楊振偉 蔣靜涵 謝東輝

皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診科，安徽蕪湖 241000

心房顫動（atrial fibrillation，AF）又稱房顫，是 臨床常見的心律失常之一，現(xiàn)在已經(jīng)成為心血管疾病中的一大流行性疾病，嚴重影響患者的預(yù)后及生活質(zhì)量[1-2]。隨著對AF機制研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)心房結(jié)構(gòu)重塑在房顫病理性進程中發(fā)揮著重要作用，而心房纖維化則是心房結(jié)構(gòu)重塑的基礎(chǔ)[3-4]。纖維化進展的關(guān)鍵在于細胞外基質(zhì)在組織間隙的沉積，細胞外基質(zhì)主要包括膠原蛋白（Ⅰ型及Ⅲ型）、細胞纖連蛋白和基底膜蛋白如層黏連蛋白等。研究表明成纖維細胞在纖維化進展中起著重要作用，通過增殖、遷移及調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)（ECM）的代謝，參與調(diào)節(jié)纖維化。并可轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，更有效地合成細胞外基質(zhì)，肌成纖維細胞可表達α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）促進心臟纖維化[5]。大量研究表明，RAS系統(tǒng)的激活在心房纖維化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，當(dāng)RAS系統(tǒng)被激活后主要活性效應(yīng)分子是AngⅡ[6-7]，AngⅡ通過與細胞G蛋白偶聯(lián)的AngⅡ的Ⅰ型受體（AT1R）相結(jié)合，激活主要激活絲裂原活化蛋白激酶家族（MAPKs）信號通路促進纖維化進程[8]。相關(guān)C3肉毒梭菌毒素1（Rac1），是小三磷酸鳥苷酶結(jié)合蛋白，屬于Ras超家族中Rho亞家族的成員。既往研究發(fā)現(xiàn)Rac1在心房纖維化過程中發(fā)揮重要作用[9]。Liu等[10]發(fā)現(xiàn)，AngⅡ可以激活Rac1，且活化型Rac1的表達水平的升高可促進心房纖維化。Rac1-V12是Rac1的人工突變體，具有持久性生物活性，可模擬病理狀態(tài)下活化型Rac1[11]，纖維細胞生長因子（Fibroblast growth factor，F(xiàn)gf）是一組多肽形成纖維細胞的有絲分裂原，具有促進血管、骨形成和損傷修復(fù)的功能[12]。最近發(fā)現(xiàn)Fgf家族在調(diào)節(jié)心臟功能中的作用，其中Fgf21、Fgf23與房顫發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)，具有促進心房纖維化的作用[13-14]，F(xiàn)gf13是嚙齒動物心臟中最主要的纖維細胞生長因子，也是人類心臟中常見的轉(zhuǎn)錄本，參與調(diào)節(jié)心臟的電壓門控Na+離子通道[15-16]，近期發(fā)現(xiàn)Fgf13在心臟肥厚的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[17]。而其在心房纖維化方面尚無相關(guān)研究。本研究將初步探索Fgf13在AngⅡ激活小G蛋白Rac1促進心臟成纖維細胞增殖、遷移過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、0.25%EDTA-胰蛋白酶（美國Gibco公司），Ⅱ型膠原酶購于美國Worthington Biochemical公司；Ad-Vector、Ad-Rac1、Ad-Rac1-V12等腺病毒表達載體購自中國山東維真生物科技有限公司；血管緊張素Ⅱ（美國 Sigma-Aldrich 公司）；GAPDH兔多克隆抗體、Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）兔多克隆抗體、α-SMA鼠多克隆抗體、Rac1兔多克隆抗體、Fgf13兔多克隆抗體購自ABclonal公司；山羊抗兔二抗、SDS-PAGE凝膠試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自中國碧云天公司；PVDF膜和ECL發(fā)光液中國碧云天公司細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司。其他生化試劑均為進口分裝或國內(nèi)分析純化。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心臟成纖維細胞（atrial fibroblasts，AFs）原代細胞的分離和培養(yǎng) 取2～3日齡SD乳鼠6～10只（上海吉輝公司；SPF級），取出乳鼠心臟置于培養(yǎng)皿中用眼科剪將心臟剪成約1mm×1mm×1mm的組織塊，再加9.6mL PBS緩沖液和400μL 0.25%胰酶（美國Gibco公司），輕輕搖晃均勻，將培養(yǎng)皿置于4℃冰箱（中國海爾）過夜。次日轉(zhuǎn)入離心管中，離心去上清，補充高糖完全培養(yǎng)基至14mL，加入1mL的0.1%Ⅱ型膠原酶，37℃水浴消化25～28min。消化后再次離心棄上清，再次用高糖完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，取適量放入培養(yǎng)皿中，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。差速貼壁培養(yǎng)60min后，用吸管吸去富含未及時貼壁的心肌細胞的培養(yǎng)基，留下了貼壁的AFs，加入和培養(yǎng)皿相適應(yīng)的高糖完全培養(yǎng)基繼續(xù)生長，每隔24h更換一次培養(yǎng)基。

