潘勇，李建宋，李靜，廖祥儒，郝之奎*

(1.臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用生物技術(shù)研究所，浙江 臺(tái)州 318000； 2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122)

梨是最常見的大眾水果之一，其營(yíng)養(yǎng)豐富，不僅可口、多汁、解渴、抗疲，還有一定的保肝、通便、防癌抗癌等功效[1-2]。我國(guó)的梨樹栽培面積和梨產(chǎn)量均占世界的五分之四，居世界首位，產(chǎn)量多年保持在1 600萬(wàn)t以上?！吨袊?guó)統(tǒng)計(jì)年鑒2018》顯示，2016年我國(guó)梨產(chǎn)量達(dá)到1 870.4萬(wàn)t，主要集中在河北、安徽、新疆、河南及遼寧等省區(qū)，其中以河北、山東及新疆為代表的白梨和安徽、河南為代表的砂梨最為有名。安徽省碭山縣是我國(guó)砂梨重要產(chǎn)區(qū)之一，和其他梨產(chǎn)區(qū)一樣，由于加工水平較低，主要以鮮銷為主，由于鮮梨上市集中特點(diǎn)且市場(chǎng)容量限制，滯銷年年頻現(xiàn)，豐產(chǎn)尤甚，發(fā)展砂梨深加工迫在眉睫[3-4]。利用現(xiàn)代生物技術(shù)開發(fā)鮮梨發(fā)酵飲料可有效提高梨附加值、豐富梨產(chǎn)品種類、提高深加工量[5]，也為砂梨產(chǎn)業(yè)的開發(fā)利用研究提供新的思路，具有較好的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

本研究從梨樹根際土壤中采集土樣，利用加入溴甲酚紫指示劑的MRS培養(yǎng)基篩選產(chǎn)酸菌株，研究了該菌株的形態(tài)學(xué)和生理生化特征并通過16 S rRNA基因序列分析鑒定了該菌株為乳酸桿菌，將篩選菌株應(yīng)用于梨汁發(fā)酵，優(yōu)化了梨汁發(fā)酵工藝，分析了梨汁發(fā)酵前后主要成分的變化，初步探討其在梨汁發(fā)酵飲料中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物根際土壤取自新疆哈密某梨園；碭山梨來源于市場(chǎng)新鮮采購(gòu)；葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、酵母粉、胰蛋白胨、牛肉浸膏、CH3COONa、C6H14N2O7、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、NaOH、HCl、吐溫80 為普通試劑；細(xì)菌基因提取試劑盒和總抗氧化能力(T-SOD)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

主要儀器有：旋轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，美國(guó)ZEALWAY公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；紫外分光光度計(jì)UV-2000，美國(guó)UNICO公司；電子天平CP214，奧豪斯儀器有限公司；XP基因擴(kuò)增儀，杭州博日科技有限公司；pH計(jì)STARTER3100，美國(guó)OHAUS公司；數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；高效液相色譜儀Agilent 1260，美國(guó)安捷倫公司；高速離心噴霧干燥機(jī)GEA，Niro公司。

1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g·L-1，酵母粉5.0 g·L-1，胰蛋白胨10.0 g·L-1，牛肉浸膏10.0 g·L-1，CH3COONa 5.0 g·L-1，C6H14N2O72.0 g·L-1，K2HPO42.0 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.58 g·L-1，MnSO4·4H2O 0.25 g·L-1，吐溫80 1 mL·L-1，pH 6.2～6.6。MRS培養(yǎng)基中添加1.5%的瓊脂粉為固體培養(yǎng)基。

PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0 g·L-1，酵母提取物10.0 g·L-1，酪蛋白水解物5.0 g·L-1，鹽溶液40.0 mL·L-1。其中鹽溶液成分為：NaCl 2.0 g·L-1，無(wú)水CaCl20.2 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.48 g·L-1，K2HPO41.0 g·L-1，NaHCO310.0 g·L-1。

碳水化合物基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母粉2.5 g·L-1，胰蛋白胨 10.0 g·L-1，吐溫80 0.1 mL·L-1，1.6%的溴甲酚紫乙醇溶液1.0 mL·L-1，碳水化合物溶液 50.0 mL·L-1。其中碳水化合物溶液分別取D-果糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、纖維二糖、L-鼠李糖、海藻糖、L-山梨糖、D-甘露醇、D-山梨醇、D-阿拉伯糖、棉子糖、肌酸、肌醇等各10 g溶于1 L水中，調(diào)pH至 6.5。

