王桔紅，張燕芳，林曉娃

（1.韓山師范學(xué)院 食品工程與生物科技學(xué)院，廣東 潮州 521041；2.澄海中學(xué)，廣東 汕頭 515800）

人教版生物學(xué)高中必修一《分子與細胞》的第3章第2節(jié)“用高倍顯微鏡觀察葉綠體和線粒體”是一個觀察驗證性實驗［1］，目的是讓學(xué)生認識葉綠體和線粒體的形態(tài)和分布，增加感性認識，同時學(xué)習(xí)在光學(xué)顯微鏡下觀察葉綠體和線粒體的方法和技巧.教材中提供觀察葉綠體的材料是蘚類、菠菜和黑藻.然而，受到地域和季節(jié)的限制［2］，部分地區(qū)很難找到新鮮蘚類和黑藻［3］，實驗材料的不足或缺失制約了實驗的正常開展以及實驗效果的達成.觀察線粒體實驗中，有較多的干擾因素，如用消毒牙簽刮取口腔黏膜時易摻雜其他物質(zhì)；健那綠溶解度低，不易溶解或易形成染液顆粒；健那綠染液濃度過高，細胞會失去活性等.因此，取材技巧、染液配制方法及染液濃度是影響觀察線粒體實驗效果的重要因素［4］.

為了更清晰地觀察到葉綠體和線粒體的形態(tài)和分布，本研究除了葫蘆蘚（Funaria hygrometrica）外，選取了8種野生植物和10種蔬菜作為實驗材料，對“觀察葉綠體”的實驗材料和取材方法進行了探索，以找到更合適的替代材料；同時探索了觀察口腔上皮細胞線粒體的染液濃度和染色方法，嘗試用植物細胞觀察線粒體，并提出相關(guān)建議.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗選取觀察葉綠體實驗的植物包括葫蘆蘚、8種野生植物和10種常見市售蔬菜（表1）.8種野生植物包括野菊（Dendranthema indicum）、小飛蓬（Conyza canadensis）、黃鵪菜（Youngia Japonica）、鬼針草（Bidens pilosa）、魚腥草（Houttuynia cordata）、車前（Plantago asiatica）、蘇丹鳳仙花（Impatiens walleriana）、長壽花（Kalanchoe blossfeldiana）；10 種蔬菜包括油麥菜（Lactuca sp.）、春菜（Lactuca sp.）、上海青（Brassica chinensis）、菜心（B. campestris）、白菜（B. pekinensis）、空心菜（Ipomoea aquatic）、蔥（Allium fistulosum）、蒜苗（A.sativum）、韭菜（A. tuberosum）、菠菜（Spinacia oleracea）.選取白菜［4］、蔥［5-6］、蒜苗、洋蔥［6］、酵母菌（Yeast）［1］以及口腔上皮細胞作為線粒體的顯微觀察材料.

表1 觀察葉綠體的植物

1.2 實驗方法

葫蘆蘚的葉片是單層細胞，取一片葉即可直接觀察到清晰的葉綠體.其他植物材料則需挑選綠色葉片、洗凈，將葉片置于清水中，防止葉片萎蔫而導(dǎo)致下表皮與葉肉結(jié)合過多，有利于觀察；沿與葉脈垂直方向撕?。礄M向撕?。┲参锶~片下表皮，獲得下表皮以及部分葉肉細胞；將撕下的下表皮置于帶有1～2滴清水的載玻片上，用鑷子傾斜輕輕按壓表皮排出部分氣泡，再蓋上蓋玻片，靜置3～5分鐘（以減少氣泡），置于光學(xué)顯微鏡下由低倍至高倍逐漸觀察.

在觀察線粒體實驗時，選擇質(zhì)量分數(shù)為1%和0.6%健那綠染液分別進行實驗和效果比較；配制健那綠染液時，加溫到30～40 ℃，使其充分溶解；采用引流法進行染色［7］，置于光學(xué)顯微鏡下由低倍至高倍逐漸觀察.

