張 雨郭中坤付 彬雷 戰(zhàn)聶愛蕊莊峰鋒王可洲*

(1.濟(jì)南大學(xué)/山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,濟(jì)南 250200;2.山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院),濟(jì)南 250002)

殺菌/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,Bpi),最早在1978年由英國科學(xué)家Weiss等[1]在人中性粒細(xì)胞中分離純化而得到,存在于人、牛、豬等哺乳動(dòng)物嗜中性粒細(xì)胞中。成熟的Bpi是由456個(gè)氨基酸殘基組成的一種陽離子抗菌蛋白,由氨基端、羧基端和富含脯氨酸的21個(gè)氨基酸殘基形成的中間連接單位三部分組成,相對分子質(zhì)量為55×103。其經(jīng)胰蛋白酶水解,可裂解為30×103的氨基部分和20×103的羧基部分[2]。這兩個(gè)部分在殺菌過程中所承擔(dān)的角色也不相同[3]：氨基部分主要起殺菌作用,而羧基部分起調(diào)理素的作用,可促使吞噬細(xì)胞吞噬入侵的細(xì)菌。研究發(fā)現(xiàn),Bpi兼具有廣譜殺傷革蘭氏陰性菌和中和內(nèi)毒素的作用[4],其主要生物學(xué)功能為協(xié)助嗜中性粒細(xì)胞抑制細(xì)菌生長,發(fā)揮抗感染免疫保護(hù)作用[5]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近年來興起的一種新型基因編輯技術(shù)。它是一種原核生物免疫系統(tǒng),被用來抵抗噬菌體病毒和外源質(zhì)粒等外來遺傳物質(zhì)的入侵[6]。它能夠識(shí)別并切斷外源DNA[7],正是由于如此精確的靶向功能,使得外源基因的表達(dá)被沉默。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因編輯過程中主要依賴于sgRNA和靶序列DNA的互補(bǔ)配對[8]。因此,只需要根據(jù)目標(biāo)基因靶點(diǎn)識(shí)別的前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif,PAM)設(shè)計(jì)一段20～24 bp的引物序列sgRNA,識(shí)別并結(jié)合到基因序列上,Cas9核酸內(nèi)切酶就會(huì)在靶序列位置切割基因序列,從而會(huì)引起自身修復(fù)系統(tǒng)對DNA進(jìn)行修復(fù)[9],如同源重組修復(fù)機(jī)制(homology directed repair,HDR)或非同源末端連接修復(fù)機(jī)制(non-homologous end joining,NHRJ),最終使基因組DNA缺失、插入或發(fā)生移碼突變[10],從而對目的基因進(jìn)行有效的敲除、敲入或修飾等,完成基因編輯。通過編輯小鼠受精卵細(xì)胞的基因[11],并引入代孕母鼠體內(nèi),從而實(shí)現(xiàn)基因編輯小鼠模型的構(gòu)建。2013年初,已有實(shí)驗(yàn)組[12]將CRISPR/Cas9技術(shù)成功地運(yùn)用在小鼠和人細(xì)胞中并實(shí)現(xiàn)了精確的基因編碼,隨之而來的便是CRISPR/Cas9技術(shù)的迅速發(fā)展,其在基因編輯領(lǐng)域發(fā)揮著巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)剪切 Bpi蛋白的基因編碼區(qū),小鼠受精卵細(xì)胞通過NHEJ的DNA修復(fù),在蛋白編碼區(qū)產(chǎn)生片段刪除,使得Bpi蛋白失活,從而實(shí)現(xiàn)Bpi基因敲除的目的。成功構(gòu)建的Bpi基因敲除小鼠為后續(xù)研究其基因生物學(xué)功能及其機(jī)制提供了動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級C57BL/6雌鼠30只,體重14～15 g,4周齡;SPF級C57BL/6雄鼠15只,體重20～21 g,8～12周齡;SPF級ICR結(jié)扎雄鼠15只,體重26～28 g,8～12周齡;SPF級ICR雌鼠15只,體重30～32 g,8～12周齡,均購自北京唯尚立德生物科技有限公司[SCXK(京)2016-0009]。本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物先后在北京唯尚立德生物科技有限公司[SYXK(京)2016-0039]和山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(魯)2019-0007]IVC籠具內(nèi)飼養(yǎng)。經(jīng)山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心審批(20181224-01),并嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