檸檬酸鹽培養(yǎng)基(g/L或mL/L)：脫脂奶粉10.0 g·L-1，酪蛋白水解物2.5 g·L-1，葡萄糖5.0 g·L-1，瓊脂15.0 g·L-1，溶液A 10.0 mL·L-1，溶液B 10.0 mL·L-1，pH 6.5，108 ℃滅菌12 min后冷卻至45 ℃，然后加入溶液A和溶液B，混合均勻后倒平板，30 ℃避光干燥24 h備用。其中溶液A的配制方法如下：取10.0 g高鐵氰化鉀溶于100 mL去離子水中，100 ℃蒸汽加熱滅菌30 min；溶液B的配制方法如下：分別取1.0 g檸檬酸鐵和1.0 g檸檬酸鈉共溶于40 mL去離子水中，100 ℃蒸汽加熱滅菌30 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株篩選

采用稀釋涂布法處理富集培養(yǎng)液，30 ℃恒溫箱倒置培養(yǎng)，至菌落長(zhǎng)出；挑選變黃的菌落，劃線分離直至獲純培養(yǎng)物。

1.3.2 菌株鑒定

觀察30 ℃條件下培養(yǎng)24 h后的MRS固體培養(yǎng)基上菌落特征。革蘭氏染色法染色待測(cè)菌，顯微鏡下觀察研究形態(tài)學(xué)特征。依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和文獻(xiàn)[6-8]研究待測(cè)菌的過氧化氫接觸酶實(shí)驗(yàn)、精氨酸水解實(shí)驗(yàn)、糖利用實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鈉利用實(shí)驗(yàn)、耐酒精實(shí)驗(yàn)、耐鹽實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)酸產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)及七葉苷水解實(shí)驗(yàn)等生理生化特性。

利用細(xì)菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTT ACGACTT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因。在50 μL反應(yīng)體系中加入DNA模板1 μL，27F引物1 μL，1492R引物1 μL，2×EasyTaqPCR SuperMix 25 μL，加水22 μL。PCR條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35次循環(huán)；72 ℃延伸10 min；3%瓊脂糖電泳檢測(cè)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送到華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

利用BLAST通過數(shù)據(jù)庫(kù)http://blast.ncbi. nlm.nih.gov分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，找出與數(shù)據(jù)庫(kù)同源性最高的已知菌種，推測(cè)菌株可能的屬或種。

1.3.3 菌株生長(zhǎng)特性研究

最適生長(zhǎng)溫度：利用MRS培養(yǎng)基研究20、25、30、35、40 ℃條件下溫度因素對(duì)待測(cè)菌的影響，接種量為5%，60 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h，測(cè)定D600值。

最適生長(zhǎng)pH：利用MRS培養(yǎng)基研究pH值對(duì)待測(cè)菌生長(zhǎng)的影響，pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，接種量為5%，60 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h，測(cè)定D600值。

生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸能力的測(cè)定：按接種量5%接種于MRS培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速60 r·min-1，每2 h測(cè)定D值，根據(jù)文獻(xiàn)[9]測(cè)定菌株產(chǎn)酸能力。

1.3.4 菌株在梨汁發(fā)酵飲料中的應(yīng)用

發(fā)酵劑的制備：分別按4∶1、3∶2、2∶3、1∶4配制MRS/梨汁混合培養(yǎng)基，按接種量5%接種，在30 ℃，60 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h，確認(rèn)生長(zhǎng)狀況較好后，轉(zhuǎn)接至含1%蜂蜜的梨汁中30 ℃發(fā)酵24 h得到梨汁的發(fā)酵劑。

待測(cè)菌發(fā)酵梨汁工藝流程：新鮮碭山梨去皮→粉碎打漿→護(hù)色(0.2%檸檬酸水)→過濾→滅菌(95 ℃，5 min)→冷卻→接入發(fā)酵劑(接種量5%)→發(fā)酵(30 ℃，24 h，初始pH 6.5)→調(diào)配(蔗糖8%)→成品。

