王昕，王靜，陳可泉，歐陽(yáng)平凱

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省國(guó)家先進(jìn)材料協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京211816）

脂肪族二元胺作為基礎(chǔ)化學(xué)品，在聚酯、聚氨酯、聚酰胺等高分子材料的合成中占有重要地位［1-2］。2020 年僅聚酰胺類高分子材料的全球市場(chǎng)預(yù)計(jì)可達(dá)970萬(wàn)噸［3］，高分子材料廣闊的市場(chǎng)空間使得對(duì)材料單體的需求日益增大。然而，這些材料單體大多通過(guò)化學(xué)法合成，存在原料依賴化石資源、合成過(guò)程污染嚴(yán)重、環(huán)境安全隱患大等問(wèn)題，尤其化學(xué)合成二元胺的核心技術(shù)長(zhǎng)期被國(guó)外跨國(guó)公司壟斷，已成為我國(guó)相關(guān)高分子材料領(lǐng)域“卡脖子”的重要因素。以自然界中可再生資源為原料通過(guò)生物制造合成二元胺，具有過(guò)程綠色、環(huán)境友好、資源節(jié)約等優(yōu)點(diǎn)，且制備出的生物基材料不僅可以取代傳統(tǒng)材料，性能還有望超越傳統(tǒng)材料，未來(lái)潛力巨大。同時(shí)，生物制造合成二元胺工藝的開(kāi)發(fā)可打破我國(guó)高分子材料領(lǐng)域?qū)?guó)外進(jìn)口的長(zhǎng)期依賴，是我國(guó)生物制造國(guó)家發(fā)展戰(zhàn)略的重要組成部分。

賴氨酸、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸等堿性氨基酸在化學(xué)結(jié)構(gòu)上含有一個(gè)羧基和兩個(gè)氨基，被認(rèn)為是合成C3～C5脂肪族二元胺（1，3-丙二胺、1，4-丁二胺、1，5-戊二胺）的理想前體化合物。當(dāng)前，英國(guó)帝斯曼、中國(guó)科學(xué)院微生物研究所、南京工業(yè)大學(xué)、上海凱賽生物產(chǎn)業(yè)有限公司、寧夏伊品生物科技股份有限公司、日本味之素株式會(huì)社等國(guó)內(nèi)外研究單位和公司均開(kāi)展了大量的生物基二元胺制備研究［4］，但大多利用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法以氨基酸為原料催化脫羧合成，成本較高［5-6］。開(kāi)發(fā)以糖類等生物質(zhì)為原料直接發(fā)酵合成二元胺的工藝，可進(jìn)一步降低二元胺的生產(chǎn)成本，是實(shí)現(xiàn)二元胺規(guī)?；a(chǎn)的關(guān)鍵，近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。

隨著合成生物技術(shù)的快速發(fā)展，人類通過(guò)設(shè)計(jì)、合成和組裝代謝途徑，改造微生物產(chǎn)生新的化合物，構(gòu)建高效的細(xì)胞工廠，使得生物燃料、醫(yī)藥、化學(xué)品等的一系列產(chǎn)品的生物制造成為可能［7］。利用合成生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)對(duì)堿性氨基酸代謝途徑的設(shè)計(jì)改造，1，3-丙二胺、1，4-丁二胺、1，5-戊二胺等C3～C5脂肪族二元胺的生物合成不斷取得新的進(jìn)展。本文重點(diǎn)關(guān)注了C3～C5的脂肪族二元胺的生物合成途徑，介紹了合成生物學(xué)工具在構(gòu)建和優(yōu)化工程細(xì)胞合成二元胺，以及提高產(chǎn)品合成過(guò)程經(jīng)濟(jì)性方面的應(yīng)用，綜述了國(guó)內(nèi)外生物基二元胺合成領(lǐng)域取得的突出進(jìn)展，展望了未來(lái)生物基二元胺菌株改造的重點(diǎn)方向。

1 C3～C5脂肪族二元胺的生物合成途徑

在生物體內(nèi)，C3～C5脂肪族二元胺1，3-丙二胺、1，4-丁二胺和1，5-戊二胺的合成均衍生于堿性氨基酸（賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸或精氨酸）的代謝途徑［8］。當(dāng)前，已發(fā)現(xiàn)模式菌株大腸桿菌具有直接合成1，5-戊二胺和1，4-丁二胺的能力，但產(chǎn)量極微。而常見(jiàn)的氨基酸生產(chǎn)宿主谷氨酸棒狀桿菌缺乏二元胺的天然合成能力，因此了解微生物合成二元胺的代謝途徑，對(duì)高效二元胺細(xì)胞工廠的構(gòu)建至關(guān)重要。

1.1 1，5-戊二胺的生物合成途徑

在微生物體內(nèi)，1，5-戊二胺是通過(guò)賴氨酸脫羧酶催化賴氨酸脫羧形成的［9］。對(duì)于賴氨酸的合成，在微生物中存在兩種不同的途徑：始于α-酮戊二酸和乙酰CoA 的α-氨基己二酸途徑（AAA）和始于天冬氨酸的二氨基庚二酸途徑（DAP）。其中AAA途徑主要存在于高等真菌和古生菌中，具有2種變異途徑；而DAP 途徑有4 種不同的變異途徑，主要存在于細(xì)菌和植物。在常見(jiàn)的賴氨酸生產(chǎn)菌株大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌中，都通過(guò)DAP 途徑合成賴氨酸，但催化路徑有所差異，如圖1所示，谷氨酸棒狀桿菌中既可以通過(guò)二氨基庚二酸脫氫酶（DDH） 直接催化六氫吡啶二羧酸轉(zhuǎn)化為二氨基庚二酸，也可以通過(guò)DapD、DapC、DapE、DapF 經(jīng)四步催化完成轉(zhuǎn)化，而在大腸桿菌中需要DapD、DapC、DapE、DapF 經(jīng)四步催化形成二氨基庚二酸，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化合成賴氨酸［9］。

