魏 永李曉娟姜棋予張 鵬馮 帆李瑞生*王 科*

(1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院,泌尿外科,青島 266000;2.中國人民解放軍海軍第971醫(yī)院,泌尿外科,青島 266071;3.中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心,臨床研究管理中心,北京 100039;4.中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心,泌尿外科,北京 100853)

腎癌是一種常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤,其最為主要的病理類型是腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)[1],其中透明細(xì)胞腎癌(clear renal cell carcinoma,ccRCC)是RCC的主要病理類型,約占RCC發(fā)病總數(shù)的85%以上[2]。目前,外科手術(shù)切除雖然是原發(fā)性腎癌的首選方案,但罹患多發(fā)彌散腎癌以及腎癌復(fù)發(fā)的患者難以接受外科手術(shù)治療,總體預(yù)后較差[1-2]。對這些患者,分子靶向治療(服用各種口服小分子蛋白激酶抑制劑)是其主要治療策略[3-4]。盡管如此,腎癌分子靶向治療仍存在諸多問題[3-4]：存在個體差異、存在藥物耐受(drugresistance)現(xiàn)象、費用昂貴等。因此,研究和建立相關(guān)研究模型與研究方法,預(yù)測患者對分子靶向藥物的敏感性具有重要的理論和實踐意義。腎癌相關(guān)研究的主要模型包括利用現(xiàn)有的腎癌細(xì)胞系(如Caki-1、Caki-2以及786-O)進(jìn)行體外培養(yǎng)或接種免疫缺陷動物建立腫瘤抑制模型[5]。最近的研究顯示,收集腫瘤組織標(biāo)本,從中分離出單個細(xì)胞建立患者來源的細(xì)胞系(patients-derived cells,PDCs)具有重要意義[6]：(1)與現(xiàn)有細(xì)胞系相比,PDCs更為貼近臨床實際;(2)利用PDCs接種免疫缺陷動物能夠獲得患者來源的腫瘤細(xì)胞動物模型(patientderived tumor xenograft model,PDX model),開展相應(yīng)腫瘤學(xué)、腫瘤藥理學(xué)研究工作;(3)靈活運用PDCs、PDXs等模型能夠?qū)颊唧w內(nèi)腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性進(jìn)行預(yù)測。因此,本研究著眼于ccRCC這一最為常見和有代表性獲得與制備了5株ccRCC的PDCs,利用這5株P(guān)DCs接種建立了PDX模型,檢測了這些 PDCs對分子靶向藥物舒尼替尼(Sunitinib)、索拉非尼(Sorafenib)、樂伐替尼(Lenvatinib)、瑞戈非尼(Regorafenib)、阿帕替尼(Apatinib)以及安羅替尼(Anlotinib)的敏感性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級BALB/c裸鼠,4周齡,體重13～15 g,400只,雌性,均購自北京斯貝福生物科技有限公司[SCXK(京)2016-0002];動物飼養(yǎng)于解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心動物[SYXK(軍)2017-0016]。動物飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22℃～25℃,濕度40%,自由進(jìn)食和飲水。本實驗通過了解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心動物倫理委員會審查(IACUC-2017-009)。在實驗過程中,嚴(yán)格按實驗動物使用的3R原則給予實驗動物福利。

1.1.2 細(xì)胞系

5例患者來源的ccRCC細(xì)胞系、現(xiàn)有腎癌細(xì)胞系Caki-1與Caki-2由中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心泌尿外科張鵬博士惠賜。

