丁明珠，李炳志，王穎，謝澤雄，劉奪，元英進(jìn)

（教育部合成生物學(xué)前沿科學(xué)中心，系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072）

合成生物學(xué)是指在工程學(xué)思想指導(dǎo)下，按照特定目標(biāo)理性設(shè)計、改造乃至從頭重新合成生物體系，即生物學(xué)的工程化。合成生物學(xué)的出現(xiàn)是多學(xué)科交叉發(fā)展的必然。從DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)與遺傳中心法則的闡明開始，到大規(guī)模測序技術(shù)推動下越來越多基因組遺傳信息的解讀，人們對生物功能與基因和基因組關(guān)系的理解逐漸深刻。工程學(xué)思想的引入加速了生物學(xué)、生物信息學(xué)、計算機(jī)科學(xué)、化學(xué)、材料學(xué)等多學(xué)科的交叉融合，推動了生物學(xué)的工程化從模塊化、定量化、標(biāo)準(zhǔn)化、通用性等角度系統(tǒng)展開，形成了合成生物學(xué)的研究領(lǐng)域。

DNA 的人工合成是合成生物學(xué)研究的底層推動技術(shù)。DNA 化學(xué)合成法是當(dāng)前主流的商業(yè)化合成方法，在合成長度和合成通量上不斷取得突破，發(fā)展出柱式合成和芯片合成工藝，使寡核苷酸鏈合成通量可以達(dá)到百萬條級，合成成本降低約3 個數(shù)量級［1］。近年來，DNA 酶促合成法日益受到關(guān)注，利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）在溫和的條件進(jìn)行寡核苷酸鏈的合成，有望推動DNA 合成技術(shù)的再次升級［2］。隨著DNA 合成技術(shù)的快速發(fā)展，合成生物學(xué)在多個研究方向不斷取得突破。本文將對基因回路、基因組設(shè)計合成、細(xì)胞工廠和人工多細(xì)胞體系的重要研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對合成生物學(xué)與其他學(xué)科交叉融合產(chǎn)生的一些新研究方向進(jìn)行簡介。

1 基因回路

基因回路是由調(diào)控元件和被調(diào)控的基因構(gòu)成的特定邏輯關(guān)系，以實現(xiàn)所設(shè)計的預(yù)期功能?！半p穩(wěn)態(tài)開關(guān)”（Toggle switch）基因回路及“自激振蕩網(wǎng)絡(luò)”（Oscillatory network）基因回路的研究開啟了這一合成生物學(xué)基礎(chǔ)研究分支［3-4］?；蚧芈吠梃b電器回路的邏輯控制概念，與底盤細(xì)胞基因網(wǎng)絡(luò)形成一定程度的正交關(guān)系，其未來的一個重要發(fā)展方向是構(gòu)建“生物計算機(jī)”的“編程與控制”系統(tǒng)?；蚧芈返囊赜校簶?biāo)準(zhǔn)化的基因元件庫、多基因之間的調(diào)控邏輯、調(diào)諧與降噪等回路整體的維護(hù)，最終實現(xiàn)由簡單到復(fù)雜的目標(biāo)功能（圖1）。由基因回路組裝更大規(guī)模的網(wǎng)絡(luò)時，對模塊化封裝提出需求。此外，當(dāng)搭載基因回路的個體細(xì)胞以群體形式執(zhí)行功能時，也需要細(xì)胞間能夠通訊、互作、分工。

1.1 標(biāo)準(zhǔn)化的基因元件庫

基因元件是控制基因轉(zhuǎn)錄與翻譯過程的生物分子及其對應(yīng)的DNA 序列，如啟動子、終止子、阻遏蛋白、轉(zhuǎn)錄激活序列、RNA 發(fā)夾結(jié)構(gòu)、重組酶等。元件在回路中的邏輯作用可分為帶有閾值的開啟或激活邏輯以及關(guān)閉或抑制邏輯。在常用微生物模式底盤中，已實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的元件庫及元件之間的拼裝方法［5-6］?；趦?nèi)切酶產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)化的黏性末端，再由這些末端進(jìn)行精確識別，在連接酶的作用下將元件拼裝在一起，依據(jù)這個原理相繼開發(fā)出了Biobrick［7］、Bglbrick［8］、yGG［9］、MoClo［10］等元件庫及拼裝技術(shù)流程。針對元件序列內(nèi)部也建立了分塊設(shè)計方案，用于微調(diào)基因的表達(dá)。原核啟動子的Sigma 轉(zhuǎn)錄因子、AT 富含區(qū)、核糖體結(jié)合的SD序列等，以及真核啟動子的轉(zhuǎn)錄激活位點、TATA 框、轉(zhuǎn)錄起始位點等，均可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)計［11-12］。此外，由信號分子控制的指定蛋白與操縱子位點結(jié)合［13］以及T7 RNA 聚合酶［14-15］則在原核與真核細(xì)胞中都能使用，具有通用性特征。此外，在哺乳動物等高等生物中也已成功開發(fā)出調(diào)控作用元件，例如：利用3 種絕緣子可對6