圖1 C3～C5脂肪族二元胺的生物合成途徑［8-13］（實(shí)線箭頭為一步代謝途徑，虛線箭頭為一步以上代謝途徑。綠色為1，3-丙二胺合成途徑，紫色為1，4-丁二胺合成途徑，藍(lán)色為1，5-戊二胺合成途徑）Fig.1 The biosynthetic pathway of the aliphatic diamines with 3～5 carbon atoms(The solid arrows indicate one-step metabolic pathways,and the dotted arrows indicate multiple-step metabolic pathways.The green square represents the synthetic pathway of 1,3-propanediamine,the purple square represents the synthetic pathway of 1,4-butanediamine synthesis route,and the blue square represents the synthetic pathway of 1,5-pentanediamine)

1.2 1，4-丁二胺的生物合成途徑

1，4-丁二胺在微生物體內(nèi)的合成途徑有兩種，包括鳥(niǎo)氨酸脫羧途徑和精氨酸脫羧途徑［10］。如圖1所示，L-鳥(niǎo)氨酸和L-精氨酸的生物合成途徑始于TCA循環(huán)中間體α-酮戊二酸（α-KG）。谷氨酸脫氫酶（GDH）將α-KG生物轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-谷氨酸后，在N-乙酰谷氨酸合酶（ArgJ）、N-乙酰谷氨酸激酶（ArgB）、N-乙酰-γ-谷氨酰氨基-磷酸還原酶（ArgC）、乙酰鳥(niǎo)氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ArgD）和L-鳥(niǎo)氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶（ArgE）一系列酶的催化作用下生成L-鳥(niǎo)氨酸。L-鳥(niǎo)氨酸可進(jìn)一步在L-鳥(niǎo)氨酸氨基甲?；D(zhuǎn)移酶（ArgF）、精氨酸琥珀酸酯合酶（ArgG）、精氨酸琥珀酸裂解酶（ArgH）和L-鳥(niǎo)氨酸氨基甲?；D(zhuǎn)移酶I（ArgI）的催化作用下生成L-精氨酸［11-12］。以鳥(niǎo)氨酸為前體，在鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的催化作用下，可以一步合成1，4-丁二胺。而以精氨酸為前體，通過(guò)精氨酸脫羧酶和胍丁胺酶（SpeB）兩步催化產(chǎn)生1，4-丁二胺［10］。

1.3 1，3-丙二胺的生物合成途徑

1，3-丙二胺的生物合成途徑僅在極少數(shù)微生物中發(fā)現(xiàn)，包括兩條：假單胞菌屬中的C5途徑和不動(dòng)桿菌屬中的C4途徑［13］。如圖1 所示，在C5途徑中，以L-谷氨酸為前體，通過(guò)一系列酶催化反應(yīng)，經(jīng)鳥(niǎo)氨酸或精氨酸合成1，4-丁二胺，進(jìn)而在亞精胺合成酶（SpeE）的催化作用下合成亞精胺，亞精胺在亞精胺脫氫酶（SpdH）的作用下合成1，3-丙二胺。在C4途徑中，以L-天冬氨酸為前體生成天冬氨酸半醛，進(jìn)而在2-酮戊二酸-4-氨基轉(zhuǎn)移酶（DAT）、L-2，4-二氨基丁酸酯脫羧酶（DDC）的催化作用下合成1，3-丙二胺。

2 二元胺合成菌株的構(gòu)建和優(yōu)化

當(dāng)前，通過(guò)對(duì)已知生物基二元胺代謝途徑進(jìn)行設(shè)計(jì)、重組和組裝，在大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌等菌株中，已開(kāi)展了大量生物基二元胺合成的工作。利用合成生物學(xué)技術(shù)，如功能元件的進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)、調(diào)控元件的優(yōu)化、途徑的適配性調(diào)控、基因組的修飾和改造等（圖2），進(jìn)一步使得產(chǎn)二元胺人工細(xì)胞的性能得到優(yōu)化。

圖2 二元胺合成細(xì)胞的優(yōu)化策略［14-48］Fig.2 The engineering strategy for the optimization of diamine synthetic cells[14-48]

2.1 二元胺合成途徑的構(gòu)建

大腸桿菌存在天然的1，5-戊二胺和1，4-丁二胺代謝途徑，通過(guò)對(duì)代謝途徑中關(guān)鍵功能元件的表達(dá)調(diào)控以及旁支代謝途徑的敲除，實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌對(duì)1，5-戊二胺和1，4-丁二胺的發(fā)酵生產(chǎn)。2011年，Qian等［14］在E.coliW3110 中通過(guò)過(guò)表達(dá)賴氨酸脫羧酶（CadA），同時(shí)抑制與1，5-戊二胺降解相關(guān)的代謝途徑，在30 h 的發(fā)酵后獲得9.6 g/L 1，5-戊二胺，生產(chǎn)速率為0.32 g/（L·h），葡萄糖轉(zhuǎn)化率僅為0.12 g/g；2009 年，韓國(guó)Sang Yup Lee 研究團(tuán)隊(duì)［15］首次通過(guò)過(guò)表達(dá)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶SpeC/SpeF、敲除SpeE、亞精胺乙酰轉(zhuǎn)移酶（SpeG）以及1，4-丁二胺分解代謝基因puuA阻斷1，4-丁二胺的降解和利用途徑、敲除鳥(niǎo)氨酸代謝的旁支途徑、過(guò)表達(dá)鳥(niǎo)氨酸合成途徑相關(guān)基因等策略，最終獲得了基因工程菌株在6.6L 反應(yīng)器規(guī)模下基于葡萄糖分批補(bǔ)料策略，1，4-丁二胺產(chǎn)量達(dá)24.2g/L。