1.2.2 小干擾RNA的合成及轉(zhuǎn)染 小干擾RNA由北京擎科生物科技有限公司設(shè)計并合成。序列如 下：Si-Fgf13：CGUGUGUUUAAAUAAGAAAUG UUUCUUAUUUAAACACACGAG。小干擾轉(zhuǎn)染AFs：將原代成纖維細胞鋪入6孔板，當(dāng)細胞融合度達到30%時，參照Lipofecta-mineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，使用LipofectamineTM 2000將siRNA和陰性對照轉(zhuǎn)入細胞。將被轉(zhuǎn)入細胞分為Si-Fgf13組及陰性對照組，并在轉(zhuǎn)染6h后更換培養(yǎng)基。

1.2.3 CCK-8和細胞劃痕實驗檢測AFs增殖和遷移能力 將AFs鋪入做好標(biāo)記的六孔板中，分為三組：Ad-Vector組、Ad-Rac1-V12組、Ad-Rac1-V12-Si-Fgf13組，長滿后，用10μL移液槍槍頭垂直標(biāo)記線做劃痕，PBS洗三遍，更換無血清或低濃度血清（≤2%）培養(yǎng)基，定時于顯微鏡下拍照。在96孔板中接種密度合適的AFs，穩(wěn)定生長24h后，按上述分組轉(zhuǎn)染細胞。24h后每孔加入培養(yǎng)液總體積10%的CCK8（中國碧云天公司），混勻培養(yǎng)4h后檢測450nm處的吸光度（OD）值。

1.2.4 Western Blot免疫印跡檢測蛋白水平 將處理好的AFs用PBS洗滌3次，加入強RIPA裂解液（中國碧云天公司），置冰上30min，然后轉(zhuǎn)移至新的EP管中離心10min。取上清液，用BCA蛋白檢測試劑盒（中國碧云天公司）檢測總蛋白，按比例加入5x上樣緩沖液95℃煮沸10min。取20μg蛋白進行SDS-PAGE，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%的脫脂奶粉室溫封閉1h，加入相應(yīng)的一抗[anti-Collagen Ⅰ、anti-α-SMA、anti-Fgf13、anti-Rac1、anti-GAPDH均為（1∶1000）]4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜后加入HRP二抗（1∶1000），室溫搖床孵育1h，以GAPDH為內(nèi)參照，掃描灰度值并分析蛋白表達相對含量用化學(xué)發(fā)光成像分析儀對條帶進行分析。

1.2.5 GST pull-down實驗 將AFs分為兩組：Control組及AngⅡ組，細胞鋪盤穩(wěn)定生長后，AngⅡ組予以AngⅡ處理48h后提取蛋白。將兩組蛋白分別加入預(yù)處理的GSTbeads（美國Sigma-Aldrich公司）共孵育，通過結(jié)合GSTbeads，下拉目的蛋白，獲取純化的目的蛋白[18]。將獲取的純化蛋白按比例加入5x上樣緩沖液95℃煮沸10min。取20μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分析，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%的脫脂奶粉室溫封閉1h，加入相應(yīng)的一抗（anti-Rac1）4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜后加入HRP二抗（1∶1000），室溫搖床孵育1h，以Input為參照，掃描灰度值并分析蛋白表達相對含量用化學(xué)發(fā)光成像分析儀對條帶進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。多組間比較采用單因素方差分析（one-away ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AngⅡ激活的Rac1促進心臟成纖維細胞中Fgf13的表達

