郭曉玉，張曉霞，謝彩俠，謝惠英，耿曉桐，雷敬衛(wèi)

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450046；2.鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，鄭州 451460)

知柏地黃丸(濃縮丸)是在六味地黃丸基礎(chǔ)上加黃柏和知母兩味藥而成，可滋陰降火，臨床上應(yīng)用于多種疾病的治療[1]。由于該制劑生產(chǎn)廠(chǎng)家多，處方中藥味較復(fù)雜，在知柏地黃丸生產(chǎn)過(guò)程中，不同廠(chǎng)家所選用的輔料質(zhì)量、藥材產(chǎn)地及生產(chǎn)工藝參數(shù)不盡相同，《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版也并未對(duì)相關(guān)事項(xiàng)做明確要求，導(dǎo)致不同廠(chǎng)家知柏地黃丸質(zhì)量有差異。中藥是多組分多靶點(diǎn)特殊藥品，《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版僅用丹皮酚和馬錢(qián)苷含量是否合格作為評(píng)價(jià)知柏地黃丸(濃縮丸)質(zhì)量的主要指標(biāo)，并沒(méi)有體現(xiàn)中藥質(zhì)量特征，也不能反映不同廠(chǎng)家知柏地黃丸(濃縮丸)差異；另外，中藥質(zhì)量穩(wěn)定性是決定中藥質(zhì)量安全、有效的重要因素之一，它是中藥產(chǎn)品在特定的一段時(shí)間(有效期)內(nèi)，保持化學(xué)、物理、微生物特性以及療效的能力[2]，目前關(guān)于藥品在存放及流通過(guò)程中一旦超過(guò)其規(guī)定有效期，其質(zhì)量與有效期內(nèi)中藥的差異研究筆者鮮見(jiàn)報(bào)道。本課題組前期利用高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜技術(shù)對(duì)3個(gè)廠(chǎng)家及不同放置時(shí)間的知柏地黃丸進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)[3]，3個(gè)廠(chǎng)家樣品HPLC指紋圖譜的相似度較高，質(zhì)量特征一致性較好，但利用HPLC指紋圖譜不能有效區(qū)分有效期內(nèi)與有效期外知柏地黃丸樣品，因此亟待尋找一種可以有效鑒別由于輔料、工藝及放置時(shí)間等不同所引起差異的知柏地黃丸樣品，以規(guī)范市場(chǎng)上流通藥品的質(zhì)量特征，防止超出有效期的藥品再次流入市場(chǎng)，給藥物的安全帶來(lái)隱患。近紅外光譜(near infrared reflectance spectroscopy，NIRS)技術(shù)是利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法將物質(zhì)近紅外波段范圍的光譜指紋圖譜信息與其物理、化學(xué)及其他質(zhì)量特征進(jìn)行關(guān)聯(lián)，建立的一種快速、無(wú)損的綠色分析方法，可以反映物質(zhì)整體的質(zhì)量信息[4]。因此，近年來(lái)被廣泛用于中藥這一特殊藥品的定性鑒別及定量分析。本研究利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，對(duì)不同廠(chǎng)家知柏地黃丸(濃縮丸)及同一廠(chǎng)家有效期內(nèi)與有效期外的知柏地黃丸(濃縮丸)的NIRS指紋圖譜信息進(jìn)行分析，試圖建立一種可以快速準(zhǔn)確鑒別不同廠(chǎng)家、同一廠(chǎng)家有效期內(nèi)和有效期外知柏地黃丸的方法，以期為建立一套符合中藥特點(diǎn)、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的知柏地黃丸(濃縮丸)質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)體系提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Nicolet 6700型傅立葉變換近紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；Milli-Q Academic A 10型超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)；AL 204型分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，感量：0.1 mg)；CPA225D型十萬(wàn)分之一分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，感量：0.01 mg)；FW-100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；101-3AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 知柏地黃丸(濃縮丸)，收集市場(chǎng)上A、B、C3個(gè)廠(chǎng)家不同批次知柏地黃丸(濃縮丸)樣品82份，其中第1～61份為A廠(chǎng)家生產(chǎn)、第62～72份為B廠(chǎng)家生產(chǎn)，第73～82份為C廠(chǎng)家生產(chǎn)。藥品粉碎過(guò)60目篩(篩孔內(nèi)徑0.25 mm)后置干燥器中，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)方法 首先，取樣品粉末5 g，采用積分球漫反射法，以空氣為參比、光譜范圍12 000～4000 cm-1、分辨率8 cm-1，溫度25 ℃、相對(duì)濕度20%～30%、掃描次數(shù)為32的掃描條件下，每個(gè)樣品重復(fù)5次，獲取82份知柏地黃丸(濃縮丸)樣品NIRS指紋圖譜；其次，選擇用于建立模型的校正集樣品和用于驗(yàn)證模型的驗(yàn)證集樣品，校正集與驗(yàn)證集比例一般為5：1～ 3：1，以錯(cuò)判個(gè)數(shù)和性能指數(shù)(performance index，PI)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同光譜預(yù)處理方法及光譜范圍對(duì)NIRS指紋圖譜質(zhì)量評(píng)價(jià)模型判別效果的影響，以確定最佳能夠區(qū)分不同廠(chǎng)家知柏地黃丸(濃縮丸)差異的光譜預(yù)處理方法及光譜范圍；最后，采用三重交叉驗(yàn)證法，對(duì)所建立的NIR指紋圖譜判別分析模型進(jìn)行準(zhǔn)確性和適用性驗(yàn)證。