以谷氨酸棒狀桿菌為宿主，通過(guò)對(duì)異源二元胺合成途徑的組裝，構(gòu)建獲得了產(chǎn)1，5-戊二胺、1，4-丁二胺的重組谷氨酸棒狀桿菌。2007 年Mimitsuka 等［16］通過(guò)將來(lái)源于大腸桿菌的CadA 整合到谷氨酸棒狀桿菌的基因組上，成功實(shí)現(xiàn)了谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)1，5-戊二胺，產(chǎn)量達(dá)2.6 g/L。2010 年，德國(guó)的Schneider 和Wendisch［10］首次在谷氨酸棒狀桿菌中分別構(gòu)建了依賴于鳥(niǎo)氨酸脫羧酶和精氨酸脫羧酶的1，4-丁二胺合成途徑，發(fā)現(xiàn)基于鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的1，4-丁二胺途徑具有更高的合成效率，實(shí)現(xiàn)了1，4-丁二胺在谷氨酸棒狀桿菌中的發(fā)酵合成。

大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌均缺乏1，3-丙二胺的天然合成途徑，2015年，韓國(guó)的Sang Yup Lee課題組［13］以大腸桿菌為宿主細(xì)胞，通過(guò)構(gòu)建1，3-丙二胺合成的C4途徑，首次實(shí)現(xiàn)了1，3-丙二胺的異源合成。在該項(xiàng)工作中，研究人員采用基于生物信息學(xué)的全基因組通量分析技術(shù)對(duì)1，3-丙二胺合成的C4途徑和C5途徑進(jìn)行系統(tǒng)分析，結(jié)果表明C4途徑具有更高的1，3-丙二胺合成效率。進(jìn)而在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)來(lái)源于鮑曼不動(dòng)桿菌的dat基因和ddc基因，實(shí)現(xiàn)了1，3-丙二胺在大腸桿菌中的生物合成［13］。而1，3-丙二胺合成途徑在谷氨酸棒狀桿菌中的構(gòu)建，當(dāng)前還未有研究涉及。

2.2 底盤(pán)細(xì)胞產(chǎn)品降解途徑的解析和改造

底盤(pán)細(xì)胞基因組上與產(chǎn)品降解、利用等相關(guān)冗余基因的存在，顯著影響產(chǎn)品的產(chǎn)量。合成生物學(xué)研究者們通過(guò)將系統(tǒng)生物學(xué)分析和高效的基因組編輯策略相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌中與1，4-丁二胺、1，5-戊二胺降解相關(guān)功能元件的挖掘，進(jìn)一步通過(guò)基因敲除技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了冗余基因的刪減，提高了產(chǎn)品的合成。Kind 等［17］發(fā)現(xiàn)N-乙酰戊二胺是谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵合成1，5-戊二胺的主要副產(chǎn)物，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了基因組上17 個(gè)可能相關(guān)的乙?；?，結(jié)合多基因敲除實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了NCgl1469 編碼的乙酰化酶是催化1，5-戊二胺乙?；年P(guān)鍵酶，該基因的缺失可使得1，5-戊二胺產(chǎn)量提高11%。同樣，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析和系統(tǒng)的基因敲除技術(shù)，Nguyen等［18］發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒狀桿菌中的cg1722基因與1，4-丁二胺的乙?；嚓P(guān)，該基因的缺失可使1，4-丁二胺的產(chǎn)量提高41%。此外，在大腸桿菌中，發(fā)現(xiàn)乙?；?、氨基轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸二元胺連接酶等多個(gè)同二元胺降解和利用相關(guān)的途徑，為底盤(pán)細(xì)胞的基因組改造提供了指導(dǎo)。

2.3 功能元件的設(shè)計(jì)與改造

人工細(xì)胞工廠構(gòu)建中組成代謝途徑的酶、控制基因表達(dá)強(qiáng)度的啟動(dòng)子以及調(diào)控代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控因子等是合成生物系統(tǒng)中最簡(jiǎn)單、最重要的生物元件，對(duì)結(jié)構(gòu)元件與調(diào)控元件的解析與改造也是優(yōu)化人工細(xì)胞工廠性能的關(guān)鍵。

2.3.1 結(jié)構(gòu)元件的篩選、設(shè)計(jì)與改造

脫羧酶，包括賴氨酸脫羧酶（LDC）、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶（ODC）、精氨酸脫羧酶（ADC）、DDC 等作為二元胺合成過(guò)程中的關(guān)鍵功能元件，其活性對(duì)二元胺的合成至關(guān)重要。隨著基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組等組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使得多樣化元件的挖掘成為可能。與1，3-丙二胺合成相關(guān)的DDC 當(dāng)前僅在鮑曼不動(dòng)桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、產(chǎn)氣克萊勃氏桿菌等微生物中發(fā)現(xiàn)［19-22］，而與1，5-戊二胺、1，4-丁二胺合成相關(guān)的LDC、ADC、ODC 已在多種微生物中發(fā)現(xiàn)，其中對(duì)大腸桿菌來(lái)源的酶研究最為深入。在大腸桿菌中，LDC、ADC 和ODC 均存在誘導(dǎo)型和組成型兩種形式。其中誘導(dǎo)型的LDC、ADC 和ODC 分別由cadA、adiA和speF編碼，而組成型的由ldcC、speA和speC編碼［23-29］。不同來(lái)源或形式的脫羧酶對(duì)pH、溫度等環(huán)境的耐受性以及催化活性均有所差異，因此脫羧酶的選擇是影響二元胺合成的關(guān)鍵因素之一。例如，在1，4-丁二胺合成過(guò)程中，組成型的SpeC 比誘導(dǎo)型的SpeF更有利于1，4-丁二胺的合成［10］，同時(shí)在谷氨酸棒狀桿菌對(duì)比7 個(gè)不同來(lái)源的組成型SpeC，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于陰溝腸桿菌的SpeC 表現(xiàn)出最高的1，4-丁二胺合成能力［30］；對(duì)于1，5-戊二胺，誘導(dǎo)型的CadA比組成型的LdcA表現(xiàn)出更高的催化活力［27］。