發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化：根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定溫度，依據(jù)發(fā)酵梨汁工藝流程，其他條件不變，分別以接種量(1%、3%、5%、7%、9%、11%)、培養(yǎng)時(shí)間(10、20、30、40、50、60 h)、蔗糖添加量(2%、4%、6%、8%、10%、12%)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以感官評(píng)分為指標(biāo)對(duì)各樣本進(jìn)行評(píng)價(jià)。

以接種量、發(fā)酵時(shí)間和蔗糖添加量為三因素，以感官評(píng)分為指標(biāo)，作L9(33)正交實(shí)驗(yàn)。1～3水平，接種量分別為4%、5%和6%，培養(yǎng)時(shí)間分別為15、20和25 h，蔗糖添加量分別為5%、6%和7%。

依據(jù)國(guó)標(biāo)等相關(guān)方法，隨機(jī)挑選20位感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)豐富人員參照標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣品進(jìn)行感官評(píng)定，每組數(shù)據(jù)去除一個(gè)最高分和一個(gè)最低分后取平均值作為該項(xiàng)目分值。感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：色澤0～20分，鮮明柔和，有光澤，無(wú)雜色，均勻一致；氣味0～30分，有清新的梨香和乳酸味，無(wú)異味；滋味0～30分，酸甜適口，口感細(xì)膩，無(wú)不良?xì)馕?；組織狀態(tài)0～20分，流動(dòng)性好，均勻不分層，微混濁，無(wú)雜質(zhì)。

1.3.5 梨汁發(fā)酵前后主要成分的變化

氨基酸含量的測(cè)定：在最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下發(fā)酵梨汁，采用高效液相色譜法[10-11]測(cè)定發(fā)酵前后梨汁中總氨基酸、必需氨基酸及蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸等有機(jī)酸含量。

T-SOD、黃酮及VC含量的測(cè)定：發(fā)酵前后分別取樣，制成10%的勻漿液，離心10 min(4 000 r·min-1)，取上清液分別根據(jù)試劑盒說明測(cè)T-SOD，依據(jù)GB/T 12143附錄G測(cè)黃酮含量，采用紫外分光光度法[12]測(cè)VC含量。樣本數(shù)量為3，取平均值作為檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 菌株形態(tài)特征

篩選獲得的純培養(yǎng)菌落直徑約3 mm，淺黃色，球形，中凸起，表面光滑，成對(duì)或鏈狀排列，革蘭氏陽(yáng)性(圖1)。

圖1 菌株SYBC psL4菌落特征(左)和革蘭氏染色照片(右)

2.1.2 菌株SYBC psL4生理生化特性

生理生化特性研究結(jié)果見表1，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，初步鑒定該純培養(yǎng)物屬于明串珠菌屬，命名為SYBC psL4。

表1 菌株生理生化特性

2.1.3 菌株SYBC psL4 16S rRNA基因分析

PCR擴(kuò)增純培養(yǎng)基因組，產(chǎn)物凝膠電泳如圖2，片段長(zhǎng)度1 500 bp左右，無(wú)明顯拖尾。測(cè)序后通過BLAST，與Leuconostocfallax16S rRNA基因序列同源性達(dá)100%。結(jié)合生理生化研究結(jié)果，確定該純培養(yǎng)為欺詐明串珠菌，命名為L(zhǎng)euconostocfallaxSYBC psL4。

圖2 菌株SYBC psL4 16S rRNA片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳

2.2 菌株SYBC psL4生長(zhǎng)特性研究

2.2.1 菌株SYBC psL4的最適生長(zhǎng)溫度、最適pH

最適溫度和最適pH研究結(jié)果分別是30 ℃和6.5(圖3)。

圖3 溫度和初始pH對(duì)SYBC psL4生長(zhǎng)的影響

2.2.2 SYBC psL4生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸能力的測(cè)定

如圖4所示，SYBC psL4的停滯期在0～4 h，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期在4～12 h，此階段D值最高達(dá)到2.1，12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。SYBC psL4有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，發(fā)酵12 h，pH值由6.5降至4.1，對(duì)數(shù)期產(chǎn)酸較多。