1.2 主要試劑與儀器

分子靶向藥物：舒尼替尼(Sunitinib,產(chǎn)品編號為S7781)、索拉非尼(Sorafenib,產(chǎn)品編號為S7397)、樂伐替尼(Lenvatinib,產(chǎn)品編號為S4371)、瑞戈非尼(Regorafenib,產(chǎn)品編號為S1178)、阿帕替尼(Apatinib,產(chǎn)品編號 S5248)以及安羅替尼(Anlotinib,產(chǎn)品編號為 S8726)等均購買自美國Selleck公司;細(xì)胞/組織樣品總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄(reverse transcription)以及qPCR等試劑盒均為美國ABI公司產(chǎn)品;吸入麻醉劑異氟烷(isoflurane)購買自深圳瑞沃德公司;手術(shù)的器械和材料等動物實驗常規(guī)材料由本實驗室保存;實時定量PCR儀(qPCR儀,美國ABI公司,ABi-7500型號)等均由本實驗室提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 分子靶向藥物溶液配制

以有機溶劑DMSO、吐溫80以及PEG400(國藥集團北京公司)充分溶解藥物粉末(得到藥物母液),使用生理鹽水對藥物母液進(jìn)行稀釋(通過攪拌和超聲震蕩等以避免藥物析出),最終溶液中的有機溶劑DMSO不超過1‰、吐溫80以及PEG400不超過 2‰[7-8]。

1.3.2 定量PCR實驗

收集ccRCC細(xì)胞樣品(包括ccRCC現(xiàn)有細(xì)胞系、Caki-1、Caki-2、786-O以及ccRCC 的 PDCs)或腫瘤組織樣品(將ccRCC的PDCs接種裸鼠形成皮下腫瘤,再收集皮下腫瘤樣品),提取總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,再進(jìn)行qPCR實驗檢測ccRCC細(xì)胞中分子靶向藥物目的作用靶標(biāo)(包括各種受體酪氨酸蛋白激酶VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-α、PDGFR-β 以及 c-Kit;以及MAPK、PI3K/AKT信號通路的主要蛋白激酶AKT、ERK-1以及 ERK-2)。qPCR定量方法為SYBR Green 染色法(2-△△CT法),以肌動蛋白β-Actin為參比,依據(jù)定量PCR實驗中各目標(biāo)基因的相對表達(dá)水平[9-10]。引物序列見表1。

目標(biāo)基因在ccRCC細(xì)胞中的表達(dá)水平結(jié)果顯示為其相對于內(nèi)參β-Actin的相對表達(dá)水平對所得qPCR的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析：(1)以前述分子靶向藥物作用靶標(biāo)在ccRCC PDCs以及ccRCC細(xì)胞系中的表達(dá)水平(目標(biāo)基因相對于內(nèi)參β-Actin的相對表達(dá)水平)分別繪制熱圖(heatmap);(2)對于ccRCCPDCs,分別檢測在經(jīng)過體外培養(yǎng)后的系列時間點(體外培養(yǎng)1周、培養(yǎng)2周和培養(yǎng)3周)時,ccRCCPDCs中前述分子靶向藥物作用靶標(biāo)的表達(dá)量,依據(jù)其表達(dá)變化(與對照組,未經(jīng)體外培養(yǎng)的ccRCCPDCs細(xì)胞相比,經(jīng)過體外培養(yǎng)的ccRCCPDCs中基因的表達(dá)變化倍數(shù)(folds),其中表達(dá)增加為正值,表達(dá)下降為負(fù)值)繪制熱圖;(3)對于ccRCCPDCs,分別檢測在經(jīng)過體內(nèi)擴增(通過裸鼠成瘤作用實現(xiàn)體內(nèi)擴增1次、擴增2次和擴增3次)后,ccRCCPDCs中前述分子靶向藥物作用靶標(biāo)的表達(dá)量,依據(jù)其表達(dá)變化(與對照組,未經(jīng)體內(nèi)擴增ccRCCPDCs細(xì)胞相比,經(jīng)過體內(nèi)擴增的ccRCCPDCs中基因的表達(dá)變化倍數(shù)(folds),其中表達(dá)增加為正值,表達(dá)下降為負(fù)值)繪制熱圖。

