廖嫻，王雅文，黃月純，丘振文，蔡慶群

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510006)

復(fù)方黃槐灌腸劑是廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由大黃、槐花、積雪草等中藥組方制成，具有通腑降濁、清熱解毒之功效，主要用于血癥(嘔血、吐血、便血及其他出血)，臨床應(yīng)用效果較好，受到患者歡迎。方中大黃具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃之功效[1]。大黃主要含有蒽醌類、蒽酮類、二苯乙烯類、苯丁酮類、鞣質(zhì)類、多糖類物質(zhì)等[2]。蒽醌類為大黃重要代表性成分，游離蒽醌是抗菌消炎的主要有效成分[3]?；泵缀突被ㄖ械狞S酮類化合物有10余種，主要為槲皮素、山柰酚、染料木素、異鼠李素及其糖苷，其中蘆丁是槐米中含量最高的黃酮苷成分[4-5]。目前，復(fù)方黃槐灌腸劑的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)缺乏相關(guān)的定性及定量指標(biāo)。為發(fā)揮醫(yī)院制劑特色，同時(shí)加強(qiáng)制劑質(zhì)量控制，保證患者用藥安全有效，筆者在本實(shí)驗(yàn)對(duì)復(fù)方黃槐灌腸劑方中主要藥味大黃、槐花進(jìn)行薄層色譜(TLC)定性研究，并采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定大黃中蒽醌類成分含量，初步建立了專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定可靠的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀(美國(guó) Agilent 公司，DAD 檢測(cè)器，Agilent 1200色譜工作站)；半自動(dòng)點(diǎn)樣儀(CAMAG Linomat-5)；全自動(dòng)展開儀(CAMAG ADC2)；硅膠H預(yù)制板(青島海洋化工廠，批號(hào)：20140512)；硅膠H自制板；硅膠G預(yù)制板(煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所，批號(hào)：20140319；青島海洋化工廠，批號(hào)：20140108)；HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)； XA105型十萬(wàn)分之一電子天平(METTLER TOLEDO公司，感量：0.01 mg)。

1.2試藥 蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：100080-201408，含量：90.2%)、大黃對(duì)照藥材(批號(hào)：120902-200408)、大黃酸對(duì)照品(批號(hào)：0757-200005，含量：100%)、蘆薈大黃素對(duì)照品(批號(hào)：110795-200806，含量：98.6%)、大黃素對(duì)照品(批號(hào)：0756-200110，含量：100%)、大黃酚對(duì)照品(批號(hào)：0796-200208，含量：100%)、大黃素甲醚對(duì)照品(批號(hào)：110758-200610，含量：98.6%)均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。大黃陰性對(duì)照樣品(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心，按工藝制成不含大黃的樣品)，槐花陰性對(duì)照樣品(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心，按工藝制成不含槐花的樣品)，復(fù)方黃槐灌腸劑(批號(hào)：20171201，20180501，20180801，廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供)；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1TLC鑒別

2.1.1大黃的TLC鑒別 量取本品5 mL，加水至10 mL，加鹽酸1 mL，加熱回流30 min，立即冷卻，用乙醚振搖提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，即得供試品溶液。取大黃陰性對(duì)照樣品5 mL，按供試品方法制成大黃陰性對(duì)照溶液。另取大黃對(duì)照藥材0.1 g，加甲醇20 mL，浸泡1 h，濾過(guò)，取濾液10 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，自“加鹽酸1 mL”起，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取大黃酸對(duì)照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的對(duì)照品溶液。照TLC法(《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則0502)實(shí)驗(yàn)，吸取上述4種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以石油醚(30～60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15：5：1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(波長(zhǎng)365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜及對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)；置氨蒸氣中熏后，斑點(diǎn)變?yōu)榧t色，大黃陰性對(duì)照溶液未見干擾，見圖1。

2.1.2槐花的TLC鑒別 取本品10 mL，用乙醚振搖提取2次，每次20 mL，棄去乙醚液，水液用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取槐花陰性對(duì)照樣品10 mL，按供試品方法制成槐花陰性對(duì)照溶液。另取蘆丁對(duì)照品，加甲醇制成每毫升含2 mg溶液，作為對(duì)照品溶液。按照TLC法(《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則0502)實(shí)驗(yàn)，吸取上述3種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(8：1：1：1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，待乙醇揮干后，105 ℃加熱約5 min，置紫外光燈(波長(zhǎng)365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，槐花陰性對(duì)照液未見干擾。見圖2。

1.大黃酸對(duì)照品；2.大黃對(duì)照藥材；3—5.供試品溶液；6.大黃陰性對(duì)照溶液。

圖1 大黃TLC圖

1.rhein reference；2.RadixetRhizomaRheiPalnatareference；3-5.samples；6.RadixetRhizomaRheiPalnatanegative control.

Fig.1 Thin layer chromatogram ofRadixetRhizomaRheiPalnata

1.蘆丁對(duì)照品；2—4.供試品溶液；5.槐花陰性對(duì)照溶液。

圖2 槐花TLC圖

1.rutin reference ；2-4.samples；5.sophorareflos negative control.

