賈 鸝楊志宏馬俊利

(唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,唐山 063300)

原發(fā)性肝癌為常見惡性腫瘤,具有起病隱匿、發(fā)展迅速、侵襲能力強(qiáng)等特征,患者一般預(yù)后較差,致死率極高,近年來(lái)發(fā)病率有升高趨勢(shì),在腫瘤致死原因中占第2位[1]。手術(shù)切除是治療肝癌的首要方法,但切除率并不高,影響長(zhǎng)期療效,因此有必要進(jìn)行深入研究肝癌分子發(fā)生機(jī)制,對(duì)于肝癌的預(yù)防、治療具有十分重要的臨床意義。腫瘤血管新生及代謝增強(qiáng),可進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的細(xì)胞增殖、侵襲、遷移,是造成腫瘤惡化的重要原因[2]。研究發(fā)現(xiàn)miR-200c在肝癌中呈低表達(dá),發(fā)揮抑癌基因的作用[3]。體外研究發(fā)現(xiàn)miR-200c可通過負(fù)調(diào)控鋅指蛋白(inc finger E-boxbinding protein,ZEB)參與腫瘤EMT過程,然而miR-200c/ZEB與肝癌血管形成的關(guān)系,目前尚不清楚[4]。貞芪扶正顆粒主要由女貞子、黃芪組成,具有提高免疫能力,及對(duì)骨髓、肝的保護(hù)作用,在腫瘤輔助治療中發(fā)揮重要作用,然而對(duì)肝癌血管形成的作用,目前尚不清楚,本研究制備肝癌模型大鼠,并給予貞芪扶正顆粒干預(yù),旨在探究其對(duì)肝癌大鼠血管形成的作用及可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

76只3月齡雄性Wistar大鼠,體重(200±10)g,SPF級(jí),購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0011],飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)動(dòng)物房[SYXK(京)2017-0022];飼養(yǎng)室溫為 23℃ ～25℃,空氣相對(duì)濕度為50%～70%,飼養(yǎng)1周后用于模型制備。本研究獲得華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意(IACUC20180419),并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

貞芪扶正顆粒購(gòu)于甘肅扶正藥業(yè)科技股份有限公司,批號(hào)：20171214,規(guī)格：每袋15 g;二乙基亞硝銨(Diethyl ammonium nitrite,DEN)(N0258)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;RIPA裂解液(P0013D)、HE染色試劑盒(C0105)購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所;免疫組化檢測(cè)試劑盒(I001-1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)(H044)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase,ALT)(C009-2-1)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase,AST)(C010-2-1)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所;RNA提取試劑盒(R1200)購(gòu)自北京索萊寶公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)檢測(cè)試劑盒(KK4652)購(gòu)于Sigma-Aldrich公司;兔抗鼠ZEb-2(ab138222)、VEGF抗體(ab53465)、山羊抗兔HRP標(biāo)記二抗(ab205719)購(gòu)于英國(guó)Abcam公司;兔抗鼠CD34(3569)、β-actin抗體(3700)購(gòu)自美國(guó)CST公司;ELX800自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)BioTECK公司;IPSE55I光學(xué)顯微鏡購(gòu)于日本尼康公司;Sysmex CHEMIX800型全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自日本希森美康公司;ChemiDoc XRS凝膠成像儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備

隨機(jī)挑選64只大鼠進(jìn)行肝癌模型復(fù)制,參照間斷小劑量DEN誘導(dǎo)肝癌大鼠法造模[5],腹腔注射0.2%DEN大鼠(20 mg/kg),每周給藥3次,持續(xù)4周,隨后停藥2周,第7周開始灌胃大鼠0.01%DEN,持續(xù)4周,第11周灌胃0.02%DEN,14周結(jié)束喂養(yǎng)。隨機(jī)選取2只大鼠處死后,切除瘤組織進(jìn)行病理組織學(xué)檢測(cè)造模是否成功。排除死亡大鼠,共48只大鼠造模成功,造模成功率為75.00%。另設(shè)12只大鼠作為對(duì)照組(Control),不進(jìn)行任何處理。

1.3.2 動(dòng)物分組與給藥

造模后將大鼠分為Model組、貞芪扶正顆粒組、si-miR-200c組、貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組,每組12只大鼠。貞芪扶正顆粒組：造模結(jié)束后給藥貞芪扶正顆粒,參考文獻(xiàn)[6],劑量為2.62 g/kg。si-miR-200c組：造模結(jié)束后注射20 pm si-miR-200c,參考文獻(xiàn)[7],劑量為20 pm。貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組：造模結(jié)束后用1 mL無(wú)菌注射器尾靜脈注射20 pm si-miR-200c,隨后給藥貞芪扶正顆粒,劑量為2.62 g/kg。 Control、Model組灌胃等量生理鹽水,各組均連續(xù)處理8周。

