章林明許珍珍常越辰司軍強馬克濤李 麗王勤章李應(yīng)龍

(1.石河子大學醫(yī)學院,新疆石河子 832000;2.石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院,新疆石河子 832000;3.成都市第五人民醫(yī)院,成都 610000)

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性Sprague Dawley(SD)大鼠40只,8～12周齡,體重220～280 g,來源于新疆醫(yī)科大學實驗動物中心[SCXK(新)2018-0001],動物房內(nèi)溫度為20℃～25℃,濕度為50%～55%,給予標準飼料,自由進食水,周圍環(huán)境安靜。動物手術(shù)在屏障動物實驗設(shè)施內(nèi)進行[SCXK(新)2018-0003]。動物實驗方案經(jīng)石河子大學醫(yī)學院動物管理與使用委員會(IACUC)批準(A2046-047-02)。所有大鼠進行去勢術(shù)后(正常雌性大鼠體內(nèi)的內(nèi)源性雌激素也可也以激活GPER,故將所有雌性大鼠去卵巢14 d后進行實驗,以排除內(nèi)源性雌激素對實驗的干擾),按照隨機數(shù)字表法分為去卵巢組(OVX組)、缺血再灌注損傷組(OVX+I/R組)、E2干預組(OVX+I/R+E2組)、GPER特異性激動劑G1干預組(OVX+I/R+G1組)、雌激素+GPER特異性阻斷劑 G15干預組(OVX+I/R+G15+E2組),每組8只。

1.2 主要試劑與儀器

17β-雌二醇(Sigma,美國);GPER受體特異性激動劑G1、GPER受體特異性阻斷劑G15(ApexBio,美國);鼠抗p-Akt抗體、兔抗Akt抗體(Proteintech,中國);兔抗 p-PI3K抗體、鼠抗 PI3K抗體(Cell Signaling Technology,美國);鼠抗 β-actin抗體、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);大鼠雌激素ELISA試劑盒(上海語純生物科技有限公司);SOD檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);蛋白電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 OVX模型及腎缺血再灌注模型的建立

大鼠給予戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉成功后,沿大鼠兩側(cè)肋中線備皮,在備皮區(qū)域的雙側(cè)背部取切口,切口位于肋骨下方約一橫指處,切開皮膚后,鈍性分離皮下筋膜,并延肌肉邊緣分離開肌肉,進入腹腔后,尋找脂肪組織并將其取出,其中粉紅色多囊泡組織即為大鼠卵巢。將卵巢切除,消毒之后對大鼠筋膜、肌肉以及切口進行縫合。將大鼠置于37.5℃的恒溫手術(shù)臺上,待大鼠麻醉復蘇后,將其放回已預先消毒完畢的鼠籠中進行飼養(yǎng)。兩周后所有大鼠術(shù)前12 h禁食,自由飲水,用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉成功后,切除右腎,用無創(chuàng)動脈夾夾閉左腎腎蒂造成缺血,持續(xù)45 min后,松開動脈夾再灌注24 h。E2干預組于術(shù)前1 h皮下注射E2(100μg/kg),G1干預組于術(shù)前1 h腹腔注射GPER受體激動劑G1(100μg/kg),G15+E2干預組于術(shù)前1.5 h腹腔注射G15(300μg/kg),30 min后皮下注射E2(100μg/kg)[17-18]。

1.3.2 血清雌激素水平檢測

將大鼠全血置于室溫下靜置30 min后,離心：3000 r/min,時間10 min,取上清液,使用ELISA試劑盒按說明書檢測各組大鼠E2水平。

1.3.3 腎功能損傷指標檢測

大鼠再灌注24 h后,戊巴比妥鈉腹腔麻醉,行腹主動脈采血,4000 r/min離心10 min,采用美國Roche Cobas Integra 800全自動血生化分析儀檢測血清肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)水平。

