陳仕毅，付玉平，馮曉晶，劉少奎

（1.大連大學附屬中山醫(yī)院循環(huán)科，遼寧 大連 116001；2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽 110001；3.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院和平院區(qū)骨科，沈陽 110042）

血管新生在急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）發(fā)病及治療過程中起關(guān)鍵性作用。在眾多的促血管生成、發(fā)展及成熟因素中，最重要的是促血管生成素（angiopoietin，Ang）及其受體（Ang/Tie2）系統(tǒng)。Ang-1為內(nèi)皮細胞特異生長因子，與Tie2受體結(jié)合，在血管新生、調(diào)控血管的完整性、維持其穩(wěn)定性過程中發(fā)揮作用［1］。研究［2］發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀保護心血管的功能與其調(diào)脂作用無關(guān)，其是否對微血管新生具有潛在的藥物作用機制研究相對較少。本研究通過建立大鼠AMI模型，觀察阿托伐他汀藥物治療對AMI大鼠心肌組織Ang-1及其受體Tie2mRNA表達水平的影響，探討阿托伐他汀藥物在AMI血管生成過程中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及模型建立

1.1.1 動物分組：6～8周齡雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量200～250 g，購自大連醫(yī)科大學實驗動物中心。在室溫20～25 ℃的動物房中飼養(yǎng)3 d后，將大鼠隨機分3組：正常（CG）組20只、單純心肌梗死（AG）組30只、心肌梗死聯(lián)合阿托伐他?。ˋAG）組30只。

1.1.2 建立AMI模型：使用氯胺酮與速眠新藥物麻醉AG與AAG組大鼠；將大鼠仰臥固定于操作臺上，使用大鼠灌胃直針（65 mm）進行氣管插管，深約40～50 mm，動物呼吸機設(shè)置參數(shù)為頻率60次/min，潮氣量30 mL，呼吸比率1 ∶1；于胸骨左緣心臟搏動最強點上一肋間（即第4、5肋間）做一斜行長約1 cm切口，打開胸腔并鈍性分離開心包，于左心耳下方冠狀動脈（以下簡稱冠脈）走行處，距離肺動脈根部3 mm結(jié)扎，深度 ≥ 1 mm，結(jié)扎后可見左心室心肌蒼白變薄，觀察大鼠生命體征變化，關(guān)閉胸腔并保持胸腔負壓狀態(tài)，沖洗消毒后縫合；AG組在術(shù)后3 d開始給予阿托伐他汀［10 mg/（kg·d）］灌胃，AG組及CG組以同等劑量生理鹽水灌胃，最終獲得CG組20只，AG組24只，AAG組25只，在灌胃后0 d、14 d 和28 d，分別取梗死部位心肌組織。

1.2 主要試劑及儀器

阿托伐他汀鈣（美國輝瑞制藥有限公司），PCR擴增試劑盒（上海生工生物工程有限公司），DNA Marker（上海生工生物工程有限公司），UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司），M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒（上海生工生物工程有限公司），引物合成（上海生工生物工程有限公司），高速微型離心機（DGW99）型（深圳市點晶科學儀器有限公司），紫外分光光度計（上海美析儀器有限公司），DY-300型低壓電泳儀（汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠有限公司），電熱恒溫水浴箱（上海躍進醫(yī)療器械廠），動物呼吸機ALC-V8（上海奧爾科特生物科技有限公司）。

1.3 實時PCR檢測Ang-1及其受體Tie2 mRNA的表達

分別于灌胃14 d和28 d處死大鼠，取AG組及CG組及AAG組大鼠的心肌組織，依據(jù)RT-PCR試劑說明書，按步驟分別檢測Ang-1及其受體Tie2mRNA的表達量。

1.3.1 提取RNA：稱取不少于30 mg的心肌組織，將研磨后的心肌組織置于離心管中加入RLT Solution震蕩混勻，離心并吸取上清液加入無水乙醇后混勻，使用吸附柱及DEPC-treated ddH2O獲得RNA溶液。