1.3.3 ccRCC細(xì)胞的體外培養(yǎng)及在裸鼠中的擴增

收集得到ccRCC的腫瘤組織(包括腫瘤組織以及少量外科手術(shù)切除中連帶的癌旁組織),將腫瘤組織和癌旁組織進(jìn)行分離后,取少許組織(包括腫瘤組織和癌旁組織)做HE染色進(jìn)行病理分析確證組織標(biāo)本的特異性,再將所獲得的腫瘤組織進(jìn)行下一步實驗。使用鋼篩(200目)對所得ccRCC腫瘤組織進(jìn)行研磨,收集研磨所得的細(xì)胞懸液即獲得ccRCC的PDCs[11]。對于所獲得的ccRCC的PDCs：(1)在液氮中凍存?zhèn)溆?(2)對ccRCC PDCs進(jìn)行體外培養(yǎng);(3)將ccRCCPDCs接種裸鼠皮下形成腫瘤組織。體外培養(yǎng)實驗：使用添加有 10%FBS的DMEM培養(yǎng)ccRCC細(xì)胞Caki-1等或ccRCC PDCs,再收集細(xì)胞按照前述方法進(jìn)行定量PCR檢測;裸鼠皮下成瘤實驗：制備前述ccRCC PDCs細(xì)胞懸液后,使用注射器將ccRCC PDCs細(xì)胞懸液接種于裸鼠皮下(每個接種點接種約6×106個細(xì)胞,體積約0.3 mL)[12]。3～4周后,ccRCC PDCs能夠在裸鼠皮下形成腫瘤組織,剖取腫瘤組織表面性狀較好的部分制備為腫瘤組織微塊,將組織微塊接種于裸鼠皮下,再次形成皮下腫瘤組織,此為利用裸鼠成瘤作用實現(xiàn)1次ccRCC PDCs的體內(nèi)擴增。在此基礎(chǔ)上,收集原始ccRCC PDCs以及經(jīng)過3次體內(nèi)擴增后的ccRCC PDCs腫瘤組織中的總RNA樣品,依據(jù)前述方法進(jìn)行定量PCR實驗。對于患者來源的ccRCC細(xì)胞的保存,分別通過：(1)依據(jù)前述方法收集獲ccRCC腫瘤組織,通過研磨的方法獲得ccRCC細(xì)胞(I代),直接在液氮中保存作為原始細(xì)胞庫;(2)將直接從ccRCC組織標(biāo)本中分離得到的ccRCC細(xì)胞(I代)接種裸鼠形成腫瘤組織以實現(xiàn)擴增,再收集裸鼠皮下腫瘤組織研磨以大量的ccRCC細(xì)胞(II代),將細(xì)胞在液氮凍存保存并進(jìn)行后續(xù)實驗。

表1 引物序列Table 1 Sequences of the primers

1.3.4 分子靶向藥物對腎腫瘤動物模型的治療

將前述(1.3.3部分所述)II代的ccRCC PDCs接種裸鼠皮下,接種3～4 d后以口服灌胃給藥方式給予裸鼠2 mg/kg的分子靶向藥物,每2 d給藥一次,經(jīng)過15次治療后,收集腫瘤組織標(biāo)本,使用游標(biāo)卡尺測量皮下腫瘤的長度與寬度,計算腫瘤體積=腫瘤長軸長度×腫瘤短軸長度×腫瘤短軸長度/2[13]。同時對腫瘤組織進(jìn)行稱重,計算抑制率=(對照組腫瘤體積-藥物治療組腫瘤體積)/對照組腫瘤體積×100%或(對照組腫瘤重量-藥物治療組腫瘤重量)/對照組腫瘤重量×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ccRCC PDCs的制備及其質(zhì)量控制