為了提高產(chǎn)品合成的經(jīng)濟(jì)效益，推動(dòng)產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，對(duì)酶的活性和穩(wěn)定性提出了更高的要求。然而，自然界中天然存在的酶通常不能滿足需求。采用定向進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)等策略，進(jìn)行元件的重新改造，可有效提高結(jié)構(gòu)元件各種功能屬性，滿足細(xì)胞工廠的構(gòu)建需求。Wang 等利用易錯(cuò)PCR 和DNA 改組技術(shù)產(chǎn)生了蜂窩哈夫尼亞菌來(lái)源LDC 的突變文庫(kù)，篩選獲得了具有更高催化活性的酶，使得1，5-戊二胺的合成提高了約1.5倍［31］。Hong等［32］采用基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的理性設(shè)計(jì)策略設(shè)計(jì)獲得了賴氨酸脫羧酶突變體CadAF14C/K44C，顯著提高了CadA 對(duì)pH 的耐受性以及熱穩(wěn)定性，進(jìn)一步篩選獲得的突變體CadAF14C/K44C/L7M/N8G使得1，5-戊二胺的產(chǎn)量提高了1.3 倍，同時(shí)降低了發(fā)酵過(guò)程中pH 的調(diào)控成本。同樣，為了優(yōu)化1，4-丁二胺的合成，Choi 等［33］對(duì)大腸桿菌來(lái)源的SpeC 進(jìn)行了理性設(shè)計(jì)和改造，大大提高了酶的底物親和性，使得酶的活力提高了62.5 倍。Hong 等［34］基于分子結(jié)構(gòu)和蛋白網(wǎng)絡(luò)分析，設(shè)計(jì)構(gòu)建底物特異性增強(qiáng)的酶突變體，使得1，4-丁二胺的產(chǎn)量提高了4 倍。

2.3.2 啟動(dòng)子元件的優(yōu)化

原核基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，因此啟動(dòng)子、RBS 等生物元件在途徑的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。原核生物的啟動(dòng)子元件有誘導(dǎo)型和組成型兩種。為了豐富基因的表達(dá)調(diào)控策略，合成生物學(xué)者已經(jīng)開(kāi)展一系列研究，通過(guò)挖掘多樣的天然啟動(dòng)子、人工設(shè)計(jì)合成非天然啟動(dòng)子，建立了多樣的啟動(dòng)子元件庫(kù)，使得途徑構(gòu)建過(guò)程中基因表達(dá)強(qiáng)度的精確調(diào)控成為可能。當(dāng)前，在大腸桿菌中開(kāi)展二元胺生物合成的基礎(chǔ)研究工作時(shí)，多采用IPTG 誘導(dǎo)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。而在谷氨酸棒狀桿菌中組裝二元胺合成途徑時(shí)，為了進(jìn)一步提高經(jīng)濟(jì)效益，避免昂貴誘導(dǎo)物的添加，合成生物學(xué)研究者們?cè)O(shè)計(jì)了多個(gè)不同的組成型啟動(dòng)子，用于調(diào)控基因的表達(dá)。Oh等［35］在利用谷氨酸棒狀桿菌合成1，5-戊二胺時(shí)，采用6個(gè)不同的人工合成的組成型啟動(dòng)子調(diào)控異源賴氨酸脫羧酶（LdcC）的表達(dá)，篩選獲得了最有利于1，5-戊二胺合成的啟動(dòng)子PH30。利用上述的表達(dá)調(diào)控策略，Kim 等［36］在工業(yè)生產(chǎn)賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌中組裝1，5-戊二胺合成途徑，使得1，5-戊二胺的產(chǎn)量達(dá)103.78 g/L，為當(dāng)前發(fā)酵法生產(chǎn)1，5-戊二胺的最高水平。在1，4-丁二胺合成過(guò)程中，Schneider 等［37］通過(guò)優(yōu)化啟動(dòng)子和RBS 元件，建立了ArgF 精確調(diào)控策略，使得谷氨酸棒狀1，4-丁二胺產(chǎn)量提高到19 g/L，為當(dāng)前谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵合成1，4-丁二胺的最高水平。

2.3.3 調(diào)控因子的解析與改造

除產(chǎn)品自身的合成和降解途徑外，細(xì)胞內(nèi)存在其他可能影響產(chǎn)品合成的基因或轉(zhuǎn)錄因子。近年來(lái)，合成生物學(xué)者開(kāi)發(fā)基于sRNA、CRISPR/Cas等策略的高通量基因組編輯技術(shù)，為調(diào)控元件的高效挖掘提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。其中，sRNA是細(xì)菌重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，廣泛參與細(xì)菌各方面的調(diào)控功能。通過(guò)模塊化的合成型RNA分子，RNA 介導(dǎo)的調(diào)節(jié)機(jī)制可在全基因組范圍內(nèi)有效篩選靶基因和精細(xì)控制靶基因的表達(dá)水平，優(yōu)化產(chǎn)品的合成。2013 年，Na 等［38］通過(guò)設(shè)計(jì)合成型sRNA，使用含有130 個(gè)sRNA 的文庫(kù)，在大腸桿菌中篩選發(fā)現(xiàn)murE基因的抑制可使得1，5-戊二胺的產(chǎn)量提高55%。2017 年，Noh 等［39］開(kāi)發(fā)了通過(guò)調(diào)節(jié)合成型sRNA 表達(dá)水平微調(diào)基因表達(dá)水平的敲低系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)75 個(gè)合成型sRNA-啟動(dòng)子組合的文庫(kù)的篩選，在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)glnA和argF的抑制可有效提高1，4-丁二胺的合成，產(chǎn)量達(dá)42.3g/L，為當(dāng)前以大腸桿菌為宿主發(fā)酵合成1，4-丁二胺的最高水平。以上研究所使用的人工合成型sRNA 微調(diào)靶基因的技術(shù)，同基因敲除策略和其他大規(guī)模靶標(biāo)識(shí)別策略相比，具有操作簡(jiǎn)單、易于實(shí)施、通量高等優(yōu)點(diǎn)，可較好地推廣應(yīng)用于優(yōu)良生產(chǎn)菌株的開(kāi)發(fā)。

