郭曉曉, 農(nóng)葉琳, 王 平, 袁久剛, 余圓圓, 王 強

(江南大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點實驗室,江蘇 無錫 214122)

殼寡糖(chitooligosaccharide,COS)是通過化學(xué)或酶解法制備的幾丁質(zhì)或殼聚糖的降解產(chǎn)物,由β-1-4糖苷鍵連接而成的低聚合度氨基葡萄糖[1]。與殼聚糖相比,COS不僅具有優(yōu)異的水溶性、生物降解性和生物相容性[2]等理化性質(zhì),還具有多種生物學(xué)效應(yīng),包括抗炎[3]、抗菌[4-5]、抗氧化[5-6]等。COS無毒且可生物降解,在食品、制藥等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[7]。絲膠蛋白(silk sericin,SS)來源于桑蠶絲脫膠,由18種氨基酸組成,其中極性氨基酸含量較高[8]。絲膠有良好的生物相容性和低免疫原性,在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景[9],其缺點是水溶性較高,材料成型性較差[10]。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(TGase,EC 2.3.2.13)能催化蛋白質(zhì)或肽鏈中谷氨酰胺殘基上的γ-羧酰胺基和伯胺基之間的酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng),使蛋白質(zhì)大分子間發(fā)生交聯(lián)[11-12]。絲膠蛋白中含谷氨酸(部分以谷氨酰胺的形式存在)、賴氨酸和大分子鏈末端的氨基,為基于TGase催化的絲膠酶促改性提供了可能。本文以TGase催化絲膠蛋白自交聯(lián)(圖1(a)),提高絲膠材料的成型性;在此基礎(chǔ)上,以TGase與COS組合處理絲膠蛋白,賦予絲膠蛋白較好的抗菌性和抗氧化性能(圖1(b)),旨在提升絲膠膜材料的成型效果和功能性。

圖1 反應(yīng)機理Fig.1 Reaction mechanism

1 實 驗

1.1 材 料

桑蠶生絲(5A級,鑫緣繭絲綢集團(tuán)股份有限公司),TGase(1 000 U/g,江蘇一鳴生物制品有限公司),COS(相對分子質(zhì)量2 kDa,上海寶曼生物科技有限公司),含谷氨酰胺的多肽(氨基酸序列GQGEGQG,簡稱P,純度≥98%,鄭州派和泰德醫(yī)藥科技有限公司),ABTS(純度≥98%,上海寶曼生物科技有限公司),胰蛋白胨、瓊脂粉、氯化鈉等試劑(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 桑蠶脫膠

堿脫膠法:將一定量的生絲用去離子水洗凈后,以0.1 g/L碳酸鈉在100 ℃脫膠4 h,浴比1︰50。脫膠后獲得的溶液轉(zhuǎn)移至透析袋(Mw 8 000～14 000 Da)中,以去離子水透析去除鹽和小分子雜質(zhì),得到絲膠溶液,以稱量法標(biāo)定其濃度后在4 ℃條件下儲存,該條件下脫膠樣品記為SS。

高溫高壓法:按上述方法準(zhǔn)備生絲樣品,等量分成若干份置于高溫染色杯中,加入去離子水,浴比1︰10,將染杯放入紅外線高溫高壓小樣機上,在120 ℃脫膠1 h,然后透析除雜和標(biāo)定絲膠溶液濃度,在4 ℃條件下儲存,該條件下脫膠樣品記為HSS。

1.2.2 絲膠膜制備

以30%聚乙二醇溶液將反應(yīng)前后的絲膠蛋白溶液濃縮到4%,取25 mL絲膠溶液與5‰甘油均勻混合后,采用流延法倒入聚四氟乙烯(PTFE)模具中,室溫條件下風(fēng)干3～4 d得到風(fēng)干膜[13-14];將風(fēng)干膜在室溫下用75%乙醇醇化30 min后,室溫晾干備用。

1.2.3 TGase催化含谷氨酰胺多肽接枝殼寡糖

選擇含谷氨酰胺的多肽(P)作為絲膠的模型物,參照TGase酶促改性的方法[11-12],催化多肽與COS交聯(lián)。具體反應(yīng)條件為:將2 mmol/L多肽、5 g/L COS和2 U/mL TGase在pH 6、40 ℃下處理8 h,考察酶處理后體系釋氨量與游離氨基的變化。同時,對照探究了僅以TGase處理COS的效果(樣品記為COS/TGase)。

