復(fù)篩[34]。初篩和復(fù)篩都可以根據(jù)目的菌的特性選擇特殊培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。微生物篩選的方法很多,目前比較常用的傾注平板法、涂布平板法、平板劃線法、富集培養(yǎng)法,都是通過菌種稀釋的原理進(jìn)行菌種分離。而厭氧法是根據(jù)微生物好氧和厭氧性的不同進(jìn)行菌種分離的一種方法。在產(chǎn)蛋白酶菌種的篩選中,大多選用酪蛋白培養(yǎng)基,酪蛋白水解圈越大,產(chǎn)蛋白酶能力越強(qiáng)[34-36]。

對于篩選過后的微生物擴(kuò)大化培養(yǎng),培養(yǎng)基應(yīng)保證適宜的營養(yǎng)物濃度、合適的pH、適當(dāng)?shù)乃?才可以維持微生物的正常生長。不同菌株的最佳培養(yǎng)條件千差萬別,例如醬類生產(chǎn)中常用雅致放射毛霉和五通橋毛霉,它們的培養(yǎng)基最佳配比相似但也略有不同,前者培養(yǎng)基中的黃豆粉添加量要低于后者,而KH2PO4、CaCl2的添加量卻略高于后者[37-38]。除根據(jù)菌種特點進(jìn)行配制的培養(yǎng)基外,也可以直接在微生物原本的生長環(huán)境中取材進(jìn)行初篩后的擴(kuò)大化培養(yǎng),例如海洋微生物可直接取其生長海域的海水殺菌后進(jìn)行菌種培養(yǎng)[39]。

部分野生菌經(jīng)篩選之后可以滿足工業(yè)生產(chǎn)要求,直接進(jìn)行應(yīng)用,但也有菌株需經(jīng)誘變篩選后再進(jìn)行培養(yǎng)。目前,常見的菌種誘變方式包括物理誘變和化學(xué)誘變,它們都是通過遺傳物質(zhì)的突變進(jìn)行菌種誘變。其中,物理誘變方便快捷,一直沿用至今,常見的物理誘變劑有:紫外線、X-射線、γ-射線、激光、微波等[40]。相對物理誘變,化學(xué)誘變更為復(fù)雜,近年來呈高速發(fā)展趨勢,烷化劑、天然堿基類似物、疊氮化物等是常見的化學(xué)誘變劑[41]。除可使用單一的方法進(jìn)行誘變之外,多種方法聯(lián)用可以結(jié)合各種方法的優(yōu)勢,也是目前常見的誘變育種方法[42]。

目前,國內(nèi)仍然多選用傳統(tǒng)方法進(jìn)行微生物菌株的篩選和培養(yǎng),并發(fā)現(xiàn)了一定量的微生物新物種,但與此同時也應(yīng)結(jié)合誘變技術(shù),得到生產(chǎn)性能更強(qiáng)的工程菌,促進(jìn)蛋白酶的生產(chǎn)。

3 微生物蛋白酶的純化

工業(yè)生產(chǎn)中往往需要高純度的胞外蛋白酶,盡管進(jìn)行粗分離相對簡單,但還要進(jìn)行復(fù)雜的提純分離才可得到純度較高的蛋白酶。

進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)之后,取發(fā)酵液進(jìn)行離心處理,上層清液即粗酶液[43-45]。也有研究指出,在取發(fā)酵液后加入絮凝劑進(jìn)行沉淀,可以直接得到澄清粗酶液,這種操作較之前的離心處理更為溫和。同時,根據(jù)不同微生物源的大小選擇不同的濾膜進(jìn)行過濾,也可以將微生物除去,得到粗酶液[46]。制得粗酶液后需要對其進(jìn)行除雜處理。因為蛋白酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì),故常采用分離蛋白質(zhì)的方法進(jìn)行蛋白酶的純化處理,常用方法詳見表2。