種啟動子進(jìn)行交叉調(diào)節(jié)［16］。

圖1 基因回路的組成Fig.1 Components of gene circuits

1.2 基因間的調(diào)控邏輯與基因回路調(diào)諧降噪

基因回路最常用的調(diào)控邏輯參考電器元件中的“開關(guān)”與“邏輯門”?；蜷_關(guān)包含多種形式，如能在兩個基因表達(dá)穩(wěn)態(tài)之間切換的雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)［4］、能被特定化學(xué)小分子誘導(dǎo)開啟的核糖開關(guān)［17］、能由RNA變構(gòu)進(jìn)行控制的RNA開關(guān)［18］等。對于基因邏輯門，可在單個細(xì)胞中建立轉(zhuǎn)錄級聯(lián)控制的分層邏輯門［19］，也可利用重組酶的通用特性建立16種“2輸入1輸出型”布爾邏輯門［20］?；蜷_關(guān)與邏輯門的開發(fā)增強(qiáng)了細(xì)胞選擇與執(zhí)行復(fù)雜行為的能力。

基因回路需要對多個基因表達(dá)進(jìn)行精細(xì)控制，才能實現(xiàn)整體的精細(xì)功能。利用降解標(biāo)簽來控制元件的蛋白質(zhì)降解時間，可以設(shè)計構(gòu)建出頻率與振幅均可自由調(diào)控的振蕩器裝置［21］。利用邏輯“非門”檢查細(xì)胞對時序邏輯的執(zhí)行，從而達(dá)到回路時序控制［22］。通過構(gòu)建“長壽命基因時鐘”，可延長基因回路在細(xì)胞中發(fā)揮功能的時間，實現(xiàn)回路的時限控制［23］。通過調(diào)控元件生物分子的降解速率，可將振蕩器振蕩周期的標(biāo)準(zhǔn)差從35%降低到14%，達(dá)到回路降噪的目的［24］。

1.3 基因回路的模塊化封裝與細(xì)胞間互作

當(dāng)不同的基因回路組成更加復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)時，需要對回路進(jìn)行一定程度的模塊化封裝。利用正交化-模塊化病毒蛋白酶可對靶蛋白進(jìn)行對接與切割，實現(xiàn)了8種二進(jìn)制邏輯門和動態(tài)模擬信號處理等封裝功能［25］。將基因回路包裹在脂質(zhì)體小滴中，添加基因表達(dá)所需工具酶等組分，可控制各回路獨立工作與產(chǎn)物交流［26］。為了對基因回路的設(shè)計進(jìn)行加密，可分別建立“加密回路拓?fù)洹迸c“模糊化回路連接”策略，使得未經(jīng)授權(quán)則難以確定回路結(jié)構(gòu)和功能［27］。

搭載回路的多個細(xì)胞組成的細(xì)胞群可構(gòu)成協(xié)同、競爭等不同的群體關(guān)系?！叭后w感應(yīng)”基因回路已從原核細(xì)胞拓展到真核細(xì)胞中［28-29］。基因回路控制的亞細(xì)胞群可形成“捕食者”關(guān)系模型［30］、細(xì)胞“熒光條紋分布”模型［31］等。通過建立大腸桿菌菌斑之間的通訊，可構(gòu)建所有雙輸入布爾邏輯門［32］。通過混養(yǎng)搭載不同基因回路的酵母細(xì)胞亞群，可實現(xiàn)多路選擇器和進(jìn)位加法器的邏輯運算［33］。個體細(xì)胞之間也可發(fā)展成可控的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，例如通過建立動物細(xì)胞模塊化分泌信號平臺，可控制細(xì)胞表面鈣黏蛋白的表達(dá)，從而控制多細(xì)胞間的黏附結(jié)合與整體結(jié)構(gòu)［34］。