此外，細(xì)胞內(nèi)存在眾多的全局轉(zhuǎn)錄因子，如σ因子，這些蛋白質(zhì)控制了細(xì)胞內(nèi)大量基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，如果對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，可能產(chǎn)生多種復(fù)雜表型， 用于人工細(xì)胞工廠的性能優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌合成1，4-丁二胺的過(guò)程中，可引起轉(zhuǎn)錄因子Cya、RpoS、FecI和Fis表達(dá)量的提高，其中胞內(nèi)壓力響應(yīng)RNA 聚合酶σ 因子RpoS 是一種眾所周知的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可控制大腸桿菌中10%以上基因的表達(dá)，通過(guò)對(duì)RpoS 的敲除，可顯著提高大腸桿菌1，4-丁二胺的合成能力［15］。

2.3.4 功能模塊的適配性優(yōu)化

人工細(xì)胞中模塊之間的適配性是細(xì)胞工廠穩(wěn)定發(fā)揮功能的必要因素之一，也是合成生物學(xué)領(lǐng)域要解決的核心關(guān)鍵問(wèn)題之一。不同人工合成功能模塊在同一底盤(pán)生物中的存在，引發(fā)的還原力不平衡、中間代謝物積累、前體供給不足等不適配問(wèn)題常導(dǎo)致生物基產(chǎn)品合成效率低下，是合生生物學(xué)研究的主要困難。采用系統(tǒng)代謝工程策略，通過(guò)解析影響細(xì)胞工廠效率的關(guān)鍵代謝機(jī)制，將多種輔助生物模塊，如底物轉(zhuǎn)運(yùn)模塊、產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)模塊、輔因子轉(zhuǎn)變模塊等與產(chǎn)品合成模塊在細(xì)胞中進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，是解決代謝途徑的適配性問(wèn)題、提高細(xì)胞工廠性能的有效手段。

（1）輔因子模塊 DDC、ODC、ADC 和LDC均為依賴于5-磷酸吡哆醛（PLP）的脫羧酶［40］。PLP的高效供給是維持脫羧酶活力的必要因素，顯著影響二元胺的合成效率。當(dāng)前，已鑒定獲得兩條PLP 的從頭合成途徑［41-42］：一條是由7 步酶催化組成的5-磷酸脫氧木酮糖途徑［43］；另一條為5-磷酸核糖途徑，由PdxST 復(fù)合體催化［44］。在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)天然5-磷酸脫氧木酮糖途徑中的關(guān)鍵基因或組裝異源的5-磷酸核糖途徑均可有效增強(qiáng)胞內(nèi)PLP 的合成［45］。在產(chǎn)1，5-戊二胺的大腸桿菌中，南京工業(yè)大學(xué)的Chen等［46］通過(guò)在大腸桿菌中組裝異源的5-磷酸核糖途徑增強(qiáng)PLP的供給，使得1，5-戊二胺的合成提高了2.9倍。

賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸、精氨酸等堿性氨基酸的合成途徑依賴于ATP 和NAD（P）H，如每合成1 分子的賴氨酸，需要消耗2 分子的ATP 和4 分子的NADPH。ATP 和NAD（P）H 輔因子模塊的適配性調(diào)控有利于二元胺的生物合成。在1，4-丁二胺合成過(guò)程中，Li 等［9］發(fā)現(xiàn)抑制胞內(nèi)ATP 消耗的酶（CarB、XylB、AccDA、PurL、CoaA、PknG 和PanC2） 和NADPH 消 耗 的 酶（Dxr、 AroE 和TrxB） 增強(qiáng)胞內(nèi)ATP 和NADPH 的供給可顯著增加1，4-丁二胺的合成。在產(chǎn)1，3-丙二胺的大腸桿菌中，通過(guò)增強(qiáng)胞內(nèi)NADPH 的供給，同時(shí)增強(qiáng)胞內(nèi)前體天冬氨酸的合成，1，3-丙二胺的最終產(chǎn)量達(dá)13.0 g/L［13］。

（2）物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)模塊 當(dāng)前，通過(guò)調(diào)控物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)模塊增強(qiáng)二元胺生產(chǎn)的研究主要集中在1，5-戊二胺和1，4-丁二胺的生物合成。南京工業(yè)大學(xué)Chen 等通過(guò)在大腸桿菌中調(diào)控賴氨酸/1，5-戊二胺反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CadB 的表達(dá)，采用全細(xì)胞催化工藝，使得以賴氨酸為底物的1，5-戊二胺產(chǎn)量達(dá)221g/L［5］。在產(chǎn)1，5-戊二胺的工程谷氨酸棒狀桿菌，通過(guò)異源表達(dá)大腸桿菌中的CadB 轉(zhuǎn)運(yùn)模塊，使得1，5-戊二胺的產(chǎn)量提高了30%［47］。Kind 等［48］采用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，在組裝了1，5-戊二胺合成途徑的谷氨酸棒狀桿菌中鑒定獲得了與1，5-戊二胺分泌相關(guān)的通透酶cg2893，該元件的過(guò)表達(dá)使得菌株1，5-戊二胺的產(chǎn)量提高了20%；進(jìn)一步通過(guò)敲除賴氨酸外排蛋白NCgl1469 和LysE， 獲得工程菌株Corynebacterium glutamicumDAP-16，在葡萄糖分批補(bǔ)料發(fā)酵策略下，1，5-戊二胺產(chǎn)量達(dá)88 g/L［49］。Nguyen 等［18］通過(guò)轉(zhuǎn)錄組解析，同樣發(fā)現(xiàn)了谷氨酸棒狀桿菌中與1，4-丁二胺分泌相關(guān)的基因cgmA，該基因的過(guò)表達(dá)使得1，4-丁二胺的產(chǎn)量提高了24%。Li等同樣通過(guò)過(guò)表達(dá)cgmA 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并系統(tǒng)集成前體合成模塊和OdhA 調(diào)控模塊的強(qiáng)度優(yōu)化，使得1，4-丁二胺的產(chǎn)量達(dá)12.4 g/L［30］。以上研究證實(shí)了物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，尤其是產(chǎn)品外排模塊對(duì)提高產(chǎn)品合成的關(guān)鍵作用，然而當(dāng)前有關(guān)二元胺的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)研究較少，尤其是對(duì)于谷氨酸棒狀桿菌，進(jìn)一步挖掘同產(chǎn)品轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的元件，對(duì)優(yōu)化工程細(xì)胞的性能至關(guān)重要。