金牌mix(green)(北京擎科生物科技有限公司,LOT：TSE101);引物序列合成(上海生工生物工程有股份限公司合成,LOT：240038139);動(dòng)物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒(北京君諾德生物技術(shù)有限公司,LOT：0180331AX);Cas9 mRNA、Cas9/gRNA靶點(diǎn)效率檢測試劑盒(北京唯尚立德生物科技有限公司,LOT：VK007);注射用人絨毛膜促性腺激素(hCG)(寧波第二激素廠,LOT：181223);注射用血促性素(PMSG)(寧波第二激素廠,LOT：1905152);OTOPO零背景PCR平末端克隆試劑盒(北京華恒健生物科技有限公司,LOT：HHK826);HiScribe T7 ARCA mRNA試劑盒(NEB公司,LOT：E2065S)。

體視顯微鏡(Nikon SMZ745T,日本);顯微注射用顯微鏡(Nikon ECLIPSE Ts2,日本);拉針儀(NARISHIGE PN-31,日本);PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf Mastercycler 50x,德國);高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf 5424R,德國);水平電泳儀(北京君意 JY600C,中國);凝膠成像系統(tǒng)(UVP EC3Chemi,美國)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 根據(jù)Bpi序列結(jié)構(gòu),分析CRISPR/gRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)位置

通過NCBI和Ensembl網(wǎng)站查詢當(dāng)前Bpi基因數(shù)據(jù)(NCBI：Gene ID：329547,Ensembl,Gene：BpiENSMUSG00000052922),對其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及其保守區(qū)域進(jìn)行分析,以設(shè)計(jì)CRISPR/gRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)位置。

1.3.2 sgRNA和Cas9 mRNA的體外轉(zhuǎn)錄與靶點(diǎn)活性檢測

使用北京唯尚立德Cas9/gRNA靶點(diǎn)效率檢測試劑盒將設(shè)計(jì)的gRNA靶點(diǎn)體外轉(zhuǎn)錄成sgRNA并檢測轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物活性,檢測原理及具體方法參見唯尚立德VK007試劑盒說明書。同時(shí)進(jìn)行Cas9 mRNA的體外轉(zhuǎn)錄用于后續(xù)的顯微注射,具體方法參見NEB-E2065S試劑盒說明書。

1.3.3 小鼠超數(shù)排卵、受精卵注射以及胚胎移植

向預(yù)先準(zhǔn)備好的4周齡左右的C57BL/6雌鼠腹腔注射血促性素和人絨毛膜促性腺激素,每只注射劑量約為5 U,兩次注射間隔48 h。在給藥18 h后,將注射激素后的C57BL/6雌鼠以及1只8～12周齡C57BL/6雄鼠處死,分別取出雌鼠的輸卵管膨大部以及雄鼠的附睪,在體視顯微鏡下分別收集卵子和精子。使精子在獲能液中獲能,取液體邊緣的精子滴加到短暫培養(yǎng)的卵細(xì)胞中,體外受精3～4 h。將體外轉(zhuǎn)錄成功的sgRNA與Cas9 mRNA分別用無RNA酶水稀釋到25 ng/μL和50 ng/μL,通過顯微注射的方式導(dǎo)入到小鼠受精卵細(xì)胞質(zhì)中,將存活的狀態(tài)良好的受精卵移植到與結(jié)扎雄鼠合籠后見栓的ICR雌鼠輸卵管膨大部,縫合,將代孕雌鼠飼養(yǎng)于IVC環(huán)境。

1.3.4 F0代小鼠的基因型鑒定和DNA測序

F0代鼠出生后約一周齡剪取小鼠腳趾并編號(hào),使用動(dòng)物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒提取小鼠DNA。根據(jù)被敲除的序列位置設(shè)計(jì)鑒定用PCR擴(kuò)增引物,基因敲除示意圖及引物信息分別如圖1、表1所示,PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)程序如表2所示。對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行T-A克隆(具體方法參見華恒建HHK826試劑盒說明書),并進(jìn)行DNA測序。

表1 引物名稱及其序列Table 1 Primer name and sequence

表2 PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)程序Table 2 PCR amplification system and reaction procedure