1.2.4 TGase催化絲膠接枝殼寡糖

參照本文既有TGase酶促改性的方法[11-12],將20 g/L SS或HSS溶液與5 g/L COS、2 U/mL TGase在pH 6、40 ℃下處理20 h,測定體系絲膠蛋白相對分子質(zhì)量和釋氨量的變化。作為對照樣,絲膠與COS混合樣、絲膠與TGase混合樣也分別在相同的溫度和pH值條件下進(jìn)行處理。

1.3 分析測試

1.3.1 釋放氨含量的測定

采用靛酚藍(lán)法測定TGase催化反應(yīng)中釋氨量[15]。以氨質(zhì)量濃度為1～7 μg/mL硫酸銨溶液作為標(biāo)準(zhǔn)液,質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo),637 nm處吸光度Ai為縱坐標(biāo),繪制釋氨量標(biāo)準(zhǔn)曲線:Ai=0.096C+0.022,R2=0.999 07。

1.3.2 氨基含量分析

絲膠溶液中氨基的含量采用茚三酮法測定[16]。以不同質(zhì)量濃度甘氨酸(Gly)與茚三酮溶液進(jìn)行顯色反應(yīng),得到游離氨基濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=0.250 6X+0.017 1,R2=0.996 47,其中Y為568 nm溶液吸光度,X為甘氨酸質(zhì)量濃度(10-5g/mL)。

1.3.3 體積排阻色譜(SEC)

絲膠蛋白溶液經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾后,用Ultrahydrogel linear柱在高效液相色譜儀中分析絲膠蛋白相對分子質(zhì)量。以pH7、0.05 M的磷酸鈉鹽,0.3 M的NaCl磷酸鹽緩沖液為洗脫液,洗脫速度0.5 mL/min,柱溫25 ℃,檢測在214 nm處樣品洗脫曲線。

1.3.4 絲膠膜溶失率分析

稱取一定質(zhì)量的醇化后的絲膠風(fēng)干膜(質(zhì)量記為m0),將其在105 ℃下烘干至衡定質(zhì)量m,由式(1)計算得到相同大氣條件下樣品的含水率w%。將不同絲膠膜樣品稱重(M),然后在37 ℃水浴中振蕩處理不同時間(浴比1︰100)后,將殘留膜材料過濾后在105 ℃烘干,然后稱得質(zhì)量為M′[9]。參照式(2)計算3個平行樣的溶失率(DR%)平均值。

(1)

(2)

1.3.5 絲膠膜機械性能分析

以YG141織物測厚儀測定絲膠風(fēng)干膜的厚度,再借助3385H型電子萬能材料測試儀(美國Instron公司),測定未醇化絲膠風(fēng)干膜的機械性能。樣品尺寸75 mm×5 mm,測試前在20 ℃、RH=65%的恒溫恒濕箱中平衡24 h,拉伸速度10 mm/min,夾距30 mm。每個樣品重復(fù)測試10次,分別得出樣品斷裂強度和斷裂伸長率。

1.3.6 絲膠膜抗氧化性分析

將7 mM ABTS和2.45 mM過硫酸鉀等體積混合,室溫下暗處儲存12 h反應(yīng),制備ABTS·+陽離子自由基。使用前將ABTS·+溶液用磷酸鹽緩沖液(0.1 M、pH 7.4)稀釋,于734 nm處達(dá)到0.700±0.050吸光度[17]。將不同膜樣品加入10 mL ABTS·+溶液反應(yīng)30 min,立即測定734 nm下吸光度,ABTS·+清除能力通過式(3)計算。

(3)

式中:A0是不含樣品的吸光度,Ai是含樣品的吸光度。

1.3.7 絲膠膜抗菌性能分析

參考GB/T 20944.3—2008《紡織品 抗菌性能評價振蕩法》,通過對革蘭氏陰性菌大腸桿菌(ATCC 25922)的抑菌率,定量評價不同絲膠膜的抗菌性[5]。抗菌率根據(jù)式(4)計算。

(4)

式中:C代表空白樣菌落數(shù),C′代表絲膠膜樣品的菌落數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TGase催化含谷氨酰胺多肽與殼聚糖交聯(lián)

為探究圖1中TGase催化絲膠與COS交聯(lián)反應(yīng)的可行性,以含谷氨酰胺(Q)的多肽作為絲膠模型物,進(jìn)行酶促接枝反應(yīng)。測定催化體系釋氨量,評價多肽和COS間的酶促反應(yīng)效率,結(jié)果見圖2(a);借助茚三酮法測定TGase催化前后反應(yīng)溶液中游離氨基變化,結(jié)果見圖2(b)。

圖2 TGase催化多肽-殼寡糖反應(yīng)中體系變化Fig.2 Changes in the reaction system of TGase-catalyzed polypeptide-chitosan oligosaccharide