表2 蛋白酶純化處理方法Table 2 Purification methods of protease

表2中提及的柱層析法是實驗室進(jìn)行酶純化的常用方法,例如離子交換層析和凝膠過濾層析等。相關(guān)研究采用硫酸銨沉淀、Q-HP陰離子交換柱和Superdex 75凝膠柱層析的方法,從醬油大曲中純化得到的耐鹽蛋白酶,酶活力保留為54.39%左右[47]。而在從云南萵筍尖中分離制備酪氨酸酶時,相關(guān)研究也采用了二乙氨基乙醇瓊脂糖凝膠(Diethyl-aminoethanol Sepharose)離子交換層析和Superdex-200凝膠過濾層析等相結(jié)合的方法,得到了比活力為20.62 U/mg的酶[48]。在眾多方法中,超濾法等物理性分離手段操作簡單、酶活力保存好,但純度不高;化學(xué)分離手段分離純度高,但酶活性保存較差,故“集成分離純化法”越來越多地被采用。其通過將多種分離純化方法結(jié)合起來,使各技術(shù)之間優(yōu)勢互補(bǔ),可以在不同處理階段采用不同的方法以得到更高純度的目的酶。

4 蛋白酶酶活力的調(diào)控

4.1 通過外部因素進(jìn)行酶活力的調(diào)控

底物濃度、溫度、pH、激活劑、抑制劑是影響酶活力的主要外部因素,通過對它們進(jìn)行調(diào)控可調(diào)控酶活力。在實際生產(chǎn)中,上述因素對發(fā)酵效果也有顯著影響。無論是用于生產(chǎn)納豆的納豆菌[49]還是用于提高小米糠蛋白應(yīng)用的芽孢桿菌[50],溫度和pH對其中的酶活力都有重要影響。除了上述對酶活力具有普遍影響的因素外,工業(yè)化生產(chǎn)中也會產(chǎn)生很多其它影響酶活力的因素,例如底物的組織狀態(tài)對蛋白酶活力有重要影響。醬油生產(chǎn)中,影響所用蛋白酶活性的主次順序為浸豆時間>蒸料時間>制曲時間[23,51]。浸豆時間和蒸料時間都會對底物大豆的組織形態(tài)產(chǎn)生明顯影響。通過控制料水比來調(diào)控蛋白酶的活力,用枯草芽孢桿菌提高豆粕的利用率[52],也是控制底物的組織狀態(tài)來調(diào)控蛋白酶活力。在青貯過程添加的青貯添加劑中,菌種的復(fù)配比也會對酶活力產(chǎn)生影響[53]。綜上所述,針對不同的生產(chǎn)要求以及所用蛋白酶的特點篩選關(guān)鍵因素并進(jìn)行調(diào)控,可使蛋白酶活力達(dá)到最佳狀態(tài)。

4.2 通過人工改造進(jìn)行酶活力的調(diào)控

除可以通過改變外部環(huán)境條件,也可以通過改變蛋白酶自身結(jié)構(gòu)對工程菌蛋白酶活力進(jìn)行調(diào)控。蛋白酶常見的改造方法如表3所示。

表3 蛋白酶改造方法Table 3 Protease modification method

近年來,基因工程和蛋白質(zhì)工程發(fā)展迅速,相關(guān)研究日益深入,這兩項技術(shù)也越來越多的用于酶的改造中。基于蛋白酶的結(jié)構(gòu)特征,利用基因工程和蛋白質(zhì)工程,定向改變蛋白酶不同位置的氨基酸殘基,提高蛋白酶的抗氧化性,熱穩(wěn)定性和催化活性,相關(guān)的研究結(jié)果見表4。

表4 蛋白酶的氨基酸殘基變化及結(jié)果Table 4 Changes in amino acid residues of proteases and their results

由表4可見,可通過誘變引入新的氨基酸殘基或根據(jù)蛋白酶自身極性需要進(jìn)行氨基酸殘基的更換以達(dá)到改造蛋白酶的目的。在蛋白酶分子中引入二硫鍵是提高蛋白酶熱穩(wěn)定性的方法之一,通過定點誘變,引入兩個半胱氨酸可使蛋白酶分子形成二硫鍵,可提高其熱穩(wěn)定性[52]。除了形成二硫鍵之外,可以增加Loop區(qū)的柔韌性,提高酶與底物的結(jié)合能力進(jìn)而提高酶的催化活性[54]。改變蛋白酶的氨基酸可以改變其帶電性或等電點,進(jìn)而改變底物與蛋白酶之間的親和性、提高蛋白酶的催化活性[55-57]。