1.3.3 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

(1)樣本收集

末次處理后將大鼠麻醉后處理,沿腹中將腹腔剪開,游離腸系膜和腸管,暴露主動(dòng)脈后抽取2 mL腹主動(dòng)脈血,5000 r/min離心15 min,置于-20℃保存。血液采集后,迅速獲取肝組織,切除部分肝組織放置在4%多聚甲醛溶液中固定,另外一部分肝組織置于-80℃保存。

(2)血清 VEGF、ALT、AST 水平檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中VEGF水平,具體參考試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。ALT、AST水平用全自動(dòng)生化儀測(cè)定。

(3)HE染色觀察大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)變化情況

取出固定肝組織,沖洗后在分級(jí)乙醇溶液中脫水后,置于二甲苯中透明處理,石蠟包埋后,制備6μm厚度組織切片,60℃烘烤后經(jīng)二甲苯脫蠟、分級(jí)乙醇脫水后采用蘇木素染液對(duì)切片染色5 min,清水沖洗后置于1%鹽酸乙醇中30 s,沖洗后采用伊紅染液復(fù)染2 min,經(jīng)脫水、透明、封片后置于光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化情況。

(4)qRT-PCR法檢測(cè)肝組織中miR-200c表達(dá)

采取RNA提取試劑盒提取肝組織中總RNA,參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄后為cDNA,配制25μL擴(kuò)增體系：上下游引物分別為1.25μL,cDNA 2μL,2×SYBR Green反應(yīng)液 12.5μL,無(wú) RNA酶水 5.5 μL。反應(yīng)程序參數(shù)：95℃預(yù)變性15 min,94℃ 15 s,55℃ 30 s,40個(gè)循環(huán),每個(gè)樣本設(shè)定三個(gè)重復(fù)孔,采用2-ΔΔCt法計(jì)算肝組織中 miR-200c表達(dá)量。miR-200c上游引物序列：5’-GCCCGCTAATACTGCCG GGTA-3’;下游引物序列：5’-CAGTGCTGGGTCC GAGT-3’。 內(nèi)參 U6 上游引物序列：5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’;下游引物序列：5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。

(5)免疫印跡法檢測(cè)肝組織中ZEb-2、VEGF蛋白表達(dá)

取出保存肝組織,剪碎后添加RIPA裂解液裂解組織,5000 r/min離心20 min后,利用BCA試劑盒檢測(cè)組織蛋白總濃度,經(jīng)SDS-PAGE電泳后分離目的蛋白,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上,添加封閉液封閉后,將膜與兔抗鼠ZEb-2、VEGF、β-actin一抗抗體(1∶300)在4℃環(huán)境中過夜,次日室溫下添加二抗(1∶5000)孵育1 h,清洗后避光顯影,在凝膠成像儀內(nèi)觀察蛋白條帶,并采用Image-J軟件定量分析各個(gè)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

(6)免疫組化檢測(cè)檢測(cè)肝組織中ZEb-2、VEGF、MVD陽(yáng)性表達(dá)率

肝組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化后,加入 3%H2O2滅活過氧化物酶活,熱抗原修復(fù)后,用10%山羊血清封閉抗原,添加ZEb-2、VEGF、CD34一抗(1∶500),室溫下放置2 h后,置于4℃冰箱內(nèi)孵育過夜,室溫下添加二抗孵育1 h,避光下添加DAB顯色液顯色5 min,置于顯微鏡下觀察蛋白染色情況。ZEb-2陽(yáng)性：細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒為陽(yáng)性;VEGF、MVD：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒為陽(yáng)性。利用Image-J軟件定量分析陽(yáng)性表達(dá)率,陽(yáng)性表達(dá)率=染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)描述,多組間比較行單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩對(duì)比采用SNK-q檢驗(yàn),當(dāng)P＜0.05時(shí),則差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況比較

Control組大鼠飲食、精神狀態(tài)、活動(dòng)均正常;Model組大鼠進(jìn)食量減少,精神萎靡,毛發(fā)蓬亂。與Model組相比,貞芪扶正顆粒組大鼠狀態(tài)得到一定的改善,si-miR-200c組大鼠狀態(tài)更差,貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組變化不顯著。末次處理結(jié)束后,si-miR-200c組大鼠存活率最低,Control組大鼠生存率為100%,見表1。