Fig.2 Thin layer chromatogram ofSophorajaponica

2.2含量測(cè)定

2.2.1色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸(85：15)；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含蘆薈大黃素8.52 μg、大黃酸8.96 μg、大黃素8.34 μg、大黃酚8.40 μg、大黃素甲醚4.09 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備 精密吸取本品1 mL，置圓底燒瓶，加8%鹽酸10 mL，再加三氯甲烷20 mL，置水浴中加熱回流1 h，立即冷卻，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得[6]。

2.2.4陰性樣品溶液的制備 精密吸取缺大黃的陰性對(duì)照品，按“2.2.3”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備大黃陰性樣品溶液。

2.2.5專屬性實(shí)驗(yàn) 分別吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各 10 μL注入液相色譜儀，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，結(jié)果各峰分離良好，峰形對(duì)稱，且陰性樣品在相應(yīng)位置無(wú)干擾峰，表明專屬性良好，見圖3。

2.2.6線性關(guān)系考察 精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含蘆薈大黃素8.52 μg、大黃酸35.84 μg、大黃素8.34 μg、大黃酚14.62 μg、大黃素甲醚4.09 μg的混合對(duì)照品貯備溶液。

分別精密吸取混合對(duì)照品貯備溶液0.5，1，2，3，4 mL于10 mL 量瓶，分別加甲醇至刻度，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)(X)，色譜峰面積(A)為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

2.2.7精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.73%，0.94%，0.62%，0.85%，1.02%(n=6)。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批(批號(hào)：20180501)樣品6份，分別按“2.2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均含量分別為15.49，93.89，23.99，29.34，6.25 μg·mL-1，RSD分別為1.12%，1.53%，1.79%，2.01%，1.33%(n=6)。結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.2.9穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于0，2，4，8，12，24 h后進(jìn)樣分析，記錄峰面積，結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.01%，1.93%，1.85%，2.04%，1.73%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

A.大黃陰性樣品溶液；B.混合對(duì)照品溶液；C.供試品溶液；1.蘆薈大黃素；2.大黃酸；3.大黃素；4.大黃酚；5.大黃素甲醚。

圖3 復(fù)方黃槐灌腸液HPLC圖

A.RadixetRhizomaRheiPalnata negative sample solution；B.mixed sample solution；C.sample solution；1.aloe-emodin；2.rhein；3.emodin；4.chrysophanol；5.physcion.

Fig.3 HPLC chromatograms of compoundHuanghuaienema

表1 5種成分回歸方程與線性范圍

Tab.1 Regression equations and linear range of five components

成分回歸方程相關(guān)系數(shù)(r)線性范圍/ng蘆薈大黃素Y=4.437 6X+0.092 10.999 94.26～34.08大黃酸Y=2.334 X+0.497 60.999 717.92～143.36大黃素Y=3.135 9X-0.392 70.999 84.17～33.36大黃酚Y=4.879 3X+1.334 50.999 87.31～58.48大黃素甲醚Y=3.381 4X-0.112 70.999 82.04～16.36

2.2.10回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的同批樣品(批號(hào)：20180501)6份，每份0.5 mL，精密量取，分別精密加入各對(duì)照品溶液適量，按照“2.2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，并進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 5種成分加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of recovery test of five components

n=6

2.2.11樣品測(cè)定 分別取各批號(hào)樣品，按“2.2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表3 5種成分3批樣品的含量測(cè)定結(jié)果

Tab.3 Content determination result of 3 batches of 5 components

μg·mL-1，n=3

3 討論

在TLC鑒別實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部大黃項(xiàng)下所收載薄層鑒別方法研究[1]，所得色譜斑點(diǎn)清晰，供試品色譜在與對(duì)照藥材、對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)良好，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，列入標(biāo)準(zhǔn)。參考《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部槐花項(xiàng)下薄層鑒別方法進(jìn)行研究[4]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2015年版槐花項(xiàng)下顯色方法為噴1%三氯化鋁乙醇溶液，揮去乙醇，置紫外光燈(波長(zhǎng)365 nm)下檢視，結(jié)果主斑點(diǎn)顏色較淡，供試品溶液需較濃或增加點(diǎn)樣量斑點(diǎn)才較清晰?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2015年版含槐花的復(fù)方制劑顯色方法有采用5%三氯化鋁乙醇溶液或10%三氯化鋁乙醇溶液，在放置過(guò)夜后檢視或105 ℃加熱顯色后檢視。筆者在本研究采用了5%三氯化鋁乙醇溶液為顯色劑，分別對(duì)噴顯色劑后直接檢視、放置1 h后檢視、放置過(guò)夜后檢視與105 ℃加熱顯色后檢視，結(jié)果105 ℃加熱顯色后檢視斑點(diǎn)最清晰?；被ū诱归_劑系統(tǒng)采用《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版槐花項(xiàng)下方法及含槐花制劑項(xiàng)下方法進(jìn)行比較，確定采用槐花制劑項(xiàng)下方法。比較兩種展開劑的薄層色譜圖，《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版含槐花復(fù)方制劑項(xiàng)下乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(8：1：1：1)為展開劑時(shí)，主成分斑點(diǎn)清晰，Rf值更適中，分離效果佳，方法簡(jiǎn)便，因此選擇把該展開劑列入標(biāo)準(zhǔn)。

在含量測(cè)定研究中，確定了以大黃中的蒽醌類成分作為含量測(cè)定指標(biāo)。在供試品溶液制備中，參考文獻(xiàn)[6]用8%鹽酸回流提取。流動(dòng)相參考《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版大黃項(xiàng)下含量測(cè)定方法，選用甲醇-0.1%磷酸，發(fā)現(xiàn)分離效果良好，保留時(shí)間適宜，基線平穩(wěn)，理論板數(shù)達(dá)到要求。

綜上所述，筆者在本研究建立的復(fù)方黃槐灌腸液 TLC及 HPLC 測(cè)定法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，方法靈敏、快速，重復(fù)性好，達(dá)到制劑質(zhì)量穩(wěn)定可控的目的，可滿足制劑安全有效的臨床需求。