首先獲得ccRCC組織標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)確認(rèn)(見圖1),確定收集的到的腫瘤組織的特異性,再利用ccRCC腫瘤組織制備得到了ccRCC PDCs,在PDCs以及ccRCC細(xì)胞系中檢測了分子靶向藥物的作用靶標(biāo)(包括系列受體酪氨酸蛋白激酶以及MAPK、PI3K/AKT信號通路的主要蛋白激酶)的表達(dá)量。結(jié)果顯示：分子靶向藥物的作用靶標(biāo)在ccRCCPDCs中的表達(dá)量顯著高于在ccRCC細(xì)胞系中的表達(dá)量(見圖2)。在此基礎(chǔ)上,分別通過體外培養(yǎng)或體內(nèi)擴增(在裸鼠體內(nèi)通過成瘤作用實現(xiàn)擴增)的方法對ccRCC PDCs進(jìn)行擴增,再檢測不同擴增方法對分子靶向藥物作用靶標(biāo)的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：體外長期培養(yǎng)ccRCC的PDCs(持續(xù)培養(yǎng)1周、2周或3周),分子靶向藥物的作用靶標(biāo)表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào),而通過裸鼠成瘤作用實現(xiàn)ccRCC PDCs的擴增(通過裸鼠成瘤的方法對ccRCC PDCs實現(xiàn)3次擴增),ccRCC PDCs中分子靶向藥物作用靶標(biāo)的表達(dá)能夠保持穩(wěn)定(見圖3)。這表明,通過裸鼠成瘤作用實現(xiàn)ccRCC PDCs的擴增能夠保持其自身特性的穩(wěn)定,反映出其在患者體內(nèi)的特征。

2.2 分子靶向藥物對ccRCC PDCs裸鼠成瘤的抑制活性檢測

結(jié)果顯示：分子靶向藥物能夠抑制ccRCCPDCs細(xì)胞在裸鼠皮下的成瘤作用,不同患者來源的PDCs對分子靶向藥物的敏感性存在患者的個體差異。進(jìn)一步,在所選分子靶向藥物中,舒尼替尼、索拉非尼、樂伐替尼、瑞戈非尼和安羅替尼對ccRCC PDCs裸鼠成瘤有明確的抗腫瘤活性(見圖4和表2),其中樂伐替尼的抗腫瘤活性優(yōu)于其他幾種分子靶向藥物(見圖4和表2),而阿帕替尼的抗腫瘤活性稍弱(圖4,表2)。在上述結(jié)果中(圖3,圖4,表2),圖4是所選6種分子靶向藥物對其中1株 ccRCC PDCs(2號ccRCC PDCs)在裸鼠皮下成瘤的抑制活性,而圖5則顯示為ccRCC代表性的分子靶向藥物(索拉非尼)對5株ccRCC PDCs在裸鼠中皮下成瘤的抑制活性。表2為所選6種分子靶向藥物對5株ccRCC PDCs在裸鼠皮下成瘤的抑制活性(結(jié)果顯示為藥物分別對腫瘤大小與腫瘤體積的抑制率)。

圖1 ccRCC組織標(biāo)本的病理染色結(jié)果(HE染色)Note.A,ccRCC tissue.B,aired non-tumor tissue.Figure 1 Pathological staining results of ccRCC tissue specimens(HE staining)

圖2 分子靶向藥物作用靶標(biāo)熱圖Note.Relative to the expression level of internal referenceβ-actin.Figure 2 Thermogram of targets targeted by molecules targeted drugs

圖3 通過體外培養(yǎng)或裸鼠成瘤作用實現(xiàn)ccRCC PDCs的擴增以及不同擴增方法對ccRCC PDCs中分子靶向藥物作用靶標(biāo)表達(dá)的影響Note.The left part is amplification of ccRCC PDCs by in vitro culture.The right part is amplification of ccRCC PDCs in nude mice.Heat maps were drawn based on folds of target genes’expression changes in the different groups and control groups(folds,positive up/increasing,down negative/decreasing).Figure 3 Amplification of ccRCCPDCs by in vitro culture or tumor formation in nude mice and the effect of different amplification Methods on target expression of the targets of molecular targeting agents in ccRCC PDCs

表2 分子靶向藥物對ccRCCPDCs皮下腫瘤抑制率(±s)Table 2 The inhibitory rates of molecular targeting agents on five lines of ccRCCPDCs’ subcutaneous growth in nude mice