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體的觀察結(jié)果

（1）從撕取植物下表皮難易程度看，十字花科的菜心和上海青最容易撕取稍有葉肉細胞的表皮，其次是長壽花、蘇丹鳳仙花、野菊、小飛蓬、黃鵪菜、鬼針草、春菜、油麥菜以及魚腥草.

圖1 葫蘆蘚葉顯微照片

（2）從葉肉細胞葉綠體清晰度看，用成熟的葫蘆蘚作為實驗材料，沒有氣孔、干擾少、葉綠體大而清晰，觀察效果最佳（圖1）.其他植物觀察效果依次是：野菊＞魚腥草＞小飛蓬＞油麥菜＞春菜＞黃鵪菜＞鬼針草＞上海青、菜心、白菜＞蔥、洋蔥、蒜苗、韭菜＞空心菜＞菠菜＞車前草＞長壽花＞蘇丹鳳仙花（圖2～8）.

（3）從保衛(wèi)細胞葉綠體的清晰度看，長壽花、春菜、小飛蓬、油麥菜、白菜以及魚腥草的保衛(wèi)細胞里可清晰觀察到較大的葉綠體（圖9～14），韭菜、蘇丹鳳仙花、鬼針草、上海青的保衛(wèi)細胞里的葉綠體相對較小.值得一提的是，油麥菜的表皮細胞也可觀察到葉綠體（圖4），韭菜、長壽花、春菜、小飛蓬的表皮細胞和保衛(wèi)細胞均可觀察到清晰的葉綠體.

（4）在白菜、魚腥草的表皮細胞以及空心菜的葉肉細胞中觀察到了細胞質(zhì)流動.

圖2 野菊葉片下表皮及葉肉細胞

圖3 小飛蓬葉下表皮及葉肉細胞

圖4 油麥菜葉下表皮及葉肉細胞

圖5 菜心下表皮及葉肉細胞

圖6 蒜苗下表皮及葉肉細胞

圖7 魚腥草下表皮及葉肉細胞

2.2 線粒體的觀察結(jié)果

本實驗嘗試用白菜、蔥、蒜苗、洋蔥、酵母菌以及口腔上皮細胞等進行線粒體的顯微觀察.結(jié)果顯示，動物細胞（口腔上皮細胞）的線粒體容易染色，且線粒體大，觀察效果最佳（圖15）；其次，在蔥和洋蔥內(nèi)表皮細胞中也可觀察到較清晰的線粒體（圖16）；在白菜和蒜苗的內(nèi)表皮細胞中，能觀察到細小的線粒體，但分辨效果較差；以酵母菌為材料觀察線粒體時，線粒體小且較難觀察到，故不宜作為實驗材料.

圖8 菠菜下表皮及葉肉細胞

圖9 小飛蓬保衛(wèi)細胞（10×100）

圖10 春菜保衛(wèi)細胞（10×100）

圖11 油麥菜保衛(wèi)細胞（10×100）

圖12 白菜保衛(wèi)細胞（10×100）

圖13 長壽花保衛(wèi)細胞（10×100）

圖14 蘇丹鳳仙花保衛(wèi)細胞（10×100）

圖15 口腔上皮細胞（10×100）

圖16 蔥內(nèi)表皮細胞（10×100）

3 討論

生物學(xué)是一門以實驗為基礎(chǔ)的自然科學(xué)，現(xiàn)代生物科學(xué)的發(fā)展尤其依賴于科學(xué)實驗.中學(xué)生物實驗對于學(xué)生掌握生物學(xué)知識、理解科學(xué)研究過程與方法以及核心素養(yǎng)的培養(yǎng)有至關(guān)重要的作用.“用高倍顯微鏡觀察葉綠體和線粒體”是一個觀察驗證性實驗，教材提供了蘚類、菠菜和黑藻的葉作為觀察葉綠體的材料，然而由于我國南北自然地理和氣候條件差異較大，實驗材料不易獲取，選擇方便易取而且觀察效果最佳的實驗材料是觀察葉綠體實驗成功的關(guān)鍵.此外，受觀察材料、方法以及染液配制等因素影響，觀察線粒體的實驗效果也不盡如人意.