1.4 基因回路走向應(yīng)用

近年來，基因回路逐步走向生物制造、環(huán)境監(jiān)測、生物安防、醫(yī)療等應(yīng)用領(lǐng)域。最常使用的是成套的“傳感器+開關(guān)/邏輯門”回路，通過感應(yīng)特定變化，細(xì)胞將開啟或關(guān)閉指定功能，或在不同功能間切換。研究者已開發(fā)了響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)特殊代謝物（如脂肪酸［35］、異戊二烯［36］）、響應(yīng)輔酶及輔因子［37］等的傳感器開關(guān)，用于大幅提升目標(biāo)生物制品的產(chǎn)量?；蚧芈房捎糜谏?、汞等環(huán)境毒性物質(zhì)的檢測，提升其檢測靈敏度，降低環(huán)境有害污染物的監(jiān)測成本［38-39］。越來越多的攜帶基因回路的微生物被實際應(yīng)用，防逃逸回路的開發(fā)非常必要?？衫猛饧有》肿涌刂坪颂情_關(guān)和核酸酶元件，控制大腸桿菌的生存［40］，也可設(shè)計特定的“死亡回路”和“密碼”來控制細(xì)菌的死亡［41］。在醫(yī)療領(lǐng)域，基因回路在嵌合抗原受體T 細(xì)胞（CAR-T）治療中發(fā)揮了重要作用。由鼠Notch 跨膜受體改造而成的工程化SynNotch 受體，可使T細(xì)胞只有先后識別兩種特異性抗原時才被激活；基于SynNotch的邏輯“與門”，也可利用腫瘤抗原和特定小分子藥物作為輸入端，有效降低IL-12 等細(xì)胞因子風(fēng)暴［42-43］。通過設(shè)計可攝入的微生物電子設(shè)備，可對生物分子進(jìn)行原位檢測，例如利用血紅素敏感的益生菌傳感器診斷豬胃腸道出血的發(fā)生［44］。傳感型基因回路在糖尿病治療中也可發(fā)揮作用，例如：利用智能手機(jī)遠(yuǎn)程控制小鼠中特定基因表達(dá)，以及用咖啡因小分子誘導(dǎo)控制小鼠細(xì)胞生成治療Ⅱ型糖尿病的多肽，從而調(diào)節(jié)血糖水平［45］。此外，利用哺乳動物細(xì)胞振蕩器回路控制基因周期性表達(dá)也逐步走向治療應(yīng)用［46-47］。

基因回路發(fā)展的高階目標(biāo)是實現(xiàn)生命功能的程序化控制。根據(jù)目標(biāo)需求，合理設(shè)計并組合使用基因回路，可使細(xì)胞編程更加精細(xì)化，逐步實現(xiàn)預(yù)設(shè)合成生物功能的高度可控甚至完全可控。

2 人工基因組設(shè)計合成

2010 年，Synthia 細(xì)胞的自我復(fù)制標(biāo)志著人工合成基因組實現(xiàn)了對生命活動的調(diào)控，突破了化學(xué)物質(zhì)和活性基因組的界限［48］。人工基因組合成是關(guān)于理性設(shè)計和重新合成生命的研究，即在工程學(xué)思想的指導(dǎo)下，借助計算機(jī)模擬，模塊化設(shè)計具有特定功能的人工基因組，利用DNA 從頭合成和模塊化組裝技術(shù)，將人工設(shè)計基因組構(gòu)建出來，并使其實現(xiàn)預(yù)期功能。

近年來，人工基因組合成取得了一系列重大突破。最小化基因組的理性合成顛覆了簡化生命體的傳統(tǒng)策略，使我們對人工細(xì)胞在特定環(huán)境下的行為和功能機(jī)制的理解更加深入［49］。密碼子轉(zhuǎn)換和非天然氨基酸技術(shù)的應(yīng)用實現(xiàn)了正交化生命體的創(chuàng)建，拓展了生命進(jìn)化方向和生命存在形式的可能性［50-51］。人工基因組合成的發(fā)展內(nèi)容主要包括DNA 片段高效組裝和迭代替換、基因組精簡與遺傳密碼擴(kuò)展、遺傳系統(tǒng)可控進(jìn)化等，最終實現(xiàn)人工細(xì)胞性能的定向優(yōu)化（圖2）。