目前，我們在學校教育方面，也存在許多不完善的地方。一些學校為追求升學率，忽視了對青少年的青春期教育。一些學校對成績好的同學呵護有加，而對成績差的學生則放任自流。有的學校甚至對差生采取“停課”或“開除”等措施。不少學生流入社會后，成了“問題少年”。

1.3.4 腎組織病理檢查

大鼠再灌注24 h后,戊巴比妥鈉腹腔麻醉,左側(cè)腎行原位灌流去除血細胞,切取左腎一半置于-80℃保存?zhèn)溆?另一半置于10%中性福爾馬林液中固定,常規(guī)石蠟切片和HE染色,×400光鏡下觀察各組大鼠腎組織病理形態(tài)的改變,并進行Paller評分[20]。評分標準如下：腎小管明顯擴張計1分;腎小管上皮細胞扁平或腫脹計1分;刷狀緣損傷計1分;刷狀緣脫落計2分;管型計2分;腎小管管腔內(nèi)有脫落、壞死(未形成管型或細胞碎屑)計1分;腎小管正常計0分。每個視野下隨機選取10個腎小管進行評分,并根據(jù)評分結(jié)果,評價腎小管損傷程度。

1.3.5 腎組織氧化應(yīng)激指標檢測

從-80℃冰箱中取出預存的腎組織,制成10%組織勻漿,離心：4℃ 3000 r/min,10 min,采用 BCA法測蛋白濃度后,嚴格遵循SOD試劑盒及MDA試劑盒的說明書進行腎組織SOD活性及MDA含量的檢測。

1.3.6 Western blot法檢測 p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達

取凍存的腎組織,加入適量預冷的蛋白裂解液制成組織勻漿,離心后取上清,用BCA試劑盒檢測蛋白濃度,配平蛋白濃度,煮沸10 min使蛋白變性,各組取樣50μg蛋白加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。轉(zhuǎn)膜、封閉后,加入一抗4℃過夜;TBST中洗3次,每次5 min;加入二抗室溫孵育2 h。暗室曝光。用Image J分析軟件檢測條帶灰度值。以βactin為內(nèi)參照。

1.4 統(tǒng)計學方法

運用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,計量資料以平均數(shù)±標準差(±s)表示,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗,組間兩兩比較采用LSD法,若方差齊性則組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血清雌激素水平檢測結(jié)果

如表1和圖1所示,正常SD大鼠OVX術(shù)后2周,采用 ELISA法測定雌激素水平。結(jié)果表明,OVX組大鼠雌激素水平明顯低于正常大鼠。

2.2 腎功能損傷指標檢測結(jié)果

如表2和圖2所示,與OVX組相比,OVX+I/R組大鼠BUN和Cr水平明顯升高,提示OVX+I/R組大鼠腎功能受損,模型制備成功。與OVX+I/R組相比,E2干預組與G1干預組Cr和BUN水平明顯下降;與E2干預組相比,G15+E2干預組Cr和BUN水平明顯升高。

2.3 腎組織病理學改變

如圖3所示,HE染色后光鏡下腎組織病理學改變：OVX組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常,間質(zhì)無充血水腫,無炎性細胞浸潤(圖3A);OVX+I/R組腎小管則明顯擴張,細胞有不同程度的腫脹甚至壞死以及脫落,腎間質(zhì)水腫,炎性細胞浸潤明顯(圖3B);E2組和G1組大鼠腎小管輕度擴張,上皮細胞腫脹較輕微,壞死較少,炎性細胞浸潤程度明顯減輕(圖3C、3D);E2+G15組腎小管結(jié)構(gòu)不清,部分上皮細胞出現(xiàn)壞死以及脫落(圖3E)。Paller評分結(jié)果示表3和圖4所示。

2.4 腎組織氧化應(yīng)激指標檢測結(jié)果

如表4和圖5所示,與對照組相比,IR組大鼠腎組織SOD活性顯著降低(P＜0.01),MDA含量明顯升高(P＜0.01);與IR組相比,E2和G1干預組大鼠腎組織SOD活性顯著升高(P＜0.01),MDA含量明顯下降(P＜0.01);而G15+E2組腎組織SOD活性較E2組降低(P＜0.05),MDA含量較E2組明顯上升(P＜0.01)。