A廠(chǎng)家知柏地黃丸(濃縮丸)放置一段時(shí)間后，有7份樣品超出藥品規(guī)定有效期，超出有效期的時(shí)間依次為17，12，11，9，9，7，1個(gè)月。為評(píng)價(jià)有效期內(nèi)與有效期外知柏地黃丸(濃縮丸)藥品差異，筆者采用NIRS評(píng)價(jià)方法對(duì)A廠(chǎng)家已過(guò)有效期的7份樣品及有效期內(nèi)的30份代表性樣品的指紋圖譜進(jìn)行分析。

2.23個(gè)廠(chǎng)家知柏地黃丸(濃縮丸)NIRS指紋圖譜的建立與分析

2.2.1校正集及驗(yàn)證樣品的選擇 82份知柏地黃丸樣品NIRS指紋圖譜見(jiàn)圖1。分別從A廠(chǎng)家61份、B廠(chǎng)家11份和C廠(chǎng)家10份樣品中選擇51份、9份、8份作為校正集樣品，其他作為驗(yàn)證集樣品。

2.2.2光譜預(yù)處理方法 合適的光譜預(yù)處理方法可以降低NIRS中的背景干擾，最大程度保留與樣品物理、化學(xué)性質(zhì)相關(guān)的有效光譜信息，進(jìn)而建立可以真實(shí)反映樣品相關(guān)信息的NIRS指紋圖譜，提高其分析模型的可靠性。筆者通過(guò)分析不同光譜預(yù)處理方法所建立的NIRS指紋圖譜評(píng)價(jià)模型的錯(cuò)判個(gè)數(shù)及PI值優(yōu)選最佳光譜預(yù)處理方法(表1)，由結(jié)果知，多元散射校正(multiplicative scatter correction，MSC)+二階導(dǎo)數(shù)(second derivative，SD)+濾波法(norris derivative，ND)為最佳光譜預(yù)處理方法。

2.2.3光譜范圍的選擇 NIRS的光譜范圍較寬，不同范圍所反映的與樣品性質(zhì)相關(guān)的有效信息不同。為選擇能代表樣品差異的特征光譜信息，以建立可靠的質(zhì)量評(píng)價(jià)模型，筆者以不同波段范圍所建立的近紅外判別分析模型對(duì)不同廠(chǎng)家樣品的錯(cuò)判個(gè)數(shù)及PI值來(lái)確定最佳光譜范圍(表2)，由結(jié)果可知最佳建模譜段為7575.57～4157.77 cm-1。

圖1 82份知柏地黃丸(濃縮丸)樣品近紅外光譜指紋圖譜疊加圖

Fig.1 Overlay chart of the near-infrared reflectance spectra of 82 batches ofZhibaiDihuangPills (concentrated pills)

表1 不同光譜預(yù)處理方法對(duì)判別分析模型性能的影響

Tab.1 Effects of different pretreatment methods on the performance of discriminant analysis model

光譜預(yù)處理方法錯(cuò)判個(gè)數(shù)PIConstant(原始光譜)093.7MSC(多元散射校正)094.2MSC+SD(二階導(dǎo)數(shù))192.1MSC+SD+SG(卷積平滑)192.8MSC+SD+ND(濾波法)094.9MSC+FD(一階導(dǎo)數(shù))093.1MSC+FD+ND194.8SNV(標(biāo)準(zhǔn)歸一化)093.7

表2 不同光譜范圍對(duì)判別分析模型性能的影響

Tab.2 Effects of different spectral ranges on the performance of discriminant analysis model

光譜范圍錯(cuò)判個(gè)數(shù)PI6 039.04～4 008.95093.77 575.57～4 157.77094.99 903.65～4 008.95093.69 903.65～6 569.84092.7