基于以上研究，在構(gòu)建二元胺工程菌株的研究工作中，大多采用過(guò)表達(dá)或異源表達(dá)關(guān)鍵功能元件脫羧酶組裝二元胺合成途徑，進(jìn)而通過(guò)增強(qiáng)前體合成模塊的代謝水平以及改造底盤(pán)細(xì)胞使之缺失對(duì)產(chǎn)品的利用和降解的能力的策略獲得工程細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上，基于高通量的元件解析和篩選技術(shù)，組裝獲得了一系列同物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞調(diào)控、輔因子合成等相關(guān)的功能模塊，通過(guò)模塊間的適配性調(diào)控和系統(tǒng)集成，進(jìn)一步提高了二元胺工程細(xì)胞的產(chǎn)品合成性能。

同時(shí)，當(dāng)前以大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌為宿主均開(kāi)展了許多二元胺的途徑構(gòu)建和合成研究。其中大腸桿菌遺傳背景清晰，易于改造，且細(xì)胞內(nèi)二元胺合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)控等元件的研究較為成熟，是研究二元胺合成調(diào)控機(jī)制的理想宿主之一，可為二元胺在其他宿主中的改造提供指導(dǎo)。然而大腸桿菌存在氨基酸前體產(chǎn)量低、對(duì)二元胺耐受性低等問(wèn)題，而谷氨酸棒狀桿菌是天然的氨基酸高產(chǎn)菌株，且對(duì)二元胺具有較高的耐受性，盡管其缺乏二元胺的天然合成途徑，基于上述系統(tǒng)生物解析和合成生物技術(shù)改造，可較好實(shí)現(xiàn)二元胺在谷氨酸棒狀桿菌中的高效生產(chǎn)，被認(rèn)為是合成二元胺的理想宿主?；谝陨涎芯?，如表1 所示，重組菌株發(fā)酵合成1，5-戊二胺的最高產(chǎn)量達(dá)103.78g/L［36］，1，4-丁二胺達(dá)42.3g/L［39］，1，3-丙二胺達(dá)13.06g/L［13］，以上工作為生物基二元胺的產(chǎn)業(yè)化制備奠定了基礎(chǔ)。

表1 不同宿主合成C3～C5脂肪族二元胺最高水平對(duì)比Tab.1 The highest production level of aliphatic diamines with 3～5 carbon atoms by different hosts

3 以非糧生物質(zhì)為原料的生物基二元胺合成

第一代生物煉制以“糧食作物生物質(zhì)”為原料，存在“與人爭(zhēng)糧、與糧爭(zhēng)地”等問(wèn)題，隨著糧食危機(jī)日益加劇以及糧食價(jià)格不斷攀升，以糧食為原料的生物制造正面臨嚴(yán)峻考驗(yàn)。為推進(jìn)生物制造的可持續(xù)發(fā)展，提高生物制造的競(jìng)爭(zhēng)力，當(dāng)前生物煉制已步入第二代以木質(zhì)纖維素原料為代表的“非糧生物質(zhì)”時(shí)代。利用合成生物學(xué)技術(shù)，開(kāi)發(fā)以木質(zhì)纖維素、粗甘油等非糧生物質(zhì)為原料的二元胺生產(chǎn)菌株（圖3），對(duì)推動(dòng)生物基二元胺的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

圖3 以非糧生物質(zhì)為原料的生物基二元胺合成［50-58］Fig.3 The biosynthesis of aliphatic diamines with non-food feedstock

3.1 利用木糖合成二元胺

木糖是木質(zhì)纖維素原料中含量?jī)H次于葡萄糖的單糖，含量約為18%～30%［50］，因此，開(kāi)發(fā)和研究菌株高效利用木糖轉(zhuǎn)化合成二元胺的技術(shù)，是實(shí)現(xiàn)以木質(zhì)纖維素為原料產(chǎn)業(yè)化制備二元胺的必要條件。野生型的谷氨酸棒狀桿菌無(wú)法直接利用木糖作為發(fā)酵底物，當(dāng)前通過(guò)在谷氨酸棒狀桿菌中組裝和優(yōu)化木糖利用途徑，已實(shí)現(xiàn)1，5-戊二胺、1，4-丁二胺的生物合成。在已發(fā)現(xiàn)的4 種木糖代謝途徑中［51］，木糖異構(gòu)酶（XI）途徑被廣泛用于谷氨酸棒狀桿菌的木糖代謝改造。例如通過(guò)在產(chǎn)1，4-丁二胺谷氨酸棒狀桿菌中組裝XI 途徑，并對(duì)不同來(lái)源的木糖異構(gòu)酶XylA 進(jìn)行篩選，重組谷氨酸棒狀桿菌代謝木糖合成1，4-丁二胺的產(chǎn)量由2.9mmol/L 增加到15.1mmol/L，同時(shí)以稻草秸稈水解液為發(fā)酵原料，成功檢測(cè)到1，4-丁二胺的合成［52］。在產(chǎn)1，5-戊二胺的谷氨酸棒狀桿菌中，通過(guò)組裝來(lái)源于E. coli的XI 途徑［53］，進(jìn)一步基于C13代謝通量分析和轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析獲得了影響木糖高效利用合成1，5-戊二胺的關(guān)鍵，通過(guò)系統(tǒng)改造磷酸戊糖途徑（PPP）、TCA 循環(huán)途徑、賴氨酸分泌蛋白LysE 以及1，5-戊二胺乙?；緩?，獲得的重組谷氨酸棒狀桿菌DAP-Xyl1icdGTG Peftu fbp Psod tktΔactΔlysE代謝木糖合成1，5-戊二胺的產(chǎn)量提高了54%，達(dá)103 g/L，轉(zhuǎn)化率（以物質(zhì)的量計(jì)）達(dá)32%，具有較好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值［54］。