表2 分子靶向藥物對ccRCCPDCs皮下腫瘤抑制率(±s)Table 2 The inhibitory rates of molecular targeting agents on five lines of ccRCCPDCs’ subcutaneous growth in nude mice

細(xì)胞系Cell lines檢測指數(shù)Detection index藥物對ccRCC-PDCs裸鼠皮下生長的抑制率(images/111.png±s)Inhibitory rates of agents on ccRCCPDCs’subcutaneous growth in nude mice瑞戈非尼Regorafenib樂伐替尼Lenvatinib索拉非尼Sorafenib舒尼替尼Sunitinib安羅替尼Anlotinib阿帕替尼Apatinib PDCs No 1腫瘤體積 Tumor volumes 51.93±7.66 60.91±4.66 52.27±5.09 43.86±4.68 54.55±5.84 25.40±2.85腫瘤重量 Tumor weights 55.31±6.87 61.35±4.91 47.29±6.75 33.10±3.57 54.59±5.35 29.91±5.64 PDCs No 2腫瘤體積 Tumor volumes 64.21±6.03 76.44±6.95 68.33±4.92 60.15±5.53 51.10±3.73 24.17±1.80腫瘤重量 Tumor weights 65.48±3.25 82.51±5.69 66.25±5.56 57.70±3.92 51.61±5.11 22.89±1.97 PDCs No 3腫瘤體積 Tumor volumes 61.81±5.88 70.67±7.71 48.51±5.94 49.85±5.11 50.55±6.17 21.33±4.93腫瘤重量 Tumor weights 60.72±6.88 72.20±6.92 54.34±6.87 50.22±5.17 49.53±7.09 22.39±4.07 PDCs No 4腫瘤體積 Tumor volumes 46.58±4.53 60.36±3.73 38.46±4.26 35.61±6.74 40.86±6.41 11.51±2.18腫瘤重量 Tumor weights 47.98±8.70 65.98±7.63 38.90±5.08 39.50±4.11 44.46±4.25 10.85±1.03 PDCs No 5腫瘤體積 Tumor volumes 50.02±3819 57.36±5.39 40.06±5.53 32.35±5.01 35.38±3.70 14.05±3.13腫瘤重量 Tumor weights 46.86±6.67 58.49±5.45 39.81±4.44 35.92±5.08 33.45±4.80 12.42±2.18

圖4 分子靶向藥物對ccRCC PDCs在裸鼠皮下成瘤的抗腫瘤作用Note.A,The results are shown as the represented images(from the No.2 ccRCC PDCs)of subcutaneous tumor tissues.B,inhibition rate of drug action calculated based on tumor volume.C,inhibition rate of drugaction calculated based on tumor weights.Compared with untreated group,*P＜0.05.Figure 4 The anti-tumor effect of molecularly targeted agents on the tumor formation of ccRCC PDCs in nude mice

圖5 索拉非尼對5株ccRCC PDCs在裸鼠皮下成瘤的抗腫瘤作用Note.A,Rrepresented images(from the No.1 to No.5 ccRCC PDCs)of subcutaneous tumor tissues.B,inhibition rate of drug action calculated based on tumor volume.C,inhibition rate of drug action calculated based on tumor weight.Compared with untreated group,*P＜0.05.Figure 5 The anti-tumor effect of Sorafenib on the tumor formation of the five lines of ccRCC PDCs in nude mice