圖2 人工基因組的設(shè)計、合成與應(yīng)用Fig.2 Design,synthesis and application of synthetic genome

2.1 DNA片段高效組裝和迭代替換

人工基因組的長度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了普通DNA 化學(xué)合成的長度范圍，需要通過標(biāo)準(zhǔn)化DNA 元件的逐級組裝技術(shù)來實現(xiàn)。根據(jù)組裝原理不同，可將DNA元件組裝技術(shù)分為酶促體外組裝（基于DNA 聚合酶、核酸內(nèi)切酶或核酸外切酶）、非酶促體外組裝和體內(nèi)組裝（基于DNA 同源重組或位點特異性重組）。酶促體外組裝和體內(nèi)組裝技術(shù)已應(yīng)用于支原體、大腸桿菌和釀酒酵母的人工基因組合成，推動了組裝大片段DNA（kb至Mb級）的發(fā)展［48，51-53］。

隨后，標(biāo)準(zhǔn)化DNA 元件在細(xì)胞內(nèi)對天然基因組進(jìn)行迭代替換，直至獲得完整人工基因組。位點特異性重組和同源重組技術(shù)分別應(yīng)用于原核和真核基因組的迭代替換，同時基因編輯技術(shù)大幅提高DNA迭代替換的效率［50-51］。為進(jìn)一步加速人工基因組合成的速度，不同的DNA 元件分別在多個細(xì)胞中進(jìn)行迭代替換，通過細(xì)胞融合進(jìn)行基因組的轉(zhuǎn)移，快速獲得具有完整活性的人工基因組［50-51，53-58］。

2.2 基因組精簡與密碼子擴(kuò)展

人工基因組合成能力的提升推動了基因組設(shè)計深度的擴(kuò)展，可以進(jìn)行復(fù)雜遺傳信息的精簡，重塑細(xì)胞生命活動?；蚪M精簡的研究在支原體、大腸桿菌和釀酒酵母等多個物種中展開，主要策略包括非必需基因精簡、遺傳元件的移除或移位、密碼子的簡化等。在最小支原體基因組的構(gòu)建中，精簡了大量非必需基因和半必需基因，獲得的最小支原體基因組長度縮減50%，僅由473 個基因組成［49］。在釀酒酵母人工基因組Sc2.0的設(shè)計中，刪除了轉(zhuǎn)座序列、內(nèi)含子、亞端粒等遺傳元件，對tRNA 基因進(jìn)行重新定位，人工酵母基因組序列精簡了6%［54，59］。基因組合成可以實現(xiàn)全基因組序列的密碼子轉(zhuǎn)換，已實現(xiàn)大腸桿菌基因組1.8 萬個靶標(biāo)密碼子的轉(zhuǎn)換，精簡了絲氨酸密碼子TCG、TCA 和終止密碼子TAG，構(gòu)建了僅有61 個遺傳密碼的人工大腸桿菌［51］?；蚓庉嬕蕴烊坏纳锘蚪M為藍(lán)本，可以修飾和改造特定位點的DNA 序列，已實現(xiàn)對大腸桿菌基因組314 個TAG 終止密碼子的轉(zhuǎn)換［60］。隨著基因編輯效率的提高、脫靶效應(yīng)的降低和新方法的不斷更新，尤其是堿基編輯器技術(shù)的發(fā)展，可進(jìn)行密碼子轉(zhuǎn)換的基因組DNA 序列區(qū)域不斷擴(kuò)大，基因編輯將推動基因組設(shè)計與合成的快速發(fā)展［61-63］。

2.3 遺傳系統(tǒng)進(jìn)化和演化

人工基因組合成研究顯著提升了獲得基因組變異的能力，可以為人工細(xì)胞進(jìn)化和演化提供驅(qū)動力，為深入探索系統(tǒng)進(jìn)化和物種演化的分子機(jī)制提供了新的平臺。人工基因組的進(jìn)化和演化在原核和真核細(xì)胞中開展，主要包括重疊基因的重構(gòu)、基因組誘導(dǎo)重排等。人工大腸桿菌基因組中79 個重疊基因的重構(gòu)，實現(xiàn)了基因重疊區(qū)域的獨立轉(zhuǎn)錄［51］，探究了基因編碼元件交替分布排列的演化特征。人工酵母基因組的誘導(dǎo)重排研究，揭示了特殊環(huán)境下的基因組變異規(guī)律和適應(yīng)性演化機(jī)制；并利用該技術(shù)開展高產(chǎn)植物源化合物的人工酵母底盤細(xì)胞構(gòu)建和功能基因組研究，提升胡蘿卜素產(chǎn)量38.8 倍，發(fā)現(xiàn)決定重要性狀的關(guān)鍵基因，闡明基因表達(dá)調(diào)控、代謝調(diào)節(jié)等網(wǎng)絡(luò)的組成和變化［53，64-65］。

