汪 敏，楊愛平，陳 燕，胡萍芳，嚴(yán) 杰

腸道病毒(enterovirus，EVs)為小RNA病毒科腸道病毒屬單正鏈RNA病毒，主要有脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus)、柯薩奇病毒(Coxsackievirus)、?？刹《?Echovirus)和新型腸道病毒EV68～EV71[1]。EVs通過腸道感染，但往往引起腸外疾病，如支氣管炎和肺炎、手足口病、心肌炎、心包炎和脊髓灰質(zhì)炎等，但以兒童呼吸道感染最為常見[1-2]。此外，EVs血清型眾多，不同血清型地域分布及其所致疾病有明顯差異[3-6]。眾所周知，包括我國在內(nèi)的不少國家和地區(qū)流行EV71和一些柯薩奇病毒血清型感染所致的手足口病，但近年來EVs引起的兒童呼吸道感染性疾病發(fā)病率不斷升高，引起國內(nèi)外廣泛關(guān)注[7-11]。所有EVs具有衣殼蛋白VP1，但不同EVs及其血清型VP1序列可有明顯差異，故VP1基因不僅用于EVs分類參考，也作為血清型分類依據(jù)[12]。本研究中，我們采用VP1基因通用引物的實時熒光定量RT-PCR檢測了2 164例呼吸道感染患兒標(biāo)本中EVs，陽性標(biāo)本采用EVs VP1/VP3基因通用引物的套式RT-PCR擴(kuò)增后測序分型，以了解本地區(qū)兒童呼吸道感染性疾病的優(yōu)勢EVs及其主要血清型和流行特征，為此類疾病臨床診治提供參考。

1 材料與方法

1.1一般臨床資料 采集2016年1月至2018年12月杭州地區(qū)多家門診或住院2 164 例發(fā)熱伴急性呼吸道感染癥狀患兒咽拭子標(biāo)本，其中男性患兒1 297例、女性867 例，患兒最大年齡13 歲、最小34 d，中間年齡3歲。

1.2主要儀器與試劑 RNA病毒核酸提取試劑盒(湘長械備20150021)和EVs核酸檢測試劑盒(國械注準(zhǔn)20173400073)購自湖南圣湘生物科技有限公司。實時熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)的ABI-7500型。電泳儀和凝膠圖像分析系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 方 法

1.3.1病毒RNA提取 按照病毒核酸提取試劑盒的說明書，采集咽拭子置于標(biāo)本保存液中，充分震蕩混合后取200 μL移入1.5 mL滅菌試管中，加入600 μL提取液-1震蕩混勻，瞬時離心后加入100 μL提取液-2震蕩混勻，室溫靜置30 min，瞬時離心后將試管置于分離器上，靜置3 min后吸棄分離液，加入600 μL提取液-3和200 μL提取溶液-4震蕩混勻，瞬時離心后將試管置于分離器上，靜置3 min后吸棄分離液，加入30 μL RNA洗脫液，混勻后室溫靜置5 min，將離心管置于分離器上靜置3 min，吸取洗脫液即為病毒RNA提取物，置—70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2實時熒光定量RT-PCR 按照EVs核酸檢測試劑盒說明書，每管加入實時熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)反應(yīng)液43 μL、酶混合液2 μL、病毒RNA模板5 μL，然后在實時熒光定量PCR儀上檢測。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min、50 ℃ 30 min逆轉(zhuǎn)錄；95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s, 共45個循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。

1.3.3EVs分型 參照文獻(xiàn)[13]合成EVs VP1/VP3區(qū)通用分型測序引物(表1)。qRT-PCR檢測EVs核酸陽性標(biāo)本進(jìn)行套式PCR(Nested-PCR)擴(kuò)增。采用通用引物224/222進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和第1 次PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 1 min、50 ℃ 30 min逆轉(zhuǎn)錄；95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s，共45 個循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。以5 μL第1 次PCR產(chǎn)物為模板，采用通用引物AN89/AN88進(jìn)行第2次PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s，共 30 個循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。用溴乙錠預(yù)染色1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增產(chǎn)物，委托泰和永昌(長沙)生物技術(shù)有限公司采用雙脫氧末端終止法測序。測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行Blast比對，獲得EVs種類及其分型結(jié)果。

表1 EVs套式PCR擴(kuò)增引物Tab.1 Primers for amplification of EVs by nested PCR

1.3.3EVs基因種系發(fā)生分析 參照文獻(xiàn)選擇GenBank中代表性參考序列[13]，上述EVs VP1/VP3區(qū)測序并EVs種類及其分型結(jié)果的每條序列采用ClustalW-2.1軟件默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行多序列比對，采用Mega 6.0軟件和Neighbar-Joining法構(gòu)建種系發(fā)生進(jìn)化樹并分析。

1.3.4不同年齡和性別兒童易感性分析 qRT-PCR檢測EVs核酸陽性以及套式PCR和測序后病毒分型的患兒進(jìn)行不同性別和年齡對EVs及其主要血清型易感性分析，其中不同患兒年齡分為<1、1～、2～、3～、4～和≥5 歲共6 組。