2.2.4NIRS判別分析模型的建立 采用TQ Analyst 8.0版分析軟件中的判別分析法，采用MSC+SD+ND方法對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理，在7575.57～4157.77 cm-1波段范圍內(nèi)建立3個(gè)廠(chǎng)家知柏地黃丸判別分析模型(圖2)，由圖2可知，利用所建立的NIRS判別分析模型可以將3個(gè)廠(chǎng)家知柏地黃丸(濃縮丸)樣品明顯分為3類(lèi)，說(shuō)明3個(gè)廠(chǎng)家樣品質(zhì)量特征存在明顯差異。另外，由同一廠(chǎng)家不同批號(hào)樣品之間的距離可以看出，A、C廠(chǎng)家各自樣品之間的距離較接近，樣品之間差異較小，說(shuō)明質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，而B(niǎo)廠(chǎng)家不同批號(hào)樣品雖然聚在一起，但樣品之間距離較大，說(shuō)明B廠(chǎng)家不同批號(hào)之間樣品質(zhì)量存在一定差異。

圖2 不同廠(chǎng)家知柏地黃丸(濃縮丸)判別分析圖(○.A；□.B；△.C)

Fig.2 Discriminant analysis diagram ofZhibaiDihuangPills (concentrated pills) from different manufacturers(○.A；□.B；△.C)

2.2.5模型的驗(yàn)證 為驗(yàn)證模型可靠性，筆者采用三重交叉驗(yàn)證法，隨機(jī)將樣品均分為3組，依次取其中2組作為校正集，另一組作為驗(yàn)證集(表3)，對(duì)模型準(zhǔn)確性和適用性進(jìn)行進(jìn)一步檢驗(yàn)(表4)，由表3和表4可知所建判別分析模型性能較好，可以用于快速鑒別3個(gè)廠(chǎng)家的知柏地黃丸(濃縮丸)。

表3 不同廠(chǎng)家知柏地黃丸(濃縮丸)三重交叉驗(yàn)證的樣品信息

Tab.3 Samples ofZhibaiDihuangPills (concentrated pills) from different manufacturers in triple cross validation

個(gè)

2.3A廠(chǎng)家有效期內(nèi)與有效期外知柏地黃丸(濃縮丸)NIRS指紋圖譜鑒別分析結(jié)果 按照“3.1”項(xiàng)下采集A廠(chǎng)家30份有效期內(nèi)和7份有效期外的知柏地黃丸(濃縮丸)樣品，通過(guò)考察光譜預(yù)處理方法和建模波段，最終選擇光譜預(yù)處理方法為MSC+SG，建模波段為8003.94～4195.20 cm-1。利用TQ Analyst 8.0版分析軟件建立A廠(chǎng)家有效期內(nèi)與有效期外知柏地黃丸(濃縮丸)的近紅外判別分析模型(圖3)。由圖3可知，該模型可以將A廠(chǎng)家有效期內(nèi)與有效期外知柏地黃丸(濃縮丸)明顯分為兩類(lèi)，說(shuō)明兩種樣品之間由于物理化學(xué)性質(zhì)差異導(dǎo)致其在8003.94～4195.20 cm-1波段范圍內(nèi)的NIRS指紋圖譜不同。因此，利用該波段所反映的NIRS指紋圖譜信息可以有效鑒別有效期內(nèi)與有效期外知柏地黃丸(濃縮丸)樣品。另外，由圖3可知，有效期外知柏地黃丸(濃縮丸)樣品之間距離較大，這可能由于有效期外樣品出有效期的時(shí)間不同所致。

表4 不同廠(chǎng)家知柏地黃丸(濃縮丸)判別分析模型的三重交叉驗(yàn)證結(jié)果

Tab.4 Results of discriminant analysis model ofZhibaiDihuangPills (concentrated pills) from different manufacturers in triple cross validation

數(shù)據(jù)組合樣品數(shù)準(zhǔn)確率/%組合Ⅰ 校正集(組1,2)55 驗(yàn)證集(組3)27100組合Ⅱ 校正集(組2,3)55 驗(yàn)證集(組1)27100組合Ⅲ 校正集(組1,3)54 驗(yàn)證集(組2)28100

圖3 有效期內(nèi)與有效外知柏地黃丸(濃縮丸)判別分析圖(□.有效期外樣品；△.有效期內(nèi)樣品)

Fig.3 Discriminant analysis diagram of the expired or unexpiredZhibaiDihuangPills (concentrated pills) in the valid and expired period (□.the expired samples；△.the unexpired samples)