表1 各組大鼠生存情況比較Table 1 Comparison of survival status of each group of rats

2.2 各組大鼠血清中VEGF及肝功能指標(biāo)變化情況

與 Control組相比,Model組 VEGF、ALT、AST 水平升高(P＜0.05)。與Model組相比,貞芪扶正顆粒組 VEGF、ALT、AST 水平降低,si-miR-200c組VEGF、ALT、AST 水平升高(P＜0.05)。 貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組 VEGF、ALT、AST水平低于 simiR-200c組(P＜0.05),見表 2。

2.3 HE染色觀察大鼠肝病理形態(tài)學(xué)變化情況

Control組肝組織細(xì)胞核染色清晰,細(xì)胞排列整齊;Model組癌細(xì)胞出現(xiàn)較明顯變形,細(xì)胞核變大,核質(zhì)比例增大,核仁染色不明顯,較多細(xì)胞核出現(xiàn)分裂,細(xì)胞排列彌散不規(guī)則,伴有變性、壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。貞芪扶正顆粒組肝組織細(xì)胞變形程度減輕,伴有少部分壞死細(xì)胞,癌細(xì)胞分化程度較高,炎性浸潤(rùn)程度降低;而si-miR-200c癌細(xì)胞明顯增多,細(xì)胞變形增加,分化程較低,出現(xiàn)大量壞死、變形、炎性細(xì)胞。貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組細(xì)胞變形、壞死數(shù)量有所減少,但與Model組相比無(wú)顯著性變化,見圖1。

表2 各組大鼠血清VEGF、ALT、AST水平比較(±s)Table 2 Comparison of serum VEGF,ALT,AST levels in each group

表2 各組大鼠血清VEGF、ALT、AST水平比較(±s)Table 2 Comparison of serum VEGF,ALT,AST levels in each group

注：與Control組相比,*P＜0.05;與Model組相比,#P＜0.05;與貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組相比,a P＜0.05。Note.Compared with control group,*P＜0.05.Compared with model group,#P＜0.05.Compared with Zhenqi Fuzheng granules+si-miR-200c Group,a P＜0.05.

組別Groups n 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(ng/L)VEGF谷丙轉(zhuǎn)氨酶(U/L)ALT谷草轉(zhuǎn)氨酶(U/L)AST Control組Control group 12 18.13±2.44 65.38±7.87 96.13±10.75 Model組Model group 8 283.19±31.36* 251.51±26.16* 285.46±33.23*貞芪扶正顆粒組Zhenqi Fuzheng granules group 10 225.28±33.25*#a 176.14±24.25*#a 161.16±27.36*#a si-miR-200c組si-miR-200c group 6 321.41±35.07*#a 284.86±25.36*#a 322.47±22.94*#a貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組Zhenqi Fuzheng granules+si-miR-200c group 8 275.32±36.27* 246.08±31.28* 272.97±25.19*

圖1 HE染色觀察大鼠肝組織病理形態(tài)情況Figure 1 Observe the pathological morphology of rat liver tissue by HE staining

2.4 貞芪扶正顆粒對(duì)肝組織中ZEB/miR-200c通路與VEGF表達(dá)的影響

與Control組相比,Model組 miR-200c表達(dá)降低,ZEb-2、VEGF蛋白表達(dá)升高(P＜0.05)。與Model組相比,貞芪扶正顆粒組miR-200c表達(dá)升高,ZEb-2、VEGF蛋白表達(dá)降低,si-miR-200c組miR-200c表達(dá)降低,ZEb-2、VEGF蛋白表達(dá)升高(P＜0.05)。貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組miR-200c表達(dá)高于si-miR-200c組,ZEb-2、VEGF蛋白表達(dá)低于 si-miR-200c組(P＜0.05),見圖2、表3。

2.5 貞芪扶正顆粒對(duì)肝組織中ZEb-2表達(dá)的影響

與Control組相比,Model組ZEb-2陽(yáng)性表達(dá)率升高(P＜0.05)。與Model組相比,貞芪扶正顆粒組ZEb-2陽(yáng)性表達(dá)率降低,si-miR-200c組ZEb-2陽(yáng)性表達(dá)率升高(P＜0.05)。貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組ZEb-2陽(yáng)性表達(dá)率低于 si-miR-200c組(P＜0.05),見圖 3、表 4。