1.3.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件中χ2檢驗對不同EVs及其血清型檢測陽性率、不同年齡與性別患兒對EVs及其血清型感染率進(jìn)行比較與分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1EVs檢測陽性率與分型結(jié)果 2 164例發(fā)熱伴急性呼吸道感染癥狀患兒咽拭子標(biāo)本中，23.5%(508/2 164)的標(biāo)本EVs RNA檢測結(jié)果陽性。508 例EVs RNA陽性標(biāo)本中，57.1%(290/508)成功擴(kuò)增后分型(圖1和表2)，其余218 例(42.9%)因病毒RNA濃度太低未能擴(kuò)增分型。290例EVs分型的標(biāo)本中，柯薩奇病毒A組(CoxA)和B組(CoxB)分別有218 例(75.2%)和34例(11.7%)、EV71有26 例(8.9%)、?？刹《?Echo)有12 例(4.1%)，柯薩奇病毒(86.9%，252/290)是引起兒童呼吸道感染的優(yōu)勢EVs種類(χ2=330.70，P<0.05)，尤其是CoxA檢出率高于CoxB、EV71和?？刹《?χ2=243.22、260.80、305.75，P<0.05)。218 例CoxA陽性標(biāo)本中，CoxA6(39.5%，86/218)和CoxA10(33.0%，72/218)檢出率高于CoxA16(14.7%，32/218)、CoxA4(8.3%，18/218)和CoxA2(4.6%，10/218)(χ2=33.88、20.20，P<0.05)。

注：泳道M為DNA marker，泳道1和5為空白對照，泳道2～4為3例標(biāo)本的VP1-VP3基因大擴(kuò)增片段(～975 bp)，泳道6～8為3例標(biāo)本的VP1基因小擴(kuò)增片段(～350 bp)圖1 通用引物和套式PCR擴(kuò)增的EVs基因片段Fig.1 Fragments of enteroviral genes amplified by Nested-PCR using universal primers

表2 290例呼吸道感染患兒的EVs分型結(jié)果Tab.2 Typing of the enteroviruses from 290 children with respiratory infection

2.2檢出的EVs血清型進(jìn)化樹分析結(jié)果 與GenBank中相應(yīng)代表性參考序列比較[13]，CoxA2、CoxA4、CoxA6、CoxA10、CoxA16、CoxB1、CoxB5、Ech11和Echo30序列同源性較高，為90.1%～99.8%；EV71序列有一定差異，同源性為85.7%～99.7%；提示所采用的VP1/VP3基因測序分型法能有效鑒定EVs陽性標(biāo)本中的病毒型別(圖2)。

注：*表示來自GenBank的參考序列圖2 檢出的EVs系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phyletic evolution tree of detected enteroviruses

2.3不同EVs所致疾病種類 柯薩奇病毒和?？刹《就ǔＲ鸶鞣N腸外感染，EV71主要引起手足口病、皰疹性咽峽炎以及少數(shù)兒童腦炎、腦膜炎，但也可引起呼吸道感染，脊髓灰質(zhì)炎病毒主要引起脊髓灰質(zhì)炎[1,14-17]。290例經(jīng)EVs分型的發(fā)熱伴急性呼吸道癥狀患兒中，205例診斷為鼻咽喉、扁桃體和口腔等上呼吸道感染，27例為下呼吸道感染性疾病，58例為伴有呼吸道癥狀的手足口病、腦炎和膜腦炎、高熱驚厥，詳見表3。232例確診的呼吸道感染疾病患兒中，可檢出柯薩奇病毒、埃可病毒和EV71，但CoxA占77.2%(179/232)(χ2=68.4，P<0.05)，其中CoxA6(30.6%，71/232)和CoxA10(25.9%，60/232)為優(yōu)勢柯薩奇病毒血清型(χ2=54.1、34.9，P<0.05)。

2.4不同性別兒童對EVs及其血清型易感性 508例qRT-PCR檢出EVs感染的發(fā)熱伴急性呼吸道感染癥狀患兒中，63.0%(320/508)為男童，37.0%(188/508)為女童，男童較女童易感(χ2=68.60，P<0.05)。在感染主要的EVs(CoxA6、CoxA10、CoxA16和EV71)患兒中，男童較女童易感CoxA6(χ2=11.25，P<0.05)、女性較男性兒童易感CoxA10(χ2=4.00，P<0.05)，但不同性別兒童對CoxA16和EV71感染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.00、2.77，P均>0.05)(表4)。

表3 不同EVs感染所致疾病種類Tab.3 Disease types caused by infection with different enteroviruses

表4 不同性別患兒對不同EVs及其血清型易感性Tab.4 Susceptibility of different sex children to enteroviruses and their serotypes