人工基因組合成的長遠(yuǎn)目標(biāo)是理性設(shè)計基因組序列，工程化構(gòu)建生物遺傳系統(tǒng)，定制細(xì)胞功能。這需要深度融合生物信息、大規(guī)模數(shù)據(jù)、數(shù)理科學(xué)、化學(xué)、計算機(jī)科學(xué)等知識，跨尺度地研究基因組與細(xì)胞不同組分的互作機(jī)制，揭示細(xì)胞內(nèi)整體生命活動規(guī)律。

3 細(xì)胞工廠的設(shè)計構(gòu)建

構(gòu)建細(xì)胞工廠從頭合成生物基材料單體1，3-丙二醇［66］和重要醫(yī)藥中間體青蒿酸［67-68］，開創(chuàng)了傳統(tǒng)石化產(chǎn)品和天然產(chǎn)物全新的生產(chǎn)模式，可有效解決石油化工煉制和植物提取對自然資源的依賴和對環(huán)境的危害。自此，細(xì)胞工廠的設(shè)計構(gòu)建成為合成生物學(xué)的一個重要研究方向。伴隨著合成生物技術(shù)的進(jìn)步，人們在逐步挑戰(zhàn)代謝途徑更長、復(fù)雜程度更高的化合物合成［圖3（a）］。尤其是近期阿片類藥物［69］和大麻素［70］的從頭合成，展示了構(gòu)建細(xì)胞工廠的巨大潛力。細(xì)胞工廠的設(shè)計構(gòu)建，是通過對復(fù)雜生命體的工程化重構(gòu)，實現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)品的可控和高效合成。其實現(xiàn)過程是在物質(zhì)代謝和能量代謝水平上，反復(fù)進(jìn)行模塊與模塊、模塊與底盤之間的適配［71］。除適配性外，細(xì)胞工廠的發(fā)展趨勢還承襲了模塊化、正交性、魯棒性等工程化特性。

3.1 模塊化

代謝途徑的模塊化是細(xì)胞工廠構(gòu)建的基礎(chǔ)。模塊中的催化元件或來源于對沉默基因簇［72-73］和深度測序數(shù)據(jù)［74-75］的挖掘，或來源于現(xiàn)有酶分子的定向進(jìn)化［76-77］甚至蛋白質(zhì)的從頭設(shè)計［78-81］，以實現(xiàn)自然界中不能催化或難催化的反應(yīng)［82-84］，合成非天然的分子［85-87］，構(gòu)建未見報道的合成路徑［88-89］。在重構(gòu)復(fù)雜長途徑時，采用多元模塊工程［90］，按代謝節(jié)點［90］和元件功能聚類［91］等規(guī)則對途徑進(jìn)行模塊式劃分［圖3（b）］，以降低途徑的復(fù)雜程度。通過建立并優(yōu)化模塊功能［92］、調(diào)整模塊亞細(xì)胞器定位［93］以及調(diào)節(jié)模塊之間的表達(dá)強(qiáng)度［90］，實現(xiàn)模塊與模塊之間的組合設(shè)計和迭代適配。在上述模塊化工程原則的指導(dǎo)下，成功實現(xiàn)阿片類藥物［69］、維生素B12［94］、托品烷生物堿［95］等長途徑的構(gòu)建。

以途徑模塊作為基本調(diào)控單元，通過調(diào)整模塊間表達(dá)強(qiáng)度，并結(jié)合底物通道作用［96］和區(qū)室化作用［97］，可以平衡途徑上下游或競爭性模塊間的代謝流通量，避免代謝中間體和副產(chǎn)物的積累。對模塊的表達(dá)強(qiáng)度調(diào)節(jié)，除進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控外，還可進(jìn)行翻譯及翻譯后水平的調(diào)控。例如在釀酒酵母中通過C-PEST介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解［98］和N-degron 介導(dǎo)的泛素化降解［99］調(diào)控蛋白的半衰期，以調(diào)整代謝流分配［100-101］。