圖2 免疫印跡法檢測(cè)大鼠肝組織ZEb-2、VEGF蛋白表達(dá)情況Note.A,Control group.B,Model group.C,Zhenqi Fuzheng granules group.D,si-miR-200c group.E,Zhenqi Fuzheng granules+si-miR-200c group.Figure 2 Detection of ZEb-2 and VEGF protein expression in rat liver tissue by Western blot

表3 各組肝組織中miR-200c、ZEb-2、VEGF表達(dá)比較(±s)Table 3 Comparison of miR-200c,ZEb-2,and VEGF expression in liver tissue of each group

表3 各組肝組織中miR-200c、ZEb-2、VEGF表達(dá)比較(±s)Table 3 Comparison of miR-200c,ZEb-2,and VEGF expression in liver tissue of each group

注：與Control組相比,*P＜0.05;與Model組相比,#P＜0.05;與貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組相比,a P＜0.05。Note.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with Model group,#P＜0.05.Compared with Zhenqi Fuzheng granules+si-miR-200c group,a P＜0.05.

Control組Control group 12 1.05±0.13 0.22±0.04 0.28±0.03 Model組Model group 8 0.42±0.05* 0.72±0.09* 0.66±0.07*貞芪扶正顆粒組Zhenqi Fuzheng granules group 10 0.64±0.09*#a 0.41±0.05*#a 0.39±0.05*#a si-miR-200c組si-miR-200c group 6 0.27±0.05*#a 0.84±0.08*#a 0.79±0.09*#a貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組Zhenqi Fuzheng granules+si-miR-200c group 8 0.40±0.07* 0.69±0.07* 0.68±0.08*

圖3 免疫組化檢測(cè)肝組織ZEb-2陽(yáng)性表達(dá)Figure 3 ZEb-2 positive expression in liver tissue detected by immunohistochemistry

2.6 貞芪扶正顆粒對(duì)肝組織中VEGF、微血管密度(MVD)表達(dá)的影響

與Control組相比,Model組VEGF、MVD陽(yáng)性表達(dá)率升高(P＜0.05)。與Model組相比,貞芪扶正顆粒組VEGF、MVD陽(yáng)性表達(dá)率降低,si-miR-200c組VEGF、MVD陽(yáng)性表達(dá)率升高(P＜0.05)。貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組VEGF、MVD陽(yáng)性表達(dá)率低于si-miR-200c組(P＜0.05),見圖4、表5。

表4 各組肝組織中ZEb-2陽(yáng)性表達(dá)比較Table 4 Comparison of ZEb-2 positive expression in liver tissue of each group

圖4 免疫組化檢測(cè)肝組織VEGF、MVD陽(yáng)性表達(dá)Figure 4 Immunohistochemical detection of positive expression of VEGF and MVD in liver tissue

表5 各組肝組織中VEGF、MVD陽(yáng)性表達(dá)比較Table 5 Comparison of positive expression of VEGF and MVD in liver tissue of each group

3 討論

DEN為亞硝基化學(xué)致毒劑,進(jìn)而機(jī)體后能夠使DNA雙鏈編碼錯(cuò)誤,進(jìn)而導(dǎo)致肝癌形成[8]。本研究采用改良DEN誘導(dǎo)法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組肝組織多數(shù)細(xì)胞壞死,伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),細(xì)胞不典型增生,發(fā)生水腫、纖維化,排列不規(guī)則,呈團(tuán)狀或索狀,彌漫性分組在組織中,這與肝癌病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果相符[9]。血清檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型組肝功能指標(biāo)ALT、AST水平顯著升高,表明模型大鼠肝功能受損,進(jìn)一步提示肝癌模型大鼠復(fù)制成功。

貞芪扶正顆粒主要由黃芪與女貞子兩味中藥材組成,藥理學(xué)研究顯示其可保護(hù)骨髓與腎上腺皮質(zhì)功能,提高機(jī)體免疫力[10]。文獻(xiàn)報(bào)道顯示其中主要藥材黃芪能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖,通過下調(diào)MMP-2、bFGF的表達(dá)抑制肝癌新生血管的形成[11]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)貞芪扶正顆?？擅黠@降低大鼠炎癥反應(yīng),緩解肝纖化程度[12]。以上研究均提示貞芪扶正顆粒對(duì)肝疾病具有一定的治療作用。本研究發(fā)現(xiàn)與Model組相比,貞芪扶正顆粒組肝組織細(xì)胞壞死程度、炎性浸潤(rùn)程度均減輕,肝功能指標(biāo)ALT、AST水平顯著降低,推測(cè)貞芪扶正顆粒能夠改善肝癌大鼠肝組織損傷及肝功能障礙。