1.3.2 RNA純度的測定：使用DEPC處理水將提取的RNA稀釋，使用紫外分光光度計測定A260值及A280值。用DEPC-Treated ddH2O作為空白對照。

1.3.3 RNA反轉(zhuǎn)錄：將提取的RNA加入Oligo（dT）及RNase-free ddH20后混勻并離心，65 ℃溫浴5 min，冰浴30 s，離心。分別加入反應物Reaction Buffer 4 μL、RNase Inhibitor 1 μL、dNTP Mix 2 μL、M-MuLV RT 1 μL，混勻后離心。在PCR儀上進行cDNA合成（42℃），終止反應（70 ℃）。

1.3.4 實時PCR：cDNA產(chǎn)物加入上游Primer、下游Primer、Taq DNA Polymerase等試劑，通過變性、退火、延伸等步驟進行擴增，Tie2、Ang-1、β-actin退火溫度分別為57 ℃、55 ℃、58 ℃。

1.3.5 PCR產(chǎn)物檢測：PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠溶液進行電泳，在紫外觀測儀上觀察電泳結(jié)果，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶。

1.4 病理學檢查

2周處死大鼠，取左心室冠狀面梗死區(qū)中部切片，置于4 %的多聚甲醛溶液中固定10 h石蠟包埋待用。制5 μm厚切片，隨機取3張切片進行觀察，切片HE染色（蘇木精和伊紅染色法）。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 AMI模型大鼠心肌細胞的病理改變

光鏡下，正常大鼠心肌細胞排列有序緊密，無明顯炎癥細胞浸潤；冠脈結(jié)扎術(shù)后大鼠心肌細胞排列紊亂、稀疏，有中性粒細胞浸潤，見圖1。

2.2 阿托伐他汀影響AMI大鼠Ang-1及其受體Tie2 mRNA的表達

阿托伐他汀作用AMI大鼠14 d時，AAG組及AG組Tie2mRNA的表達高于CG組，AAG組明顯高于AG組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）（見圖2，表1、2）；Ang-1mRNA在AAG組、AG組及CG組的表達，組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05，見圖2，表1、2）。

圖1 AMI模型大鼠心肌細胞的病理變化 HE染色×400Fig.1 Pathological changes in myocardial cells of AMI rats HE staining×400

圖2 阿托伐他汀對AMI大鼠Ang-1及Tie2 mRNA的表達影響（藥物作用14 d）Fig.2 Effect of atorvastatin on mRNA expression of Ang-1 and Tie2 in AMI rats（14 d after drug action）

表1 阿托伐他汀對AMI大鼠Tie2 mRNA表達的影響（）Tab.1 Effect of atorvastatin on Tie2 mRNA expression in AMI rats（）

表1 阿托伐他汀對AMI大鼠Tie2 mRNA表達的影響（）Tab.1 Effect of atorvastatin on Tie2 mRNA expression in AMI rats（）

1）P ＜ 0.05 compared with the CG group.

阿托伐他汀作用AMI大鼠28 d時，Tie2mRNA的表達在AAG組及AG組、CG組中，組間表達無明顯差異（P＞ 0.05）；Ang-1mRNA的表達在AAG組及AG組及CG組，組間表達無統(tǒng)計學差異。見圖3，表1、2。

3 討論

在缺血性冠脈疾病中，形成冠狀動脈側(cè)支循環(huán)主要有3種途徑，即主干血管的延伸生長，毛細血管網(wǎng)絡(luò)的形成和側(cè)支動脈的產(chǎn)生［3］。他汀類藥物目前被廣泛應用于防治心腦血管疾病。研究［4］發(fā)現(xiàn)他汀類藥物除降脂作用外，還可以促進缺血組織中的血管再生成。通過增加冠狀動脈的側(cè)支循環(huán)來治療AMI，但其具體機制尚不明確。

表2 阿托伐他汀對AMI大鼠Ang-1基因表達的影響（）Tab.2 Effect of atorvastatin on Ang-1 gene expression in AMI rats（）

表2 阿托伐他汀對AMI大鼠Ang-1基因表達的影響（）Tab.2 Effect of atorvastatin on Ang-1 gene expression in AMI rats（）

1）P ＜ 0.05 compared with the CG group.