圖2(a)中樣品COS、COS/TGase和COS/P的氨質(zhì)量濃度分別為0.386、0.389 μg/mL和0.326 μg/mL,主要是由于空中的少量氨易溶于水所致;酶催化多肽與COS反應(yīng)后,氨質(zhì)量濃度從0.326 μg/mL增加到3.346 μg/mL,表明TGase催化含谷氨酰胺的多肽與COS發(fā)生?；D(zhuǎn)移反應(yīng)。對比結(jié)果發(fā)現(xiàn),圖2(b)中COS/P/TGase體系中氨基總量顯著減少,證實了酶促多肽與殼寡糖發(fā)生了反應(yīng)。

2.2 酶促絲膠-殼聚糖交聯(lián)對體系分子量的影響

在TGase的催化下含谷氨酰胺的多肽能夠與COS發(fā)生反應(yīng),為酶促絲膠蛋白的改性奠定了基礎(chǔ)?？疾旆磻?yīng)體系相對分子質(zhì)量變化,探究TGase催化絲膠接枝殼寡糖的反應(yīng)效果,結(jié)果見圖3。其中,SEC圖譜中初始保留時間可反映蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量變化,當(dāng)相對分子質(zhì)量增加時,初始保留時間將向前遷移。

圖3 TGase催化絲膠-殼寡糖交聯(lián)后溶液體系的SEC圖Fig.3 SEC of the solution system after TGase-catalyzed crosslinking between sericin and chitosan oligosaccharide

圖3中未處理絲膠SS在18 min處有最大洗脫峰;TGase處理樣品(SS/TGase)出峰時間相對于未處理樣提前2 min,主要歸咎于酶促絲膠谷氨酰胺殘基與賴氨酸殘基間交聯(lián),使絲膠蛋白體系的相對分子質(zhì)量增大。酶促接枝的樣品SS/COS/TGase在13～17 min的出峰時間比SS/TGase稍晚,其原因在于絲膠自交聯(lián)、絲膠-COS接枝兩種交聯(lián)為競爭性反應(yīng),即當(dāng)絲膠與相對分子質(zhì)量較低的COS接枝時,一定程度上抑制了絲膠蛋白自交聯(lián)。實驗中測定了TGase催化前后絲膠溶液的氨含量,結(jié)果如圖4所示。

圖4 TGase催化絲膠-殼寡糖交聯(lián)后體系釋氨量的濃度Fig.4 The concentration of released ammonia after TGase-catalyzed crosslinking between sericin and chitosan oligosaccharide

圖4中經(jīng)TGase催化后,體系中氨質(zhì)量濃度從0.125 μg/mL增加到1.895 μg/mL,表明SS經(jīng)過TGase催化后發(fā)生自交聯(lián)反應(yīng),增加了反應(yīng)體系中氨的質(zhì)量濃度。對于SS/COS/TGase樣品,釋放氨的質(zhì)量濃度顯著增加至2.218 μg/mL,與SS/TGase樣品相比,釋氨量的質(zhì)量濃度提高了14.56%。這與圖3的結(jié)果一致,驗證了該反應(yīng)體系具有更高的酶催化效率。

2.3 酶促絲膠-殼聚糖交聯(lián)對膜材料力學(xué)性能和成型性的影響

為考察桑蠶絲脫膠方法對酶促反應(yīng)后絲膠材料性能的影響,實驗中分別以堿法脫膠(SS)和高溫高壓脫膠(HSS)的絲膠為原料,進(jìn)行TGase酶促絲膠接枝COS。酶促反應(yīng)后,分別制備不同風(fēng)干膜,對比測定膜材料的力學(xué)性能,結(jié)果如圖5所示。

圖5 TGase催化絲膠-殼寡糖交聯(lián)后絲膠膜的力學(xué)性能Fig.5 Mechanical properties of the membranes after TGase-catalyzed crosslinking between sericin and chitosan oligosaccharide

圖5(a)中未處理的SS膜斷裂強度、斷裂伸長率最低,SS/TGase樣品的斷裂強度較高,表明酶催化中絲膠大分子間發(fā)生交聯(lián)。圖3中COS對絲膠膜有一定的增塑作用,SS/COS膜材料斷裂伸長率較SS試樣增加,添加TGase酶促交聯(lián)后膜強度進(jìn)一步增加。兩種脫膠方法相比,圖5(b)中高溫高壓脫膠后的絲膠膜強度略高,這是因為前者脫膠中絲膠水解較少所致,酶促反應(yīng)后HSS樣品的力學(xué)變化規(guī)律與圖5(a)類似。