表1 正常大鼠與OVX術(shù)后2周大鼠血清雌激素水平(n=8)Table 1 Serum estrogen levels in normal rats and 2 weeks after OVX rats

圖1 正常大鼠與OVX術(shù)后2周大鼠血清雌激素水平Note.Compared with Normal group,**P＜0.01.Figure 1 Serum estrogen levels in normal rats and 2 weeks after OVX rats

表2 各組大鼠BUN和Cr的水平(n=8)Table 2 The levels of BUN and Cr in rats from each group

圖2 各組大鼠BUN(A)和Cr(B)的水平Note.A,OVX group.B,OVX+I/R group.C,OVX+I/R+E2 group.D,OVX+I/R+G1 group.E,OVX+I/R+G15+E2 group.Compared with OVX group,**P＜0.01.Compared with OVX+I/R group,##P＜0.01,#P＜0.05.Compared with OVX+I/R+E2 group,&&P＜0.01,&P＜0.05.The same as below.Figure 2 The levels of BUN(A)and Cr(B)in rats from each group

圖3 各組大鼠腎組織病理學改變(HE染色)Note.A,OVX group.B,OVX+I/R group.C,OVX+I/R+E2 group.D,OVX+I/R+G1 group.E,OVX+I/R+G15+E2 group.Figure 3 Histopathological examination of the renal tissue in rats from each group(HE staining)

表3 各組大鼠腎組織Paller評分(n=8)Table 3 Paller score of the renal tissue in rats from each group

圖4 各組大鼠腎組織Paller評分Figure 4 Paller score of the renal tissue in rats from each group

表4 各組大鼠腎組織SOD活性及MDA含量(n=8)Table 4 SOD activity and MDA content of the renal tissue in rats from each group

圖5 各組大鼠腎組織SOD活性及MDA含量Figure 5 SOD activity and MDA content of the renal tissue in rats from each group

2.5 Western blot法分析PI3K/Akt通路的激活情況

如圖6,Western blot結(jié)果顯示,與OVX組相比,I/R組腎組織中p-PI3K和p-Akt的表達明顯降低(P＜0.01);與I/R組相比,E2和G1干預組p-PI3K和p-Akt的表達明顯升高(P＜0.01);E2干預組與G1干預組差異無統(tǒng)計學意義;G15+E2干預組與E2干預組相比,p-PI3K和p-Akt表達明顯降低(P＜0.05)。

3 討論

腎缺血再灌注損傷這一病理生理進程在臨床中較為常見,由于腎血供豐富,其對缺血再灌注損傷也極為敏感,故I/R損傷可誘發(fā)急性腎功能衰竭(AKI)[21]。目前對I/R損傷的防治主要通過缺血缺氧預適應(yīng)及藥物預處理等。國內(nèi)外研究已證實雌激素對腦、心及腎等臟器缺血再灌注損傷具有一定保護作用,然而在臨床上,由于其為性激素,長期用藥會導致一系列嚴重副作用,故其應(yīng)用受到了極大限制[22]。若腎I/R損傷后激活GPER受體能發(fā)揮腎保護作用,則可使用GPER特異性激動劑G1防治腎I/R損傷,從而避免雌激素帶來的一系列問題。本研究結(jié)果顯示,大鼠腎缺血再灌注損傷后,血清肌酐和尿素氮明顯升高,E2干預組和G1干預組均有所下降,而E2+G15干預組血肌酐和尿素氮水平較E2干預組升高,表明E2和G1均可減輕腎缺血再灌注損傷,且特異性阻斷GPER后,E2的保護作用明顯減弱。形態(tài)學結(jié)果顯示,I/R組大鼠腎小管擴張明顯,刷狀緣脫落嚴重,腎小管上皮細胞有不同程度的腫脹、壞死和脫落,腎間質(zhì)水腫,E2干預組和G1干預組腎小管上皮細胞腫脹和壞死均較少,而E2+G15干預組部分逆轉(zhuǎn)了E2的保護作用,該結(jié)果進一步表明E2減輕腎缺血再灌注損傷可能通過GPER介導。