圖3 阿托伐他汀對AMI大鼠Ang-1及Tie2的基因表達影響（藥物作用28 d）Fig.3 Effect of atorvastatin on gene expression of Ang-1 and Tie2 in AMI rats（28 d after drug action）

Ang/Tie2系統(tǒng)是調(diào)控血管新生的途徑［5-8］，其中Ang-1/Tie2途徑是維持血管完整性的重要因子，同時在新生血管形成、發(fā)展及成熟的過程中起重要作用［9］。JONES等［10］認為Ang-1與Tie2受體結(jié)合，能夠促進Tie2受體磷酸化，維持血管完整性并調(diào)節(jié)血管功能。YIN 等［11］研究證實Ang-1通過PI3信號傳導通路激活Tie2，改善心肌老化。KIM［12］提出Ang-1通過抑制高脂血癥誘發(fā)的冠狀動脈內(nèi)皮細胞的凋亡，維持內(nèi)皮細胞穩(wěn)定性。陳仕林等［13］的研究證明，用Ang-1基因干預治療的AMI心肌周圍毛細血管密度顯著高于正常對照組。VASA等［14］的研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物能促進內(nèi)皮祖細胞動員、遷移以及分化，促進梗死區(qū)域血管再生。有研究［15-17］發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可通過PI3K/Akt信號傳導途徑促進血管新生。

本研究基于他汀類藥物在血管新生方面的作用，研究其在AMI血管新生過程的作用及其機制。結(jié)果顯示，14 d時Tie2 mRNA表達，AMI組與正常組相比，差異有統(tǒng)計學意義，AAG組與AG組Tie2mRNA差異有統(tǒng)計學意義，說明在AMI區(qū)域Tie2的表達升高，且Tie2在AAG組中表達明顯升高。14 d及28 d時Ang-1的表達正常組與AG組相比，AAG組與AG組相比，差異均無統(tǒng)計學意義。研究［18］發(fā)現(xiàn)，建立AMI模型后，在非梗死區(qū)心肌組織中Tie2mRNA表達沒有變化，而在梗死區(qū)心肌組織中表達明顯升高，Ang-1mRNA的表達水平在梗死區(qū)與非梗死區(qū)均無變化，本研究結(jié)果與其一致。研究中發(fā)現(xiàn)正常組與AG組Ang-1mRNA表達沒有差異，但AG組均數(shù)均比正常組大，說明Ang-1mRNA表達還是相對上調(diào)的，分析原因可能是與研究選取時間及樣本量有關(guān)。在14 d時AAG組Tie2mRNA表達較AG組升高，在28 d時Tie2的表達與正常組無差異，說明阿托伐他汀可能只具有在早期通過上調(diào)Tie2mRNA促進血管再生作用。Tie2mRNA表達是上調(diào)能夠激活了內(nèi)源性血管生成機制，Ang-1在內(nèi)皮細胞表達促進血管新生、成熟和穩(wěn)定［19］，但與本研究結(jié)果Tie2mRNA表達升高，Ang-1mRNA的表達無變化矛盾。進一步推測可能是阿托伐他汀藥物通過上調(diào)Tie2mRNA表達促進血管新生。

綜上所述，本研究基于他汀類藥物在血管新生方面的作用，研究其在AMI血管新生過程的作用及機制。Ang-1及Tie2的表達水平與AMI血管新生間呈一定的相關(guān)性。由此推測，阿托伐他汀鈣可能通過上調(diào)Tie2mRNA表達共同促進血管新生，Ang-1是他汀類藥物促血管新生的重要介導因素，這可能為阿托伐他汀在促進新生血管，治療缺血性心臟病的臨床應用提供了理論依據(jù)。