圖6 TGase催化絲膠-殼聚糖交聯(lián)對絲膠膜水溶失率的影響Fig.6 Effect of TGase-catalyzed crosslinking between sericin and chitosan oligosaccharide on dissolve-loss ratio of the sericin membranes

分別測定酶促發(fā)應(yīng)后上述膜材料在水相中的溶失率,結(jié)果見圖6。其中,SS膜浸泡1 h后溶失率達(dá)60%左右;SS/TGase樣品1 h后溶失率降低至約47%,歸咎于酶促反應(yīng)中絲膠蛋白相對分子質(zhì)量增加,形成的蛋白分子間網(wǎng)絡(luò)使得膜在水中溶失率降低。SS/COS/TGase樣品較SS/TGase溶失率有所增加,表明蛋白相對分子質(zhì)量的大小對膜材料成型性有很大的影響,這與圖3中體系相對分子質(zhì)量變化規(guī)律相一致。類似地,高溫高壓脫膠樣品的水溶失率整體比較低,說明較高相對分子質(zhì)量的絲膠有利于材料成型。

2.4 酶促絲膠-殼聚糖交聯(lián)對膜材料抗氧化和抗菌性的影響

殼寡糖由于含有羥基、氨基等活性基團(tuán)而具有強的抗氧化活性,酶促接枝具有抗氧化效果的COS可賦予絲膠膜材料清除自由基的能力。實驗中對比考察了浸泡不同時間后,不同絲膠膜對ABTS·+自由基的清除效果,結(jié)果見圖7。

圖7 TGase催化絲膠-殼聚糖交聯(lián)對絲膠膜材料抗氧化性的影響Fig.7 Effect of TGase-catalyzed cross-linking between sericin and chitosan oligosaccharide on antioxidant activity of the sericin membranes

圖7中隨著絲膠膜在水中的浸泡時間延長,不同絲膠膜對自由基的清除效果均有所下降,分析認(rèn)為是浸泡中部分殼寡糖可能隨絲膠的溶解而流失,使膜材料抗氧化性下降。在水中浸漬1 h后,SS/COS與SS/COS/TGase膜材料對ABTS自由基的清除率差不多;浸漬2 h后,SS/CS/TGase和HSS/CS/TGase膜對ABTS自由基的清除率比相應(yīng)的共混樣要好,這主要是因為絲膠與殼聚糖之間不僅存在氫鍵,還以共價鍵的方式與絲膠結(jié)合,降低浸泡過程中COS的流失,這與圖6述及的溶失率結(jié)果相一致。

COS含較豐富的氨基,表現(xiàn)出一定的抗菌效果。本文選用大腸桿菌作為革蘭氏陰性菌代表,對水相中浸泡不同時間后絲膠膜材料的抑菌率進(jìn)行測定,結(jié)果如圖8所示。

圖8 TGase催化酶促絲膠-殼寡糖交聯(lián)對絲膠膜材料抗菌性的影響Fig.8 Effect of TGase-mediated cross-linking between sericin and chitosan oligosaccharide on antibacterial activity of the sericin membranes

從圖8可以看出,SS/COS膜樣品對大腸桿菌的抗菌率為86.89%;浸處理1 h后樣品SS/COS對大腸桿菌的抗菌效果降至55.56%。與之相比,樣品SF/COS/TGase在水中浸泡處理1 h后,對大腸桿菌的抗菌率從88.56%下降到65%,下降率較低,表明TGase催化處理后膜材料的成型性有一定程度的提升。以高溫高壓脫膠制備的絲膠樣品的抗菌效果優(yōu)于堿法脫膠的絲膠樣品,其中試樣HSS/COS/TGase在水相中浸漬1 h后抑菌率仍大于80%。以上研究表明,高溫高壓法脫膠和酶促接枝COS組合應(yīng)用時,能顯著提升絲膠蛋白膜的抗菌效果。

3 結(jié) 論

1)TGase可催化絲膠蛋白分子間交聯(lián)和絲膠與殼寡糖接枝;兩者相比,前者對體系相對分子質(zhì)量增加更明顯,其原因與COS相對分子質(zhì)量較低、絲膠自交聯(lián)和絲膠-COS接枝為競爭性反應(yīng)相關(guān)。

2)與絲膠/COS共混樣相比,TGase酶促接枝COS的膜材料在水中的溶失率降低,抗氧化性和抗菌性較好;高溫高壓法脫膠與堿法脫膠相比,以前者為原料酶法制備的絲膠膜材料具有更好的應(yīng)用性能。研究表明,TGase催化絲膠接枝COS為實現(xiàn)絲膠資源化再利用提供了新方法。

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