3.2 正交化

細(xì)胞工廠的正交化設(shè)計是指對生產(chǎn)菌株的工程化改造，不干擾底盤原有的代謝和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以減少人工設(shè)計的復(fù)雜性。最初正交化設(shè)計主要針對導(dǎo)入的異源人工元器件，例如轉(zhuǎn)錄因子［102］、核糖體開關(guān)［103］和Cas9 蛋白［104］等，以實現(xiàn)底盤的基因編輯和表達(dá)調(diào)控。目前正交化的概念隨細(xì)胞工廠自下而上的構(gòu)建過程順應(yīng)延伸，逐步擴(kuò)展到對代謝途徑和真核底盤細(xì)胞器的設(shè)計中。

3.2.1 代謝途徑與底盤的相對正交化

圖3 細(xì)胞工廠的設(shè)計構(gòu)建Fig.3 The design and construction of cell factories

在物質(zhì)代謝水平，代謝途徑的相對正交化是指底物同化途徑或產(chǎn)物合成途徑與底盤內(nèi)源代謝網(wǎng)絡(luò)最多只以唯一的結(jié)點相連，以形成獨立的模塊，便于后續(xù)調(diào)控其代謝流通量［105-106］。此種途徑的正交化過程可視作對底盤生長和產(chǎn)物合成的解耦［105］。在碳源利用方面，常設(shè)計構(gòu)建非天然途徑，或利用葡萄糖、油脂等天然碳源［圖3（c），正交化途徑1］，或轉(zhuǎn)化半纖維素水解產(chǎn)物（木糖、阿拉伯糖、半乳糖）等替代碳源［圖3（c），正交化途徑2］，合成關(guān)鍵前體化合物。例如，合成1，4-丁二醇［107］和琥珀酸［105］的正交化途徑。在前體供給方面，?；诜翘烊磺绑w構(gòu)建目標(biāo)產(chǎn)品的正交化人工合成途徑［圖3（c），正交化途徑3］。例如，以NPP（neryl diphosphate）替代其異構(gòu)體GPP 作為單萜合成的前體，通過NPP 合酶的引入和單萜合酶的定向進(jìn)化，可構(gòu)建正交化的橙花醇、檜烯、檸檬烯等單萜類產(chǎn)品的合成途徑［108］。

物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量轉(zhuǎn)移高度耦合。而天然輔酶同時參與眾多代謝反應(yīng)和生物過程，其具有選擇性差、生物學(xué)效應(yīng)可預(yù)見性低等問題［109］，降低了所涉及途徑的正交性。通過設(shè)計構(gòu)建煙酰胺胞嘧啶二核苷酸等非天然輔酶［110-112］，建立與底盤正交的氧化還原體系，可以從能量代謝的角度增強(qiáng)目標(biāo)途徑與內(nèi)源代謝網(wǎng)絡(luò)的正交化程度。

3.2.2 途徑定位細(xì)胞器的正交化發(fā)展趨勢

與原核底盤相比，釀酒酵母等真核底盤具備多種可用于途徑模塊定位的細(xì)胞器，產(chǎn)生區(qū)室化效應(yīng)［97］，提高目標(biāo)產(chǎn)物的合成水平［113-117］。通過調(diào)控細(xì)胞器的形態(tài)、數(shù)量、大小等表型，可進(jìn)一步提高定位途徑的通量［118-119］。如果靶向的細(xì)胞器具備正交性，可降低此種調(diào)控對其他細(xì)胞器及底盤內(nèi)源代謝的干擾。根據(jù)參與中心代謝的程度，天然細(xì)胞器中過氧化物酶體的正交性最高［120］，完全刪除過氧化物酶體蛋白不會影響菌體以葡萄糖為底物的生長［121］。而建立人工過氧化物酶體蛋白轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，在目標(biāo)蛋白靶向定位的同時，抑制天然過氧化物酶體蛋白的定位表達(dá)［122］，開啟了定制化細(xì)胞器的研究［圖3（d）］。此外，借助低密度膜結(jié)合蛋白精確控制囊泡膜的自發(fā)彎曲，有望實現(xiàn)不依賴于底盤內(nèi)源基因調(diào)控膜的分裂［123］，而控制細(xì)胞器的表型。