也可以通過在不同菌種之間進(jìn)行基因克隆進(jìn)行蛋白酶活力的提高。將優(yōu)化后的枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(serine alkaline protease)基因克隆到釀酒酵母表達(dá)載體pY-ES2上,在釀酒酵母Whu2d中進(jìn)行表達(dá),釀酒酵母中酶的活力提高了55.2%[62]。

由上述可知,氨基酸殘基的改變是在原有蛋白酶的基礎(chǔ)之上對其進(jìn)行改造,實現(xiàn)改善蛋白酶性質(zhì)和活力的目的,而基因克隆是將基因在不同生物體中進(jìn)行表達(dá)以提高蛋白酶的相關(guān)性質(zhì),兩者均為當(dāng)下比較常用的蛋白酶活力的改造方式。

5 微生物蛋白酶的應(yīng)用

蛋白酶的首次大規(guī)模應(yīng)用出現(xiàn)在洗滌劑行業(yè),洗滌劑蛋白酶占到全球酶銷量的90%[63]。而目前蛋白酶的應(yīng)用已經(jīng)進(jìn)入到各個行業(yè),食品、化學(xué)品、藥品等行業(yè)都開始使用蛋白酶進(jìn)行產(chǎn)品的生產(chǎn)和性能改良[64]。微生物以其更廣泛的生物多樣性、更多的遺傳操作可能性以及操作技術(shù)的優(yōu)勢,日漸成為蛋白酶的主要生產(chǎn)者,受到越來越多行業(yè)的青睞[65]。工業(yè)中洗滌劑的制造[66-68],紡織品[69]、皮革[70]的軟化,高溫滅菌乳的去穩(wěn)定化[71];農(nóng)業(yè)上農(nóng)田雜草的去除[72],土壤質(zhì)量的檢測[73];醫(yī)學(xué)上新抗生素的研發(fā)[74-75],保健品大豆肽的提取[76]等,都有微生物蛋白酶的應(yīng)用。

除微生物蛋白酶的傳統(tǒng)利用方式以外,研究人員還以微生物實驗為基礎(chǔ)結(jié)合基因工程和酶工程,突破物種的界線,研發(fā)出新的微生物蛋白酶或用利用誘變技術(shù)進(jìn)行蛋白酶的性質(zhì)改良。如將昆蟲產(chǎn)絲氨酸蛋白酶的基因在大腸桿菌中成功表達(dá),產(chǎn)生了新的微生物絲氨酸蛋白酶,可在生物研究和食品加工中進(jìn)行應(yīng)用[77]。通過對芽孢桿菌的基因進(jìn)行定向誘變,將某些基因中的胞嘧啶變?yōu)樾叵汆奏せ蛳汆堰首優(yōu)轼B嘌呤,提高了其所產(chǎn)堿性絲氨酸蛋白酶在低溫下的穩(wěn)定性[78],使其在工業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)的微生物蛋白酶行業(yè)在與當(dāng)下新技術(shù)的結(jié)合之后展現(xiàn)出強(qiáng)勁的發(fā)展活力。

微生物蛋白酶極大地提高了產(chǎn)品質(zhì)量和安全性能,同時也節(jié)省了大量的人力和物力。但目前蛋白酶的應(yīng)用也出現(xiàn)了不規(guī)范的情況,如耐高溫的微生物蛋白酶若在洗衣液中添加過多,在使用過后未失活,可能會通過皮膚接觸,引起過敏反應(yīng),對人體造成危害[65]。

6 展望

針對微生物蛋白酶的研究隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展日益深入,新的微生物源和蛋白酶也得到了不斷的開發(fā)和利用。對蛋白酶的研究也已不再局限于工業(yè)生成和應(yīng)用的層面,而是開始向?qū)Φ鞍酌附Y(jié)構(gòu)、基因的改造和酶活力的提升方向發(fā)展。不斷尋找新的蛋白酶微生物源,開發(fā)新的微生物源蛋白酶,繼續(xù)深入研究闡明蛋白酶結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系,獲得活力更高、穩(wěn)定性更強(qiáng)的高品質(zhì)蛋白酶,才能為其在各行業(yè)中的應(yīng)用打下堅實的基礎(chǔ),促進(jìn)生物加工產(chǎn)業(yè)尤其是蛋白質(zhì)生物加工產(chǎn)業(yè)的高速發(fā)展。