1.3.5 F0代小鼠的飼養(yǎng)與擴(kuò)繁

經(jīng)過對F0代小鼠的基因型鑒定及DNA測序,篩選出成功發(fā)生基因突變的陽性首建鼠與C57BL/6野生型小鼠進(jìn)行交配,待F1代小鼠出生后,再次利用上述鑒定方法對敲除情況進(jìn)行鑒定,篩選出敲除情況相同且性別不同的F1代小鼠進(jìn)行近交,F2代小鼠繼續(xù)進(jìn)行基因型鑒定,以建立穩(wěn)定遺傳Bpi基因型敲除小鼠品系。

2 結(jié)果

2.1 CRISPR/gRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)

查詢Bpi基因組數(shù)據(jù)得,該基因存在3個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,且對Bpi基因的蛋白功能保守區(qū)域進(jìn)行分析,如圖2、圖3所示。根據(jù)Bpi基因組結(jié)構(gòu)和蛋白功能保守區(qū),選取Bpi-201進(jìn)行設(shè)計(jì),其中外顯子2和外顯子3(44～125 aa)為公共外顯子,蛋白編碼區(qū)的堿基數(shù)為244 bp是非3的倍數(shù),在保守功能區(qū)Bpisuperfamily的N端。在刪除外顯子2～3后mRNA重新剪拼形成新的mRNA,其編碼的蛋白將會(huì)發(fā)生移碼突變,使蛋白失活。因此決定在外顯子2和外顯子3的兩端設(shè)計(jì)靶點(diǎn),如圖4所示。

根據(jù)Bpi基因組結(jié)構(gòu)和蛋白功能保守區(qū),設(shè)計(jì)了如下gRNA靶點(diǎn),如表3所示：

圖2 Bpi基因的3種轉(zhuǎn)錄途徑Note.The length of three transcription pathways(Bpi-201,202,203)is 486 aa,483 aa,482 aa,respectively,the difference region is located in exon 9-10(Ensembl,Gene,Bpi ENSMUSG00000052922).Figure 2 Three transcripts of Bpi gene

圖3 Bpi基因的保守區(qū)域Note： Exon 2～3(130～373 bp)is located in the N-terminal of the conservative BPI superfamily(106～777 bp).Figure 3 Conservative domain of Bpi gene

圖4 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物Bpi-201的基因組結(jié)構(gòu)Note.The green arrows indicate the cutting positions of gRNA targets.Figure 4 Genome structure of transcription product Bpi-201

2.2 高活性Cas9/gRNA敲除靶點(diǎn)篩選

使用Cas9/gRNA靶點(diǎn)效率檢測試劑盒檢測以上設(shè)計(jì)的gRNA靶點(diǎn)活性,Cas9/gRNA體外酶切結(jié)果及gRNA靶點(diǎn)活性數(shù)據(jù)分析如圖5所示。靶點(diǎn)活性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)詳見唯尚立德VK007試劑盒說明書。根據(jù)體外酶切結(jié)果分析得出：除Bpi-L5、Bpi-R1、Bpi-R2、Bpi-R3外,gRNA靶點(diǎn)的活性均在85%以上。我們選擇Bpi-L4、Bpi-R4一對gRNA靶點(diǎn)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄用于小鼠受精卵的注射。

2.3 F0代小鼠的鑒定及子代繁育

顯微注射后,收獲了64枚受精卵,將這些卵移植至2只見栓代孕ICR雌鼠的雙側(cè)輸卵管膨大部。待其生產(chǎn)后,共獲得F0代仔鼠22只,對其進(jìn)行基因型鑒定和DNA測序后,選取一只單鏈缺失708 bp堿基的陽性首建鼠3號(hào)雄鼠,其PCR鑒定結(jié)果及TA克隆測序峰圖如圖6所示。將3號(hào)雜合子陽性首建鼠與C57BL/6野生型小鼠進(jìn)行交配,所得8只F1代仔鼠基因型PCR鑒定結(jié)果如圖7所示,突變型小鼠電泳結(jié)果在550 bp位置出現(xiàn)清晰條帶,且測序結(jié)果分析得出同樣堿基缺失708 bp,證明該缺失可被穩(wěn)定遺傳(在F和R一對引物用于雜合子小鼠的鑒定過程中,由于PCR條件的原因出現(xiàn)1258 bp野生型條帶的情況是偶然性的,說明F和R這對引物不適合用于雜合子小鼠的野生型鑒定,故單獨(dú)設(shè)計(jì)WT-R用來做野生型鑒定)。F1代雜合子小鼠間進(jìn)行近交。出生的11只F2代小鼠中,有4只小鼠出現(xiàn)清晰突變型條帶,并且未出現(xiàn)野生型條帶,且PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果表明同樣堿基缺失708 bp,證明成功獲得F2代Bpi基因敲除純合子小鼠,基因型PCR鑒定結(jié)果如圖8所示,F1代和F2代小鼠基因型總數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表4所示。

