覃玉花 唐開獎 佘柳君 宋星慧 以 敏 蔣 茵

1.柳州市工人醫(yī)院風濕免疫科，廣西柳州 545005；2.柳州市工人醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，廣西柳州 545005；3.柳州市工人醫(yī)院病理科，廣西柳州 545005

硬皮?。╯cleroderma，SD）是一類以小血管病變、免疫異常及皮膚增厚和纖維化為主要特點的自身免疫性疾病，病因及發(fā)病機制十分復雜，目前尚未完全清楚，治療較困難[1]。吡非尼酮（pirfenidone，PFD）具有抗炎、抗氧化作用和抑制膠原的合成，甚至能夠逆轉纖維化和瘢痕的形成，這在大量的動物和體外實驗中被證實[2-3]。PFD能夠減少肺、腎等器官成纖維細胞結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）的表達，并與膠原的合成和基質的減少呈相關性[4-5]。PFD作用于皮膚纖維化的機制如何，國內的報道較少。基于此，本研究通過檢測給予PFD干預SD小鼠模型后皮膚CTGF和ColV含量的變化，為臨床PFD防治皮膚纖維化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

從湖南斯萊克景達實驗動物有限公司購買SPF級6～8周齡雌性BALB/c小鼠，共24只，體重（25±2）g，許可證號：SCXK（湘）2016-0002。在通風采光正常的環(huán)境中飼養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 博來霉素（Bleomycin，BLM）A（H20055883）和吡非尼酮膠囊（H20133376）分別購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司和北京康蒂尼藥業(yè)有限公司。磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer solution，PBS）購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，蘇木素染液、1%伊紅染液、Msson復合染色液均購自珠海貝索生物技術有限公司。羥脯氨酸試劑盒購自南京建成生物工程研究所；多克隆抗體兔抗鼠CTGF抗體為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；多克隆抗體兔抗鼠ColV抗體為北京博奧森生物技術有限公司產(chǎn)品；SP試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.2.2 主要儀器 酶標儀為賽默飛世爾科技（中國）有限公司提供，病理圖像分析系統(tǒng)為上海普赫科技有限公司的產(chǎn)品，細胞免疫組織化學定量分析系統(tǒng)由上海申騰信息技術有限公司提供。

1.2.3 實驗分組 實驗前剃去小鼠背部中央?yún)^(qū)被毛，雌性BALB/c小鼠隨機分為四組，分別為對照組（6只）、BLM組（6只）、PFD干預組（6只）和BLM+PFD干預組（6只）。BLM組按照文獻中的方法[6-7]，建立硬皮病鼠模型，予采用皮下注射BLM的方法（1次/d，連續(xù)4周），對照組小鼠注射PBS做參照（1次/d，連續(xù)4周），PFD干預組將從第11天開始予 PFD[300mg/（kg·d）]灌胃給藥（1次 /12h），直至實驗結束；BLM+PFD干預組首先進行等量的BLM皮下注射，第11天開始予同等量的PFD干預治療，直至實驗結束。

1.3 指標檢測

小鼠造模成功后，于第4周處死小鼠，獲取小鼠背部無毛皮膚，分成2份，一份用于檢測HYP含量；另一份予固定、脫水、石蠟包埋，制取4μm切片，用于HE、Masson染色和免疫組化染色。

1.3.1 皮膚羥脯氨酸（HYP）含量的測定 采用樣本堿水法，按操作試劑盒步驟進行，用羥脯氨酸標準品濃度梯度溶液的OD值繪制標準曲線：根據(jù)標準曲線查得待測樣本相應的羥脯氨酸含量（μg/mg），測量3次取平均值。

1.3.2 皮膚病理學觀察 用HE和Masson染色法觀察皮膚組織學改變。小鼠皮損處皮膚進行HE染色，肉眼和顯微鏡觀察小鼠皮膚的變化。

1.3.3 皮膚厚度 測量皮膚厚度（表皮+真皮），皮膚HE染色切片采用病理圖像分析儀自帶系統(tǒng)軟件進行測量，每只小鼠的切片隨機取5處測皮膚厚度后，求得該小鼠皮膚厚度的均值，觀察各組差異。

1.3.4 纖維化指數(shù) 用Masson染色計算纖維化指數(shù)。Masson染色結果：小鼠皮膚組織中膠原纖維為亮綠色，肌纖維為紅色，細胞核為黑色。用細胞免疫組化定量分析系統(tǒng)來測定組織切片圖象（×10），以亮綠色為陽性，算出每一視野中陽性表達的強度，再測定其陽性面積，然后計算平均值。每張切片隨機取3個視野，每個視野大小為8500μm2。最后計算每份標本的膠原纖維指數(shù)。膠原纖維指數(shù)=陽性面積值×陽性強度。