3.2 利用粗甘油合成二元胺

粗甘油是生物柴油和生物乙醇生產(chǎn)過(guò)程中不可避免的副產(chǎn)物，每年產(chǎn)生約6 億噸［55］。鑒于粗甘油產(chǎn)量大、成本低等特點(diǎn)，被認(rèn)為是大規(guī)模生物生產(chǎn)過(guò)程中的理想原料［56-57］。大腸桿菌天然具有甘油代謝途徑，然而當(dāng)前以大腸桿菌為宿主利用甘油生物轉(zhuǎn)化合成二元胺的研究鮮有報(bào)道。谷氨酸棒桿菌同樣具有天然的甘油代謝途徑，然而內(nèi)源甘油利用途徑中的關(guān)鍵酶甘油激酶（GlpK）和3-磷酸甘油脫氫酶（GlpD）活性低，增加基因表達(dá)強(qiáng)度僅允許谷氨酸棒桿菌以甘油為碳源的緩慢生長(zhǎng)。通過(guò)在谷氨酸棒狀桿菌中組裝大腸桿菌來(lái)源的甘油代謝途徑，重組菌株可以快速利用甘油進(jìn)行生長(zhǎng)，且成功制備獲得4.7mmol/L 的1，4-丁二胺［58］。

4 生物基二元胺合成過(guò)程中CO2的原位固定

由生物脫羧催化合成二元胺的生產(chǎn)過(guò)程伴隨著大量CO2的釋放，如每生產(chǎn)1 t 1，5-戊二胺產(chǎn)生0.43t CO2。CO2的釋放不僅大大降低了產(chǎn)品的原子經(jīng)濟(jì)性，同時(shí)增加了溫室氣體的排放。南京工業(yè)大學(xué)Chen等［59］針對(duì)1，5-戊二胺合成過(guò)程中的脫羧CO2排放問(wèn)題，通過(guò)構(gòu)建由丁二酸合成菌和1，5-戊二胺合成菌組成的人工多細(xì)胞體系，實(shí)現(xiàn)了賴氨酸脫羧反應(yīng)釋放CO2的固定用于丁二酸的合成，減少了CO2排放，同時(shí)該耦合體系利用產(chǎn)物1，5-戊二胺與丁二酸自身的酸堿特性互為酸堿中和劑，整個(gè)過(guò)程中實(shí)現(xiàn)酸堿的零添加；且可一步發(fā)酵合成1，5-戊二胺丁二酸鹽，用于PA54 的合成。人工合成的微生物多細(xì)胞體系已成功應(yīng)用于醫(yī)藥、能源、材料等生物基產(chǎn)品的高效合成中，上述研究通過(guò)人工多細(xì)胞體系的構(gòu)建實(shí)現(xiàn)CO2的再循環(huán)，為提高生物基二元胺合成過(guò)程的原子經(jīng)濟(jì)性提供了新思路。

此外，利用合成生物學(xué)技術(shù)，在產(chǎn)品合成菌株中增強(qiáng)或重構(gòu)CO2固定途徑，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品合成過(guò)程中CO2的再循環(huán)利用，減少溫室氣體排放，是有效提高生物基產(chǎn)品合成過(guò)程原子經(jīng)濟(jì)性的策略之一，近年來(lái)受到研究者的廣泛關(guān)注（圖4）。當(dāng)前，已發(fā)現(xiàn)6 個(gè)天然的CO2固定途徑，包括卡爾文循環(huán)、Wood-Ljungdahl 途徑、還原性TCA 循環(huán)途徑、3-羥基丙酸雙循環(huán)、二羧酸/4-羥基丁酸循環(huán)和3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環(huán)［60］。研究者們通過(guò)在異養(yǎng)模式微生物中組裝和調(diào)控CO2固定途徑，成功實(shí)現(xiàn)了CO2的再循環(huán)利用。例如，通過(guò)在釀酒酵母異源表達(dá)卡爾文循環(huán)的關(guān)鍵酶1，5-二磷酸核酮糖羧化酶（RuBisCO） 和磷酸核酮糖激酶（PRK），成功實(shí)現(xiàn)了生物乙醇生產(chǎn)過(guò)程中CO2的原位固定，乙醇產(chǎn)量提高了10%，副產(chǎn)物甘油產(chǎn)量降低了90%［61］；通過(guò)在大腸桿菌中異源表達(dá)RuBisCO 和PRK，同時(shí)與ATP再生途徑相結(jié)合，使得蘋(píng)果酸的產(chǎn)量提高了387mmol/L［62］。證實(shí)了通過(guò)合成生物學(xué)手段實(shí)現(xiàn)CO2原位固定改善化學(xué)品生產(chǎn)的巨大潛力，為提高生物基二元胺合成過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性，發(fā)展綠色、低碳的生物基二元胺生產(chǎn)模式提供了借鑒。