3 討論

目前,分子靶向治療已成為各種無法接受外科手術(shù)切除的惡性腫瘤患者,如進(jìn)展期肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)等的主要治療策略[14]。Sorafenib是由拜耳公司(Bayer Corporation)研發(fā)并出品的分子靶向藥物,不僅能夠作為進(jìn)展期HCC的一線治療藥物,也廣泛應(yīng)用于腎癌的治療[15]。除Sorafenib外,舒尼替尼(Sunitinib)也被用于腎癌治療[16]。除此之外,一些新型分子靶向藥物如Lenvatinib(日本衛(wèi)材公司)[14]、Regorafenib(拜耳公司)[14];Anlotinib(正大天晴公司)與Apatinib(江蘇恒瑞公司)等也具有類似的作用機制[17-18]。本研究首先制備得到了患者來源的ccRCC細(xì)胞(PDCs),然后將PDCs接種裸鼠形成腫瘤細(xì)胞,通過灌胃給藥進(jìn)行分子靶向治療。結(jié)果顯示,本研究利用5例患者來源的ccRCC細(xì)胞成功建立了相關(guān)模型,所有5株細(xì)胞的數(shù)據(jù)均用表詳細(xì)列出,其中2號PDC作為代表性結(jié)果出示了腫瘤組織的照片。進(jìn)一步,所選5種分子靶向藥物對ccRCC PDCs的裸鼠成瘤作用有明確的抗腫瘤活性,其中Lenvatinib的抗腫瘤活性優(yōu)于其他幾種分子靶向藥物,而Apatinib的抗腫瘤活性稍弱。同時,分子靶向藥物的抗腫瘤活性依據(jù)ccRCC PDCs的患者來源具有患者個體差異。

一直以來,腎癌細(xì)胞系(ccRCC cell lines)是腎癌相關(guān)研究的常用和主要研究模型,但腫瘤細(xì)胞在患者體內(nèi)的存活與增殖受到腫瘤微環(huán)境、腫瘤組織間質(zhì)等的影響,與在體外培養(yǎng)存在巨大差距[19]?，F(xiàn)有腎癌細(xì)胞系在其建立和廣泛應(yīng)用過程中經(jīng)歷了體外長期培養(yǎng),其自身特性已發(fā)生了諸多變化。例如文中選用了最為常用和代表性的Caki-1細(xì)胞,在PubMed數(shù)據(jù)庫中檢索最早對其使用的記錄可上溯至1979年[20],因此現(xiàn)有細(xì)胞系從其建立到使用至今已經(jīng)歷了漫長的時間(逾數(shù)十年),已經(jīng)無法反映出現(xiàn)階段患者體內(nèi)ccRCC細(xì)胞的實際情況。為此,本研究獲得了ccRCC的PDCs,并建立了動物模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)過較長期的體外培養(yǎng),ccRCC PDCs中分子靶向藥物的作用靶標(biāo)有明顯下調(diào),而通過將PDCs接種裸鼠形成腫瘤的方式能夠?qū)崿F(xiàn)ccRCC細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的擴增,在這一過程中,分子靶向藥物的作用靶標(biāo)的表達(dá)基本穩(wěn)定。這表明,使用常規(guī)體外培養(yǎng)的方法對ccRCC PDCs進(jìn)行擴增,環(huán)境的改變(例如在體條件下腫瘤組織微環(huán)境等的缺失)會導(dǎo)致細(xì)胞逐漸丟失其原有的一些特性[19],這體現(xiàn)在本研究中即為ccRCC PDCs細(xì)胞中,多種受體酪氨酸蛋白激酶以及MAPK、PI3K/AKT等信號通路下游的蛋白激酶等的表達(dá)水平的下降,最終導(dǎo)致ccRCC PDCs的特征特別是對分子靶向藥物的敏感性會與其在患者體內(nèi)的情況存在巨大差異,無法準(zhǔn)確反映出實際情況。而在裸鼠體內(nèi)建立ccRCC PDCs細(xì)胞的腫瘤模型,裸鼠體內(nèi)的環(huán)境更易于保持ccRCC PDCs自身的原有特性,具有重要意義。

綜上所述,本研究不僅建立了基于ccRCC PDC的動物模型并檢測了不同分子靶向藥物對ccRCC PDCs在裸鼠體內(nèi)的抗腫瘤活性,還確定了不同擴增和保存方法對ccRCC PDCs自身生物學(xué)特性的影響。這不僅有助于發(fā)現(xiàn)和揭示受試分子靶向藥物新的適應(yīng)癥,也能夠為ccRCC分子靶向治療提供新的實驗依據(jù)和更為有效的動物模型。