1.3.5 小鼠皮膚CTGF蛋白和ColV分布的檢測 用免疫組化染色法，主要步驟：石蠟切片使用TO進行脫蠟，使用不同濃度的乙醇水化，并對其進行抗原修復，放到3% H2O2溶液中27℃孵育10min，PBS沖洗3次（2min/次），滴加正常山羊血清工作液，27℃孵育30min；滴加兔抗鼠CTGF和ColV多克隆抗體一抗（工作濃度分別為1∶150和1∶800），用正常小鼠IgG抗體當陰性對照，放入濕盒中，于4℃冰箱內孵育過夜（約12h）。第二天，用PBS沖洗3次（2min/次），再加入驢抗兔IgG二抗（1∶500），在濕盒室溫孵育20min，再用PBS沖洗3次（2min/次）加入DAB顯色液顯色，自來水沖洗，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，用中性樹膠進行封片、室溫干燥后，用顯微鏡觀察、拍照。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素ANOVA進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 皮膚HYP含量

HYP是膠原蛋白中特有的氨基酸，測定皮膚HYP含量是評估膠原沉積的一種定量方法，可用于評定纖維化的程度。本研究結果顯示，與對照組比較，PFD干預組無統(tǒng)計學差異；BLM組皮膚HYP含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；BLM+PFD干預組在使用PFD干預后，HYP含量較BLM組顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 樣本堿水法檢測皮膚組織HYP的含量

2.2 HE和Masson染色法觀察皮膚組織學改變

一般情況：BLM組小鼠體重較對照組和PFD干預組減輕，小鼠變得遲鈍，活動少，毛發(fā)色澤變暗淡無光，注射部位皮膚增厚變硬。HE和Masson染色：BLM組小鼠較對照組和PFD干預組真皮層顯著增厚，膠原纖維明顯增粗、數(shù)量增多，排列緊密、毛囊萎縮，纖維間隙變窄、血管管壁增厚、管腔狹窄，并伴炎性細胞浸潤。而BLM+PFD干預組較BLM組上述改變減少。見圖2。

圖2 HE和Masson染色法觀察皮膚組織學改變（×200，A、B、C、D分別為對照組、BLM組、BLM+PFD干預組和PFD干預組，1為HE染色，2為Masson染色）

2.3 各組小鼠皮膚厚度及Masson指數(shù)變化

BLM組小鼠皮膚厚度及Masson指數(shù)均明顯高于BLM+PFD干預組，對照組和PFD干預組最低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠皮膚厚度及Masson染色指數(shù)比較（ ± s）

表1 各組小鼠皮膚厚度及Masson染色指數(shù)比較（ ± s）

注：與BLM組比較，#P＜0.05

組別 n Masson染色指數(shù) 皮膚厚度（μm）對照組 6 35±12# 18.5±2.2#BLM組 6 198±46 36.7±4.5 BLM+PFD組 6 112±38# 30.9±3.6#PFD組 6 39±15# 18.9±2.5#F 7.674 4.388 P 0.020 0.022

2.4 免疫組化染色法檢測小鼠皮膚CTGF蛋白和ColV分布

CTGF蛋白在細胞胞漿和胞膜上呈陽性表達，對照組和PFD干預組表達陰性，BLM組真皮和基底細胞層均呈強陽性表達，ColV在真皮層、小血管及周圍可聚集分布，BLM+PFD干預組較BLM組陽性表達率降低，見圖3～4。結果判定：陽性為棕黃色，用細胞免疫組化定量分析系統(tǒng)采集免疫組化染色皮膚組織切片圖象（×10），以棕黃色為陽性，計算每一視野中CTGF和ColV免疫組化陽性表達強度，再測定其陽性表達的面積，然后計算平均值，并進行相關量化計算。免疫組織化學指數(shù)=陽性面積值×陽性強度。結果顯示，BLM組小鼠皮膚CTGF蛋白和ColV的免疫組化指數(shù)均明顯高于BLM+PFD干預組，對照組和PFD干預組最低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)[8]，SD是一種以免疫異常、纖維化和血管病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的自身免疫性疾病。我國患病率約50～300/100萬[9]。皮膚和內臟的纖維化主要是由休眠的成纖維細胞激活為肌成纖維細胞，進而產(chǎn)生過多的Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型膠原、膠原修飾酶和其他細胞外基質（etracellular matrixc，ECM）成分[10-11]。目前多數(shù)學者認為肺纖維化發(fā)病機制的共同特征可能是體內細胞外基質（ECM）的合成和降解的代謝失衡。病毒性肝炎后繼發(fā)肝纖維化的過程就是纖維細胞激活釋放過多膠原和ECM過程，同時降解活性受到抑制。