既往研究發(fā)現(xiàn),GPER可以介導17β-雌二醇的抗氧化應(yīng)激反應(yīng),從而改善冠狀血管反應(yīng)性[23]。Wang等人[24]發(fā)現(xiàn)雌激素的心臟保護作用是GPER介導的,且敲除小鼠GPER基因后,氧化應(yīng)激反應(yīng)加重,導致左心室增大,左心功能下降。氧化應(yīng)激反應(yīng)是腎I/R損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié),正常生理條件下,細胞可產(chǎn)生少量ROS,但機體的活性酶(超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT、谷胱甘肽GSH等)可以清除ROS,使ROS的產(chǎn)生與清除保持動態(tài)平衡,當機體發(fā)生缺血再灌注損傷時,產(chǎn)生的ROS明顯增多,超出機體清除ROS的能力,機體內(nèi)SOD及CAT等抗氧化酶活力下降,便發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),引起組織細胞損傷。由于SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶和氧自由基清除劑,而丙二醛(MDA)是氧化應(yīng)激反應(yīng)的最終產(chǎn)物,SOD活性和MDA含量被作為監(jiān)測氧化應(yīng)激反應(yīng)的兩個代表性指標[25]。本研究中,通過檢測腎組織SOD活性及MDA含量發(fā)現(xiàn),大鼠腎缺血再灌注損傷后,腎組織SOD活性明顯下降,而MDA含量明顯升高,提示I/R后腎組織氧化應(yīng)激反應(yīng)加重,機體自身的氧自由基清除機制不能完全清除過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物。E2干預組和G1干預組明顯逆轉(zhuǎn)了腎組織SOD活性及MDA含量,提示E2和G1可以通過加強機體氧自由基清除作用,減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)。而E2+G15干預組較E2干預組SOD活性和MDA含量有所下降,表明雌激素減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)可能主要通過激活GPER來實現(xiàn)。

圖6 各組大鼠腎組織p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值的比較Figure 6 The p-PI3K/PI3K ratio and p-Akt/Akt ratio of the renal tissue in rats from each group

有研究表明,PI3K/Akt信號通路激活可以調(diào)節(jié)機體氧化應(yīng)激反應(yīng),Zhu等人[26]研究發(fā)現(xiàn),CTS通過激活PI3K/Akt信號通路,減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)和細胞凋亡,保護腎缺血再灌注損傷。此外,G1與GPER結(jié)合后也可激活 PI3K/Akt信號通路[18]。GPER激活PI3K后,在細胞膜上生成PIP3,PIP3與細胞內(nèi)信號蛋白Akt結(jié)合,使Akt轉(zhuǎn)位至細胞膜并活化,活化的Akt通過磷酸化參與下游細胞信號轉(zhuǎn)導[14-27]。本研究Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,缺血再灌注組p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值明顯下降,且E2和G1干預明顯能夠上調(diào)由I/R引起的p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt下降,而G15干預后,E2上調(diào)作用明顯減弱,表明E2和G1可能通過PI3K/Akt信號通路發(fā)揮保護腎缺血再灌注作用,且E2保護作用可能主要通過激活GPER來實現(xiàn)。

綜上所述,E2和G1對腎缺血再灌注損傷有保護作用,其機制可能是通過激活GPER減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)而實現(xiàn),且E2和G1可以上調(diào)p-PI3K和p-Akt水平,由此我們推測G1與GPER結(jié)合后,可能通過激活PI3K/Akt信號通路介導氧化應(yīng)激反應(yīng),減輕腎缺血再灌注損傷,但其具體保護機制還需課題組進一步深入研究。本研究初步驗證了G1對腎缺血再灌注損傷的保護作用,為臨床上G1防治腎缺血再灌注損傷提供新的藥物作用靶點。