2.5不同年齡兒童對EVs及其血清型易感性 508例qRT-PCR檢出EVs感染的發(fā)熱伴急性呼吸道感染癥狀患兒中，1 歲兒童最易感(χ2=13.15，P<0.05)，其次是2 歲兒童(χ2=9.20，P<0.05)和3 歲兒童(χ2=4.96，P<0.05)，<1歲、4歲和≥5歲兒童感染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表5)。在感染主要EVs(CoxA6、CoxA10、CoxA16和EV71)的患兒中，1 歲和2 歲兒童對CoxA6和CoxA10易感(χ2=5.79、7.15、9.25，P<0.05)，但不同年齡兒童對CoxA16和EV71的感染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.74、2.36，P均>0.05)(表5)。

表5 不同年齡患兒對EVs及其血清型易感性Fig.5 Susceptibility of different age children to enteroviruses and their serotypes

3 討 論

近年來，EVs引起的呼吸道感染性疾病發(fā)病率逐年升高，尤其是兒童夏季呼吸道感染，EVs是主要病原體之一[2,9-10]。此外，不同國家或地區(qū)引起呼吸道感染的優(yōu)勢EVs種類及其血清型差異較大。例如，2008年中國臺北地區(qū)CoxA2引起的兒童急性呼吸道感染暴發(fā)流行[18]；2012年泰國發(fā)生CoxA8引起的兒童急性呼吸道感染大規(guī)模暴發(fā)流行[4]；2014年巴西暴發(fā)了CoxA9為主的兒童急性呼吸道感染[19]；2010年芬蘭和2014—2015年美國暴發(fā)了EV68引起的嚴(yán)重兒童呼吸道感染[20-21]。然而，近年來僅北京、上海、深圳和本省湖州地區(qū)開展了兒童呼吸道感染性疾病中優(yōu)勢EVs及其血清型的流行病學(xué)研究[11,22-25]，但國內(nèi)其他地區(qū)無相關(guān)研究報道。

引起呼吸道感染的病原微生物種類繁多，一些細(xì)菌(包括支原體和衣原體)、病毒和真菌均可成為人呼吸道感染的病原體。引起兒童呼吸道感染的病毒除EVs外，還有流感和副流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、冠狀病毒和腺病毒等[1]。本次2 164例發(fā)熱伴急性呼吸道感染癥狀患兒咽拭子標(biāo)本中，有23.5%(508/2 164)的標(biāo)本EVs RNA檢測結(jié)果陽性，提示EVs可能是當(dāng)前兒童呼吸道感染的重要病原體，值得引起重視。

EVs種類及其血清型眾多，除脊髓灰質(zhì)炎病毒有3 個血清型外，柯薩奇病毒分A組和B組(CoxA和CoxB)，CoxA有23 個血清型、CoxB有6 個血清型，?？刹《居?1 個血清型，其中柯薩奇病毒和?？刹《舅录膊∽V廣泛，可引起心肌、神經(jīng)、呼吸、消化系統(tǒng)和全身感染，EV68～71中目前僅肯定EV68和EV71可引起呼吸道感染[1,14-16]。盡管在136 例明確診斷為呼吸道感染的患兒咽拭子標(biāo)本中檢出了柯薩奇病毒、?？刹《竞虴V71，但CoxA占77.9%(106/136)(P<0.05)，在檢出的5 個CoxA血清型中，CoxA6(23.5%)和CoxA10(22.1%)為優(yōu)勢血清型(P<0.05)。國內(nèi)文獻(xiàn)報道，深圳地區(qū)引起兒童呼吸道感染的優(yōu)勢EVs主要是CoxA6、其次是CoxA16；鄰近的上海市主要是CoxA2、CoxA5和CoxB5；上海市松江地區(qū)主要是CoxB3、其次是CoxA4；本省湖州地區(qū)主要是CoxA6、其次是CoxA2[11,22-25]。上述資料表明，引起兒童呼吸道感染的主要EVs為CoxA，但不同地區(qū)優(yōu)勢CoxA血清型存在很大差異。

了解病原微生物流行特征及其易感人群，對于相關(guān)疾病的有效防控具有重要意義。我們的實驗結(jié)果顯示，508 例EVs檢測陽性發(fā)熱伴呼吸道癥狀患兒中，男童較女童易感(P<0.05)，主要感染的病原體CoxA6、CoxA10、CoxA16和EV71中，男童易感CoxA6、女童易感CoxA10(P<0.05)，1 歲兒童最易感、其次是2和3歲兒童(P<0.05)，<1 歲兒童易感性較低可能與來自母體過繼免疫力、≥4 歲兒童自身免疫系統(tǒng)開始發(fā)育成熟有關(guān)[26]。然而，我們的檢測與分析結(jié)果顯示，不同性別和年齡兒童對CoxA16和EV71感染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。國內(nèi)文獻(xiàn)報道，深圳地區(qū)EVs呼吸道感染兒童易感年齡為2 歲以下；上海市松江地區(qū)和本省湖州地區(qū)易感年齡分別為6 個月～6 歲和3歲以下；北京地區(qū)和上海市資料中未分析易感年齡[11,24-25]。綜上所述，由于不同國家或同一國家不同地區(qū)引起呼吸道感染的優(yōu)勢EVs種類及其血清型差異較大，了解本地區(qū)引起呼吸道感染的優(yōu)勢EVs種類及其血清型，對防控和臨床診治此類疾病具有重要意義。

利益沖突：無