圖4 生物基二元胺合成過(guò)程CO2的原位固定Fig.4 The in situ fixation of CO2 during the synthesis of bio-based diamines

5 展 望

脂肪族二元胺作為重要的材料單體，可用于聚酰胺和聚氨酯的合成，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和工業(yè)等領(lǐng)域。在以上的研究中，通過(guò)一系列的合成生物技術(shù)，如調(diào)控元件和功能元件的挖掘、設(shè)計(jì)與優(yōu)化、模塊的系統(tǒng)系統(tǒng)與適配性優(yōu)化、發(fā)酵原料的途徑構(gòu)建等工程策略，初步實(shí)現(xiàn)了1，3-丙二胺、1，4-丁二胺、1，5-戊二胺等產(chǎn)品的發(fā)酵制備，然而重組菌株仍存在產(chǎn)率較低的問(wèn)題，無(wú)法滿足工業(yè)化需求。在未來(lái)的研究工作中如何提高工程菌株的產(chǎn)品合成能力和生物反應(yīng)過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性，是推進(jìn)生物基二元胺產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。

二元胺對(duì)細(xì)胞具有毒性，其在發(fā)酵培養(yǎng)基中的過(guò)量積累會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制并限制了最終產(chǎn)品的合成。例如大腸桿菌在40.4g/L 1，5-戊二胺存在時(shí)生長(zhǎng)速率下降35%［63］。谷氨酸棒狀桿菌在102g/L 的1，5-戊二胺濃度下生長(zhǎng)速率下降約67%［64］，在66g/L 的1，4-丁二胺條件下生產(chǎn)速率下降34%［10］。然而當(dāng)前對(duì)二元胺抑制機(jī)理的深入研究較少，僅在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)1，5-戊二胺的積累可能會(huì)誘導(dǎo)孔蛋白的閉合，從而引起細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收不足，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝。而對(duì)于谷氨酸棒狀桿菌，二元胺屬于非天然產(chǎn)物，其抑制機(jī)制研究尚未涉及。因此，明確1，5-戊二胺抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的機(jī)制，發(fā)掘相關(guān)抗逆元件，提高底盤(pán)細(xì)胞的二元胺耐受性是亟需解決的問(wèn)題。

降低生物基二元胺生產(chǎn)過(guò)程中脫羧CO2的排放，實(shí)現(xiàn)CO2的再循環(huán)利用也是該領(lǐng)域未來(lái)所面臨的重大挑戰(zhàn)。CO2處于高度氧化的狀態(tài)，將CO2生物轉(zhuǎn)化為有機(jī)代謝產(chǎn)物的過(guò)程需要大量的能量，包括ATP 和NAD（P）H［60］。天然固碳途徑較低的酶催化效率、較高的能量需求以及氧氣敏感性等特點(diǎn)，目前不能滿足工業(yè)化的要求，限制了天然固碳途徑在改善產(chǎn)品合成中的應(yīng)用。近年來(lái)，研究者們利用合成生物學(xué)技術(shù)，一方面通過(guò)挖掘、設(shè)計(jì)和改造新的功能元件，提高天然固碳途徑的反應(yīng)效率，一方面人工設(shè)計(jì)合成多條低耗高效的固碳途徑，包括丙酮酸合成酶-丙酮酸羧化酶-乙醛酸（PPG）循環(huán)、丙二酰輔酶A-草酰乙酸-乙醛酸（MOG）循環(huán)、丁烯酰輔酶A-乙基丙二酰輔酶A-羥基丁酰輔酶A（CETCH） 循環(huán)以及還原性甘氨酸途徑（rGly）［65-66］，為突破天然固碳途徑的效率瓶頸提供了可能。此外，納米微反應(yīng)器［67］、分子支架［68］、多酶組裝［69］等新的技術(shù)不斷涌現(xiàn)，為CO2循環(huán)利用效率的優(yōu)化提供了新的啟發(fā)。在部分自養(yǎng)菌中，存在一種基于碳酐酶（CA）和羧酶體微區(qū)室結(jié)構(gòu)的CO2捕獲和濃縮系統(tǒng)［70］，在較低CO2濃度的環(huán)境中，可以高效捕獲胞外的CO2，胞內(nèi)羧酶體中CO2濃度是胞外環(huán)境中CO2濃度的近千倍［71］，從而通過(guò)增加固碳酶周圍的CO2濃度提高CO2固定效率。因此，如果將這些自養(yǎng)微生物中的固碳機(jī)制加以開(kāi)發(fā)利用，在二元胺生產(chǎn)菌株將脫羧酶和CO2固定酶限制在亞細(xì)胞空間，構(gòu)建CO2原位固定的納米微反應(yīng)器，或利用分子支架以及多酶組裝技術(shù)，實(shí)現(xiàn)脫羧酶和固碳酶的共定位，有望提高二元胺合成過(guò)程中CO2的原位固定效率，增強(qiáng)二元胺合成過(guò)程的原子經(jīng)濟(jì)性。

合成生物學(xué)的快速發(fā)展，為設(shè)計(jì)構(gòu)建高效的二元胺合成細(xì)胞工廠提供了可能，通過(guò)對(duì)底盤(pán)細(xì)胞的基因組改造和性能強(qiáng)化、對(duì)高效調(diào)控元件和結(jié)構(gòu)元件的挖掘和改造、對(duì)二元胺合成代謝途徑的再設(shè)計(jì)和優(yōu)化，對(duì)胞內(nèi)代謝調(diào)控機(jī)制的解析和模塊的適配性調(diào)節(jié)等手段，合成生物技術(shù)有望創(chuàng)造出高效的二元胺合成人工細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)綠色、低碳、高效的二元胺生物制造，推動(dòng)生物基高分子材料領(lǐng)域的發(fā)展。