在AngⅡ刺激下活化型Rac1表達上調(diào)（圖1A）。為探究激活的Rac1與Fgf13表達量之間的關(guān)系，對AFs分別轉(zhuǎn)染Ad-Vector、Ad-Rac1、Ad-Rac1-V12腺病毒，并予以驗證病毒轉(zhuǎn)染效果（圖1B）。Western Blot結(jié)果顯示Ad-Vector組與Ad-Rac1組無統(tǒng)計學(xué)差異，而與Ad-Vector組比較Ad-Rac1-V12組Fgf13蛋白表達顯著上升，且纖維化相關(guān)蛋白CollagenⅠ、α-SMA表達水平升高（圖1C、D）。該結(jié)果提示持續(xù)活化的Rac1促進AFs中Fgf13的表達。

2.2 阻斷Rac1減輕AngⅡ?qū)gf13的誘導(dǎo)作用

圖1 AngⅡ激活Rac1導(dǎo)致心臟成纖維細胞Fgf13的表達上調(diào)A：Pull-down實驗驗證在AngⅡ刺激下活化型小G蛋白Rac1表達變化；B：AFs轉(zhuǎn)染空載腺病毒、Rac1腺病毒、Rac1-V12腺病毒48h后，Western Blot法檢測外源性Rac1的表達量；C、D：AFs轉(zhuǎn)染腺病毒48h后，Western Blot法檢測Ad-Vector、Ad-Rac1、Ad-Rac1-V12三組、CollagenⅠ、α-SMA、Fgf13的表達量差異。Ad-Rac1-V12組與Ad-Vector組比較，＊P ＜ 0.05，＊＊P ＜ 0.01。Mean±SEM，n=3

為進一步探究Ang-Ⅱ激活的Rac1與Fgf13之間的關(guān)系，使用Ang-Ⅱ刺激AFs，并加入Rac1特異性抑制劑NSC23766[18]（美國Sigma-Aldrich公司），檢測Fgf13表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對照組比較，Ang-Ⅱ刺激組Fgf13表達量上調(diào)，而予以Ang-Ⅱ刺激同時加入Rac1特異性抑制劑NSC23766組，F(xiàn)gf13表達量降低（圖2A、B）。提示Rac1可能調(diào)控Fgf13的表達。

圖2 阻斷Rac1減輕AngⅡ?qū)gf13的誘導(dǎo)作用A、B：Ang-Ⅱ刺激下與NSC23766抑制Rac1，分別對Fgf13表達量的影響。與Saline相比較，＊＊＊P＜0.001；與Ang-Ⅱ組相比較，#P＜0.05。Mean±SEM，n=3

2.3 下調(diào)Fgf13減輕活化型Rac1介導(dǎo)的AFs中纖維化相關(guān)蛋白的表達

為探究Fgf13在活化型Rac1介導(dǎo)AFs纖維化相關(guān)蛋白表達中的作用，采用小干擾技術(shù)抑制Fgf13的表達。小干擾序列如1.2.2中所述。Western Blot免疫印跡結(jié)果表明；加入小干擾RNA后Fgf13表達量降低，纖維化相關(guān)蛋白CollagenⅠ、α-SMA表達量降低（圖3A、B），提示下調(diào)Fgf13減輕纖維化相關(guān)蛋白表達。圖3C、D結(jié)果顯示與Ad-Vector組 比 較，Ad-Rac1-V12組 的 CollagenⅠ、α-SMA表達顯著增高。而與Ad-Rac1-V12組比較，Rac1-V12+si-Fgf13組的CollagenⅠ、α-SMA表達降低，表明下調(diào)Fgf13可減輕活化的Rac1導(dǎo)致的纖維化相關(guān)蛋白的表達。

圖3 下調(diào)Fgf13減輕活化型Rac1介導(dǎo)的纖維化相關(guān)蛋白的表達A、B：小干擾序列下調(diào)AFs中Fgf13的表達。Western Blot檢測兩組相關(guān)纖維化相關(guān)蛋白的表達，＊P ＜0.05、＊＊P ＜0.01；C、D：AFs分為三組：Ad-Vector組、Ad-Rac1-V12組及Ad-Rac1-V12+Si-Fgf13組，F(xiàn)gf13的表達量變化，與 Ad-Vector組比較，＊P＜0.05、＊＊P＜0.01；與Ad-Rac1-V12+Si-Fgf13組比較，#P＜0.05，Mean±SEM，n=3