表2 各組小鼠皮膚CTGF蛋白和ColV免疫組化指數(shù)比較（x ± s）

圖3 免疫組化染色法檢測小鼠皮膚CTGF蛋白（A、B、C、D分別為對照組、BLM組、BLM+PFD干預組和PFD干預組，1為×100，2為×200）

圖4 免疫組化染色法檢測小鼠皮膚ColV分布（A、B、C、D分別為對照組、BLM組、BLM+PFD干預組和PFD干預組，1為×100，2為×200）

本研究發(fā)現(xiàn)，與BLM組比較，硬皮病鼠模型皮膚中的HYP含量明顯高于BLM+PFD干預組和正常對照組。膠原蛋白代謝正常和異常的組織中HYP含量不同，可將HYP含量作為衡量膠原代謝的指標[12]。膠原合成過剩會使機體內部調節(jié)紊亂，引起增生病變，如肝、肺纖維化。通過測定組織中HYP含量，還能夠了解肝纖維化時成纖維細胞的活性、膠原的增值及合成情況[13]，據(jù)此來監(jiān)測肝纖維化患者的病理情況。本研究結果表明硬皮病鼠皮膚中有過度的膠原沉積及膠原代謝異常。

CTGF具有多種生物學活性，可促進成膠原細胞增殖、ECM和膠原沉積，與TGFβ發(fā)揮協(xié)同作用，是新發(fā)現(xiàn)的細胞因子[14-15]。Col V在調節(jié)免疫系統(tǒng)功能和誘導血管炎性改變方面發(fā)揮重要作用，是ECM起始聚集和維持細胞正常形態(tài)結構所必需的成份[16-17]。因此，我們認為CTGF和ColV可能在SD發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。本研究中HE和Masson染色顯示，BLM組小鼠真皮層明顯增厚，膠原纖維增粗、增多，血管管壁增厚、管腔狹窄，并伴炎性細胞浸潤，而BLM+PFD干預組較BLM組上述改變減少。皮膚厚度及Masson染色指數(shù)結果顯示，與BLM組比較，BLM+PFD干預組、對照組及PFD組小鼠的皮膚厚度及Masson染色指數(shù)是顯著降低的，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。說明PFD能顯著改善博來霉素誘導的膠原細胞增值和炎性細胞浸潤。吡非尼酮的結構是5-甲基1-苯基2（1氫），有防止甚至逆轉纖維化的發(fā)生和瘢痕形成的作用，是一種新型的抗纖維化藥物，在大量的研究中表現(xiàn)出具有抗纖維化和抗炎的作用。有實驗證明吡非尼酮可以預防化學誘導的大鼠硬化性腹膜炎，對于肝臟、肺、腎臟纖維化以及皮膚瘢痕等均有明顯療效[18-20]。日本和歐盟分別在2008年和2011年批準使用吡非尼酮治療IPF[21]。我國和美國FDA分別于2013年和2014年批準PFD用于治療IPF[22]。PFD抗纖維化作用的機制尚處于研究之中，但大量的研究已經(jīng)證明PFD是一種有效的細胞因子抑制劑，能夠通過參與調節(jié)某些因子，抑制成纖維細胞的生物學活性，導致細胞增殖受抑，基質膠原合成減少[23]。目前發(fā)現(xiàn)PFD作用的靶因子有：TGF-β、CTGF、TNF-α、PDGF和其他因子。

有研究顯示，在SD患者皮膚組織中，CTGF在表皮基底層細胞和成纖維細胞中均有強陽性表達；而在正常皮膚組織的表皮和真皮表達信號微弱或陰性[24]。本研究中免疫組化染色顯示，BLM組硬皮病鼠真皮和基底細胞層CTGF蛋白均呈強陽性表達，與文獻報道的一致；ColV在真皮層、小血管及周圍可聚集分布，BLM+PFD干預組較BLM組陽性表達率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。免疫組化指數(shù)結果進一步顯示，與BLM組比較，BLM+PFD干預組、對照組及PFD組小鼠的皮膚CTGF蛋白與ColV免疫組化指數(shù)是顯著降低的，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CTGF與ColV在BLM組小鼠皮膚中表達均升高，說明兩者共同參與了SD的發(fā)生、發(fā)展，而且CTGF與ColV之間可能存在某種因果關系。予吡非尼酮干預后兩者的含量均降低，說明PFD可能通過作用于CTGF導致ColV的增值受抑制。

綜上所述，皮膚中CTGF和ColV表達增多是硬皮病發(fā)生發(fā)展的重要原因，采用PFD灌胃治療后，可降低CTGF和ColV的含量，相關因子可能成為治療硬皮病的潛在靶點。