原核生物中天然存在由選擇性通透的蛋白質(zhì)衣殼代替磷脂層分子包裹形成的微室［124］。在真核底盤中重建原核微室或構(gòu)建類微室結(jié)構(gòu)的人工細(xì)胞器，進(jìn)行異源催化反應(yīng)，也是細(xì)胞器正交化的策略手段［圖3（d）］。在重構(gòu)原核微室時，采用SpyTag/SpyCatcher 共 價 結(jié) 合［125］或CC-Di-A/CCDi-B 卷曲螺旋（coiled-coil）［126］等蛋白質(zhì)自主裝結(jié)構(gòu)，替代天然微室的包裝序列，可解決催化蛋白易發(fā)生團(tuán)聚而喪失活性的問題。但上述方法尚未在真核底盤中進(jìn)行嘗試［127］。而參考天然微室結(jié)構(gòu)，利用自組裝蛋白（例如encapsulins［128］、受藍(lán)光調(diào)控的Cry2［129］和PixD/PixE［130］）的可控表達(dá)和組裝，已成功在真核生物中構(gòu)建了包裝有催化蛋白的人工細(xì)胞器，實現(xiàn)norcoclaurine［131］、脫氧紫色桿菌素［132］等化合物的高效合成。

3.3 魯棒性

細(xì)胞工廠的魯棒性是指人工合成體系在受到環(huán)境變化和遺傳變異等不確定因素干擾時保持其表型穩(wěn)定的一種特性。這種外界的擾動一方面來源于異源合成途徑的引入而產(chǎn)生的代謝負(fù)擔(dān)，以及中間代謝體或終產(chǎn)物積累而帶來的脅迫壓力和細(xì)胞毒性；另一方面來源于實際工業(yè)生產(chǎn)過程中的環(huán)境壓力。下述兩種策略分別針對上述兩種外界擾動，展示如何增強(qiáng)人工合成體系的魯棒性。

3.3.1 動態(tài)調(diào)控合成途徑

構(gòu)建基因線路，隨菌體生長代謝或環(huán)境條件的變化對途徑模塊進(jìn)行動態(tài)調(diào)控，是在代謝脅迫擾動下提高系統(tǒng)魯棒性的有效手段［133］。相關(guān)基因線路的設(shè)計原則一是偶聯(lián)生長和生產(chǎn)［圖3（e）］，即產(chǎn)物在胞內(nèi)的積累正反饋激活必需基因的表達(dá)，以避免負(fù)向突變在群體中的積累，強(qiáng)迫系統(tǒng)保持目標(biāo)途徑代謝流的穩(wěn)定和最大化［134-135］。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用同時具備正/負(fù)兩向篩選功能的報告基因，可排除啟動子區(qū)突變而產(chǎn)生的調(diào)控逃逸［136］。另一基因線路設(shè)計原則是解耦生長和生產(chǎn)［圖3（e）］，基于群體響應(yīng)元件，感知菌體的生長密度，反饋調(diào)控產(chǎn)物合成［137］；或基于結(jié)合化學(xué)分子的調(diào)控蛋白，響應(yīng)胞內(nèi)關(guān)鍵代謝中間體的含量，實時調(diào)整產(chǎn)物的積累速率［35］，防止有毒中間產(chǎn)物的過量積累［138］，以降低異源途徑對底盤的代謝脅迫。目前，調(diào)控蛋白從特異性識別一種化合物，發(fā)展為以不同的響應(yīng)閾值同時識別兩種以上化合物。在發(fā)酵前期通過底物的抑制作用限制有毒終產(chǎn)物的積累，在發(fā)酵后期通過產(chǎn)物的正反饋作用加快產(chǎn)物的合成［139］。同時，以特異性響應(yīng)某種代謝物的啟動子可代替調(diào)控蛋白控制途徑模塊的表達(dá)［138］。在此基礎(chǔ)上級聯(lián)dCas9/sgRNA 系統(tǒng)的調(diào)控，還可增強(qiáng)響應(yīng)速度和敏感性［140］。