3 討論

中藥是基于中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下的多組分相互協(xié)同作用從整體上治療疾病的的一種特殊藥品，具有復(fù)雜性、整體性等特征?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2015年版中一般采用某個(gè)或某幾個(gè)化學(xué)成分含量的高低作為評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量是否合格的標(biāo)準(zhǔn)，并沒(méi)有體現(xiàn)中藥多組分、多靶點(diǎn)特征，因此并不能真實(shí)反映中藥臨床療效，導(dǎo)致中醫(yī)臨床常出現(xiàn)中藥質(zhì)量檢測(cè)合格，但療效一般的“癥對(duì)方準(zhǔn)藥不靈”現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了患者對(duì)中藥的認(rèn)可度。因此迫切需要構(gòu)建一套符合中藥特點(diǎn)的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)體系，以反映中藥整體質(zhì)量特征, 保障其療效穩(wěn)定與可控。質(zhì)量源于設(shè)計(jì)，針對(duì)中藥的特殊性，研究者先后將色譜、光譜及生物指紋圖譜技術(shù)等結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法應(yīng)用于中藥的質(zhì)量控制[5-8]，取得了一定的成效。NIRS指紋圖譜分析技術(shù)主要運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件從樣品復(fù)雜的NIRS圖中提取和樣品性質(zhì)相關(guān)的信息，建立光譜特征與樣品性質(zhì)等之間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型以分析樣品特征，在分析過(guò)程中將樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單粉碎后即可掃描其N(xiāo)IRS，所反映的信息主要是中紅外光譜區(qū)基頻吸收的倍頻、合頻、差頻吸收帶疊加而成，它反映了樣品內(nèi)部組分、電負(fù)性和氫鍵等化學(xué)信息和樣品色澤、黏度、密度、顆粒度、均勻度等物理信息，不僅樣品處理簡(jiǎn)單，掃描速度快，而且可以從整體上對(duì)樣品性狀及質(zhì)量做出初步綜合評(píng)價(jià)[4]。知柏地黃丸(濃縮丸)藥味多，質(zhì)量特征復(fù)雜，處方中的藥材和輔料來(lái)源、制備工藝及藥品在市場(chǎng)中的流通時(shí)間等因素均影響其質(zhì)量，《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版以馬錢(qián)苷和丹皮酚作為控制其質(zhì)量的指標(biāo)。前期研究發(fā)現(xiàn)，不同廠(chǎng)家及放置不同時(shí)間(有效期內(nèi)及有效期外)的知柏地黃丸(濃縮丸)HPLC指紋圖譜相似度較高，而且丹皮酚和馬錢(qián)苷含量均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版規(guī)定，因此無(wú)法科學(xué)區(qū)分及評(píng)價(jià)不同廠(chǎng)家知柏地黃丸(濃縮丸)藥品質(zhì)量，而且對(duì)于流通時(shí)間超出有效期的知柏地黃丸(濃縮丸)樣品，該方法不能準(zhǔn)確鑒別。本研究基于NIRS光譜特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)，利用化學(xué)計(jì)量學(xué)知識(shí)對(duì)3個(gè)廠(chǎng)家及超出有效期不同時(shí)間的知柏地黃丸(濃縮丸)樣品的NIRS光譜指紋圖譜信息進(jìn)行差異性分析。結(jié)果表明，利用NIRS指紋圖譜技術(shù)可以有效鑒別不同廠(chǎng)家及超出有效期之外的知柏地黃丸(濃縮丸)樣品，因此NIRS指紋圖譜技術(shù)可以有效表征知柏地黃丸(濃縮丸)藥品質(zhì)量特征，規(guī)范其流通市場(chǎng)。

合理制定藥品的有效期是保證藥品有效、安全使用的重要前提，目前發(fā)達(dá)國(guó)家銷(xiāo)售的植物藥都明確標(biāo)注有效期。中藥走出國(guó)門(mén)，走向國(guó)際市場(chǎng)，必須遵循國(guó)際行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，制定合理的有效期[9]。中藥成分復(fù)雜，而且在放置過(guò)程中可能由于包裝材料、外部環(huán)境等多方面影響產(chǎn)生復(fù)雜物理、化學(xué)及生物變化，選擇一種方法，可以真實(shí)、有效、全面地評(píng)價(jià)中藥在放置過(guò)程中所發(fā)生的一切變化，通過(guò)研究這種變化對(duì)中藥的安全性和臨床療效的影響來(lái)制定中藥的有效期，目前關(guān)于這方面的研究還很薄弱[10-11]，因此應(yīng)該結(jié)合中藥特點(diǎn)，將現(xiàn)代多元分析方法應(yīng)用到中藥有效期研究中，以建立一套科學(xué)合理的評(píng)價(jià)及制定中藥有效期的方法。