3 討論

3.1 Bpi基因敲除小鼠遺傳穩(wěn)定品系的建立

本研究利用Cas9技術(shù)最終獲得22只F0代小鼠。通過基因型鑒定及DNA測序的方式進(jìn)行篩選,最終獲得5只基因片段刪除的F0代陽性首建鼠。為了確保產(chǎn)生的基因突變能夠穩(wěn)定遺傳,將F0代小鼠與同品系同背景的野生型小鼠進(jìn)行交配,選擇其中穩(wěn)定產(chǎn)生基因突變的后代進(jìn)行下一步的繁育。該實(shí)驗(yàn)為了獲得盡可能多的Bpi基因敲除小鼠用于下一步的實(shí)驗(yàn)研究,將性成熟的F1代陽性鼠之間進(jìn)行近交,獲得F2代小鼠,其中包括4只Bpi基因敲除純合子小鼠。將F2代陽性小鼠之間雄鼠與雌鼠1∶2合籠,經(jīng)過一段時(shí)間的飼養(yǎng)、繁殖與鑒定,目前已獲得了一定數(shù)量的Bpi基因敲除小鼠。這為深入研究Bpi基因的相關(guān)生物學(xué)功能及其機(jī)制提供了良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?對整體實(shí)驗(yàn)研究的開展具有重要的意義。

3.2 CRISPR/Cas9技術(shù)基因敲除小鼠的脫靶風(fēng)險(xiǎn)

在現(xiàn)代醫(yī)藥生物領(lǐng)域中,借助CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),構(gòu)建基因敲除小鼠模型的試驗(yàn)研究有很多,其作為一種新型的基因編輯工具,相較于傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)具有操作便捷、低成本、高效率等優(yōu)點(diǎn)。然而,此系統(tǒng)存在的潛在脫靶風(fēng)險(xiǎn)仍需要謹(jǐn)慎對待。多項(xiàng)研究認(rèn)為,sgRNA序列、PAM序列以及Cas9均為引起脫靶效應(yīng)的可能性因素[13],且有研究發(fā)現(xiàn),通過增強(qiáng)sgRNA的特異性、控制Cas9-sgRNA的用量、優(yōu)化Cas9核酸酶或選擇合適的Cas9遞送載體等方法可以不同程度地降低脫靶效應(yīng)。盡管如此,CRISPR/Cas9技術(shù)的脫靶問題仍然不能完全避免。因此,為保證成功構(gòu)建出Bpi基因敲除小鼠模型,對基因敲除小鼠進(jìn)行基因型PCR鑒定和DNA測序,這也是必不可少的一步。

表3 gRNA靶點(diǎn)名稱及序列Table 3 Name and sequence of gRNA target

圖5 Cas9/gRNA靶點(diǎn)活性檢測結(jié)果Note.A,Results of Cas9/gRNA enzyme digestion in vitro(NC is negative control).B,Analysis of activity data of gRNA target.Figure 5 Detection results of Cas9/gRNA target activity

圖6 Bpi敲除小鼠F0代仔鼠1-22號(hào)基因型鑒定結(jié)果及T-A克隆測序峰圖Note.A,Genotyping results showing the mutant strip indicated with red arrows(Primers,F and R,M,DL2000 Marker).B,Sequencing peak map of F0 offspring rat No.3 male(Base deletion,708 bp).Figure 6 Genotyping of 1-22 in F0 offspring of Bpi knockout mice and peak map of T-A cloning and sequencing

圖7 Bpi敲除小鼠F1代仔鼠1-8號(hào)基因型鑒定結(jié)果Note.Knockout identification shown by red arrow-indicated mutant strip(Primers,F and R)and WT identification(Primers,F and WT-R)on the left lanes 1-8 and right lanes 1-8,respectively.M,DL2000 Marker.Figure 7 Genotyping of 1-8 in F1 offspring of Bpi knockout mice