圖4 菌株SYBC psL4的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸能力

2.3 菌株SYBC psL4在梨汁發(fā)酵飲料中的應(yīng)用

2.3.1 發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

由圖5可知，適當(dāng)提高接種量可縮短延滯期，縮短發(fā)酵周期，感官評(píng)分隨著接種量的增大呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)。接種量為5%時(shí)，感官評(píng)分為87分，為最高值，接種量5.5%理論值最好。以4%、5%和6%的接種量作為正交實(shí)驗(yàn)的3個(gè)水平。培養(yǎng)時(shí)間在10～20 h時(shí)，發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵梨汁的感官影響較大，發(fā)酵20 h，感官評(píng)分達(dá)88分最高值，理論預(yù)測(cè)最好時(shí)間為22 h。隨后，口感隨酸度增加而下降。選擇發(fā)酵時(shí)間15、20和25 h為正交實(shí)驗(yàn)的3個(gè)水平。添加蔗糖過少或過多會(huì)使梨汁偏酸或偏甜，影響梨汁飲料的酸甜感，感官隨著蔗糖添加量增加得分先增后降，添加量為6%時(shí)得分最高。選擇5%、6%和7%的蔗糖添加量為正交實(shí)驗(yàn)的3個(gè)水平。

圖5 接種量、培養(yǎng)時(shí)間和蔗糖添加量對(duì)梨汁發(fā)酵的影響

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，發(fā)酵時(shí)間因素對(duì)感官影響最大，蔗糖添加量和接種量影響次之，最佳培養(yǎng)條件為發(fā)酵時(shí)間為25 h，蔗糖添加量為6%，接種量為5%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)感官評(píng)分獲92分。

表2 各因素組合對(duì)感官評(píng)分的影響

2.3.2 發(fā)酵前后主要指標(biāo)的變化

由表3可知，總氨基酸含量在發(fā)酵后變化不明顯，蘇氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸(Leu)和賴氨酸發(fā)酵后含量稍增，甲硫氨酸含量比發(fā)酵前降低明顯。

表3 梨汁發(fā)酵前后7種必需氨基酸變化

采用高效液相色譜測(cè)定了梨汁發(fā)酵前后的4種有機(jī)酸含量變化，結(jié)果顯示發(fā)酵前后，梨汁的蘋果酸和檸檬酸含量沒有明顯的減少，這與菌種不能代謝檸檬酸和蘋果酸的生化特性保持一致，發(fā)酵產(chǎn)生了微量的乙酸，而乳酸含量在發(fā)酵后有明顯的增加，說明發(fā)酵過程產(chǎn)生了大量的乳酸(圖6)。

圖6 發(fā)酵前后梨汁中有機(jī)酸含量變化

如表4所示，發(fā)酵后，T-SOD增加0.91%，無(wú)顯著變化。黃酮含量增加29.83%，增加顯著，VC的含量減少16.13%，可能發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生的乳酸，降低了pH值，保護(hù)了VC免受被氧化、分解[13]，部分VC作為底物被SYBC psL4發(fā)酵利用，轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸或其他維生素。

表4 梨汁飲料發(fā)酵前后成分變化

3 小結(jié)

對(duì)未知菌株進(jìn)行鑒定至少同時(shí)用3種方法得到相同結(jié)論才可靠，本研究對(duì)利用稀釋涂布平板法從梨根際土壤樣本中分離獲得的純培養(yǎng)進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)研究，鑒定為一株欺詐明串珠菌，命名為L(zhǎng)euconostocfallaxSYBC psL4。欺詐明串珠菌可用于食品加工，本研究嘗試?yán)迷摼l(fā)酵了碭山梨汁，結(jié)果表明，發(fā)酵梨汁可獲得較好口感的發(fā)酵產(chǎn)物，且對(duì)主要營(yíng)養(yǎng)成分如氨基酸和T-SOD影響不大，對(duì)VC含量影響也有限，但是，通過發(fā)酵，乳酸和總黃酮含量顯著增加，總體上看，通過發(fā)酵，較好改善了梨汁的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)，有一定的價(jià)值。和其他果品一樣，梨上市集中，市場(chǎng)易滯銷，梨的深加工水平和加工量亟待提高，目前，梨的加工形式主要是梨罐頭和少量梨汁，梨發(fā)酵飲品較少，利用包括現(xiàn)代生物技術(shù)在內(nèi)的科技發(fā)展成果提升梨深加工技術(shù)水平是實(shí)現(xiàn)梨產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的重要途徑之一。