2.4 下調(diào)Fgf13減輕活化型Rac1對AFs的促增殖、遷移作用

為探究Fgf13在活化型Rac1對AFs的促增殖、遷移作用，我們進行了CCK-8和細胞劃痕實驗檢測AFs增殖和遷移能力，將AFs分為三組：Ad-Vector組、Ad-Rac1-V12組及Ad-Rac1-V12+Si-Fgf13組，結(jié)果顯示：與Ad-Vector組比較，Ad-Rac1-V12組AFs的增殖、遷移作用顯著增強，而下調(diào)Fgf13后作用明顯減輕（圖4A、B）。表明下調(diào)Fgf13可以減輕活化型Rac1對AFs的促增殖、遷移作用。

3 討論

Rac1是小三磷酸鳥苷酶結(jié)合蛋白，屬于Ras超家族中Rho亞家族的成員，它參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種生理過程，從而影響細胞運動與增殖能力[19-20]，正常情況下Rac1的活性很低，而AngⅡ作為RAS系統(tǒng)的主要效應(yīng)分子，可以激活Rac1，促進活化型Rac1的表達[21]，并通過激活NADPH氧化酶的途徑進而促進心房纖維化[6]。Rac1-V12是一種具有持久活性的Rac1人工突變體，在小鼠體內(nèi)超表達會導(dǎo)致心肌肥厚[22]。其在心房纖維化方面的作用尚未闡明。

圖4 下調(diào)Fgf13減輕活化型Rac1對AFs的促增殖、遷移作用A：CCK-8實驗檢測Ad-Vector組、Ad-Rac1-V12組及Ad-Rac1-V12+Si-Fgf13三組AFs的增殖能力，＊＊P＜0.01；B：細胞劃痕實驗檢測三組遷移能力的差異，與Ad-Vector組比較，＊＊P＜0.01；與 Ad-Rac1-V12+Si-Fgf13組比較，##P＜0.01，Mean±SEM，n=3

Fgf13是成纖維細胞生長因子（Fgf）家族成員，參與電壓門控Na+通道的調(diào)節(jié)[12]，研究表明，敲除Fgf13可以減輕壓力負荷介導(dǎo)的心臟肥厚[17]。目前Fgf13在纖維化方面還未研究，為探究Fgf13在心肌纖維化過程的作用，以及與Rac1的關(guān)系，我們進行了體外實驗，將Ad-Rac1和Ad-Rac1-V12轉(zhuǎn)染原代AFs。相較與Ad-Rac1組，Ad-Rac1-V12組纖維化相關(guān)蛋白CollagenⅠ、α-SMA表達水平升高，且Fgf13表達顯著上調(diào)，提示Fgf13可能與活化的Rac1促進纖維化機制相關(guān)。為進一步研究二者的關(guān)系，通過AngⅡ刺激AFs促進Rac1活化，發(fā)現(xiàn)Fgf13表達量升高。AngⅡ刺激的同時使用NSC23766抑制Rac1活性，F(xiàn)gf13表達下調(diào)，表明Fgf13可能受Rac1的調(diào)控。為進一步探究Fgf13的作用機制，通過體外實驗轉(zhuǎn)染小干擾RNA下調(diào)Fgf13，發(fā)現(xiàn)與NC組比較，Si-Fgf13組纖維化相關(guān)蛋白表達下降，提示下調(diào)Fgf13可以減輕心肌纖維化。為了研究Fgf13在活化型Rac1促纖維化機制中的作用，我們在體外實驗轉(zhuǎn)染Rac1-V12病毒的同時加入小干擾RNA下調(diào)Fgf13，結(jié)果顯示與超表達Rac1-V12組比較，Rac1-V12+Si-Fgf13組CollagenⅠ、α-SMA表達降低。鑒于心臟成纖維細胞的增殖和遷移也是心肌纖維化的重要特征[23]，我們進行了CCK-8和細胞劃痕實驗檢測AFs的增殖、遷移能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與超表達Rac1-V12組比較，Rac1-V12+Si-Fgf13組增殖、遷移能力明顯下降，表明下調(diào)Fgf13可減輕活化型Rac1引起的心肌纖維化。

綜上所述，本研究闡述了AngⅡ促進心臟成纖維細胞增殖遷移的新機制：通過激活小G蛋白Rac1介導(dǎo)的Fgf13上調(diào)進而促進心臟成纖維細胞纖維化相關(guān)蛋白的表達。而對Fgf13下游調(diào)控機制還尚不明確，在后續(xù)研究中，我們將在整體動物水平及分子水平進一步明確Fgf13對心肌纖維化的調(diào)控機制，可能對心房纖維化的研究提供新思路。