圖8 Bpi敲除小鼠F2代仔鼠1-11號(hào)基因型鑒定結(jié)果Note.Knockout identification shown by red arrow-indicated mutant strip(Primers,F and R)and WT identification(Primers,F and WT-R)on the left lanes 1-11 and right lanes 1-11,respectively.M,DL2000 Marker.Figure 8 Genotyping of 1-11 in F2 offspring of Bpi knockout mice

表4 子代鼠各基因型數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table 4 The number of genotypes in offspring

3.3 Bpi基因敲除小鼠的表型變化

本研究所構(gòu)建的Bpi基因敲除小鼠,純合子小鼠與野生型小鼠在毛色、胎仔數(shù)量、仔鼠8 W內(nèi)存活率等表型方面均無明顯差異,通過提取Bpi基因敲除小鼠睪丸組織RNA,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,未見Bpi基因外顯子轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。Bpi基因敲除小鼠在mRNA水平、蛋白質(zhì)水平表型鑒定及其免疫因子、激素水平方面的變化與數(shù)據(jù)分析,將在后續(xù)研究中進(jìn)行更加深入的探討。經(jīng)編輯后的Bpi基因在F1代基因組中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的生殖系專遞,并在F2代中獲得純合子小鼠。純合子小鼠在毛色、外形等外觀表型上沒有明顯變化。

3.4 構(gòu)建Bpi基因敲除小鼠的意義

Bpi作為一類殺菌性蛋白,其對革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、沙門氏菌、志賀痢疾桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌和奈瑟球菌等均有抑制和殺傷作用[14],關(guān)于Bpi的作用機(jī)制,目前研究解釋為帶正電荷的陽離子Bpi蛋白與革蘭氏陰性菌表面LPS(脂多糖)結(jié)合后,LPS在菌細(xì)胞膜上的正常排列被破壞,從而導(dǎo)致細(xì)胞滲透性顯著增強(qiáng)進(jìn)而引起細(xì)菌細(xì)胞的裂解[15],使細(xì)菌的生長受到抑制甚至最終導(dǎo)致細(xì)菌裂解死亡。有研究發(fā)現(xiàn),Bpi不僅承擔(dān)殺菌作用和中和內(nèi)毒素的作用,其對于促進(jìn)傷口愈合也具有積極的作用[16]。另外,在正常情況下,Bpi在小鼠的睪丸和附睪中被檢測到高水平表達(dá)[17],這也提示了Bpi亦有可能對精子的發(fā)生與成熟等生殖功能具有影響作用。Bpi的殺菌機(jī)制及其它可能存在的未知生物學(xué)功能亟待被探索和發(fā)現(xiàn)。目前,在科學(xué)領(lǐng)域?qū)pi的相關(guān)研究較少,本課題構(gòu)建小鼠Bpi基因敲除小鼠模型,為今后對Bpi功能更為深入的探索和發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。

3.5 Bpi——潛在的新型抗菌藥物

抗生素的濫用導(dǎo)致了大量耐藥菌株的出現(xiàn),尋找一類新型的特異性藥物來對抗某些耐藥菌已成為當(dāng)務(wù)之急。有研究發(fā)現(xiàn),Bpi作為生物機(jī)體內(nèi)一類能夠特異性殺傷革蘭氏陰性菌的抗菌性蛋白,將其主要發(fā)揮抗菌作用和結(jié)合內(nèi)毒素功能的氨基端與其它生物活性因子結(jié)合,重組成一種新型的融合蛋白,有助于研制一類新型的抗菌多肽類藥物。目前已有報(bào)道對Bpi蛋白進(jìn)行原核或真核重組表達(dá)[18-19],為開發(fā)出一種既能在促進(jìn)傷口愈合的同時(shí)又能避免細(xì)菌感染的雙功能新型多肽類藥物打下基礎(chǔ)。另外,Bpi除用于治療革蘭氏陰性菌感染性疾病外,還被開發(fā)出一系列Bpi衍生肽,如抗真菌藥,抗血管形成類藥等。Bpi作為一類潛在的新型藥物,必然會(huì)在不久的將來被廣泛地應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)等生物學(xué)領(lǐng)域,為許多疾病的治療帶來新的希望。