本研究選取了8種野生植物和10種蔬菜為實驗材料，對“觀察葉綠體”的實驗材料、取材方法進行了探索.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除教材中提供的實驗材料外，一些常見野生植物和蔬菜也可作為較好的葉綠體觀察材料.其中菜心和上海青以及長壽花、蘇丹鳳仙花、野菊、小飛蓬、黃鵪菜、鬼針草最易撕取帶有少許葉肉細胞的表皮；野菊、魚腥草、小飛蓬、油麥菜、春菜等植物下表皮的葉綠體大且清晰；長壽花、春菜、小飛蓬、油麥菜、大白菜以及魚腥草的保衛(wèi)細胞中葉綠體清晰可見，均可作為“觀察葉綠體”的最佳實驗材料.綜合實驗結(jié)果，在“觀察葉綠體”實驗中優(yōu)先選擇成熟的蘚類植物，其次是菊科植物和十字花科植物，這3類植物葉綠體更大，且取材容易，觀察效果最佳.此外，白菜和魚腥草的表皮細胞以及空心菜的葉肉細胞中均可觀察到細胞質(zhì)流動，可將“觀察葉綠體”和“觀察細胞質(zhì)的流動”這兩個實驗合并開展［8］.

在“觀察葉綠體”實驗中，需注意以下幾點：1）宜選擇草本植物作為材料，因為灌木、喬木植物的葉多革質(zhì)化，較難撕出稍帶葉肉細胞的表皮；2）宜選擇葉脈較疏松的植物，更容易撕出一大片表皮；3）盡量選擇老幼適中的葉片.因為老葉較革質(zhì)化，不易撕，而嫩葉的葉綠體發(fā)育不完整，不易觀察；4）一般選擇綠色而沒有其他顏色干擾的葉片；5）臨時裝片中的材料應(yīng)保持有水狀態(tài)，以保證葉綠體的正常形態(tài)并能懸浮在細胞質(zhì)基質(zhì)中，否則細胞失水收縮，影響其形態(tài)的觀察.

“觀察線粒體”實驗結(jié)果顯示，植物細胞中線粒體較小且分散，較難觀察到，不宜作為觀察材料，因而最佳的觀察線粒體實驗材料仍是口腔上皮細胞.健那綠是專一性線粒體的活細胞染料，通過對活細胞染色，可使線粒體呈現(xiàn)藍綠色，而細胞質(zhì)接近無色，以便在高倍顯微鏡下觀察到線粒體分布和形態(tài).然而，健那綠染液濃度不宜過高，否則可導(dǎo)致細胞失活；染液配制中健那綠應(yīng)充分溶解，否則會出現(xiàn)較多染液顆粒，影響觀察效果.本實驗顯示，將健那綠染液的質(zhì)量分數(shù)由1%降低至0.6%，并采用引流法［8］，可以避免染色過深以及健那綠顆粒等雜物干擾，效果更佳.此外，由于線粒體較小，應(yīng)使用油鏡觀察.

本研究在“觀察葉綠體”的實驗中探索了多種簡單易取的實驗材料以及取材技巧，不僅可以觀察到葉肉細胞的葉綠體，還可以觀察到保衛(wèi)細胞的葉綠體，使學(xué)生更加清楚和理解葉綠體形態(tài)和分布狀況.觀察葉綠體可選用的材料其實很多，教師可結(jié)合本文提供的材料和取材方法，根據(jù)當?shù)貙嶋H情況選取適當?shù)牟牧?；同時，可鼓勵學(xué)生自帶實驗材料進行觀察葉綠體實驗的嘗試和探索，激發(fā)學(xué)生探究生物奧秘的興趣和熱情.對于線粒體的觀察實驗，未來應(yīng)進一步探索除了口腔上皮細胞，還有哪些動物細胞的線粒體易于觀察且取材容易，以找到更合適的實驗材料，為中學(xué)生物實驗教學(xué)提供參考.