惡性腫瘤的增殖具有顯著的血管生成依賴性,新生血管也是腫瘤迅速增殖的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。VEGF作為血管生成刺激因子可與內(nèi)皮細(xì)胞特定受體結(jié)合,進(jìn)而刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)腫瘤血管新生。過往研究發(fā)現(xiàn)VEGF為強(qiáng)烈的血管發(fā)生蛋白,能夠制劑刺激、趨化內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)肝癌等其它多種腫瘤血管形成[13]。文獻(xiàn)報(bào)道MVD為評(píng)定腫瘤血管形成的金標(biāo)準(zhǔn),與腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系,肝癌腫瘤血管生成在肝癌的發(fā)展中具有重要作用,通過測(cè)定肝癌MVD能夠反應(yīng)肝癌的血管生成狀況[14]。本研究發(fā)現(xiàn)與Control組相比,Model組肝組織中VEGF蛋白表達(dá)顯著升高,且VEGF、MVD陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高,經(jīng)貞芪扶正顆粒干預(yù)后VEGF、MVD陽(yáng)性表達(dá)率顯著降低,推測(cè)貞芪扶正顆粒對(duì)肝癌新生血管具有一定的抑制作用。

miR-200c為miR-200家族成員之一,定位在12號(hào)染色體,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān),通過調(diào)控靶基因如ZEb-1、ZEb-2等表達(dá)進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程[15-16]。既往研究發(fā)現(xiàn)miR-200c在多種腫瘤中均下調(diào)表達(dá),如miR-200c通過靶向kras抑制乳腺癌的增殖[17]。Zhou等[18]研究發(fā)現(xiàn)miR-200c通過靶向ZEb-1抑制非小細(xì)胞肺癌、增殖、侵襲、遷移。近期在肝癌患者中研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清中miR-200c表達(dá)明顯低于正常者,且與患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移有關(guān)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)與Control組相比,Model組肝組織中miR-200c表達(dá)明顯降低,經(jīng)貞芪扶正顆粒干預(yù)后miR-200c表達(dá)升高,推測(cè)miR-200c在肝癌發(fā)正中發(fā)揮抑癌作用。司青樂等[20]研究發(fā)現(xiàn)腎透明細(xì)胞癌中過表達(dá)miR-200c,可顯著降低ZEb-2表達(dá),推測(cè)兩者以負(fù)調(diào)控關(guān)系參與腎癌的發(fā)生。在胃癌細(xì)胞中上調(diào)miR-200c可降低ZEb-2表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞EMT過程[21]。本研究發(fā)現(xiàn)與Control組相比,Model組肝組織中ZEb-2表達(dá)明顯升高,經(jīng)貞芪扶正顆粒干預(yù)后ZEb-2表達(dá)降低,結(jié)合以上報(bào)道推測(cè)miR-200c、ZEb-2可能以負(fù)調(diào)控參與肝癌的發(fā)生,為進(jìn)一步證實(shí)肝癌中兩者的關(guān)系,本研究采用si-miR-200c干預(yù)肝癌模型,發(fā)現(xiàn)肝癌大鼠肝組織細(xì)胞壞死程度、炎性浸潤(rùn)程度增加,癌細(xì)胞分化程度降低,而肝組織中VEGF、MVD表達(dá)升高,ZEb-2蛋白表達(dá)升高,推測(cè)miR-200c可能通過負(fù)調(diào)控ZEb-2促進(jìn)肝癌新生血管形成,進(jìn)而加速肝癌細(xì)胞惡化。而貞芪扶正顆粒聯(lián)合si-miR-200c干預(yù)后,與si-miR-200c組相比,肝組織細(xì)胞損傷程度降低,VEGF、MVD、ZEb-2蛋白表達(dá)降低,推測(cè)貞芪扶正顆?？赡芡ㄟ^上調(diào)miR-200c表達(dá),負(fù)調(diào)控ZEb-2表達(dá),進(jìn)而抑制肝癌血管形成及肝癌的進(jìn)展。

綜上所述,貞芪扶正顆粒能夠改善肝癌模型大鼠肝組織損傷,保護(hù)肝功能、抑制腫瘤血管形成,其可能是通過調(diào)控miR-200c/ZEB通路實(shí)現(xiàn)的。然而本研究?jī)H從動(dòng)物模型探究貞芪扶正顆粒對(duì)肝癌血管新生的抑制作用,其具體機(jī)制尚不明確,還有待采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證。