3.3.2 馴化具有高耐受性的底盤菌株

為應(yīng)對復(fù)雜、非理想化的工業(yè)發(fā)酵過程，需要底盤菌株擁有抗高溫、耐鹽、耐酸、耐有機(jī)溶劑等性狀，以具備對某一類特定環(huán)境壓力較高的魯棒性［141］。由于產(chǎn)生耐受性性狀具有多基因性，且分子機(jī)制并未完全清晰闡釋，現(xiàn)階段很難通過工程化手段完整復(fù)制到大腸桿菌和釀酒酵母等常用模式底盤生物中。因此，多采用實驗室適應(yīng)性進(jìn)化［142］等手段改善模式菌株的耐受性［143-145］，并挖掘應(yīng)對相關(guān)環(huán)境壓力的基因組擾動靶點［146-147］。近年來則傾向于選擇天然對極端環(huán)境具有耐受性的非模式生物［148］，逐步馴化為可用于細(xì)胞工廠構(gòu)建的底盤菌株［149］。例如耐熱耐酸的馬克斯克魯維酵母［150］和溶劑耐受的丙酮丁醇梭菌［151］。以嗜鹽假單胞菌為底盤菌株，利用海水為介質(zhì)高效生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯（PHA）等生物單體材料［152］，是非模式底盤菌株工業(yè)應(yīng)用的典型案例。

綜上所述，在細(xì)胞工廠的設(shè)計構(gòu)建過程中，模塊化和正交化策略的支撐作用日益明顯，魯棒性和適配性成為構(gòu)建人工合成體系時需要考慮的重要問題。從長遠(yuǎn)看，細(xì)胞工廠將與數(shù)學(xué)、計算機(jī)學(xué)、物理學(xué)等學(xué)科深入交叉融合，實現(xiàn)從原料到菌種再到過程的全鏈條設(shè)計和優(yōu)化的智能化和自動化。

4 人工多細(xì)胞體系的構(gòu)建與應(yīng)用

有目標(biāo)的設(shè)計、改造乃至重新合成微生物多細(xì)胞體系，在維持菌群結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)定性、魯棒性和可控性的同時，可實現(xiàn)復(fù)雜的生物功能，提高代謝效率。人工多細(xì)胞體系在完成多項復(fù)雜任務(wù)方面優(yōu)勢明顯，減輕單個底盤細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)，同時降低中間代謝物的過度積累和毒害，避免功能間的交叉影響，對環(huán)境波動具有更強(qiáng)的適應(yīng)性和魯棒性［153-154］。因此，人工多細(xì)胞體系已成為合成生物學(xué)研究的重要方向［155-156］。

4.1 人工多細(xì)胞體系的設(shè)計構(gòu)建

人工多細(xì)胞體系的設(shè)計構(gòu)建首要解決的問題是，依據(jù)什么樣的原理和方法設(shè)計、構(gòu)建特定的多細(xì)胞體系；其次是如何使各細(xì)胞間的功能協(xié)調(diào)運行，從而實現(xiàn)底物原料到目標(biāo)產(chǎn)物的高效轉(zhuǎn)化［圖4（a）］。

4.1.1 微生物間的互作關(guān)系

依據(jù)微生物間的互作關(guān)系設(shè)計構(gòu)建人工多細(xì)胞體系，進(jìn)一步借助代謝物互補(bǔ)、克服從底物到產(chǎn)物的能量壁壘、解除環(huán)境中的抑制作用、調(diào)控電子轉(zhuǎn)移平衡等方式，使體系的物質(zhì)流、能量流和信息流達(dá)到適配，可實現(xiàn)人工多細(xì)胞體系的高效穩(wěn)定［155，157］。細(xì)胞間互作關(guān)系的穩(wěn)定存在，普遍依賴于細(xì)胞間通訊，細(xì)胞間通訊系統(tǒng)是構(gòu)建人工多細(xì)胞體系的關(guān)鍵［158］。研究者通過建立一種預(yù)測多細(xì)胞體系中相互作用關(guān)系的方法，可有效預(yù)測800 多種菌群中互作關(guān)系［159］。哈佛大學(xué)研究人員關(guān)注由細(xì)胞群體感應(yīng)信號或代謝互補(bǔ)聯(lián)系起來的混菌共生關(guān)系［160］。利用群體感應(yīng)系統(tǒng)，可構(gòu)建能夠雙向通訊的多細(xì)胞體系［161］。

自然條件下的多細(xì)胞體系，常形成互利、偏利、偏害、競爭等多種相互作用關(guān)系［162］。自然形成或人工復(fù)配的多細(xì)胞體系中一般存在成員分工不明確、代謝水平不平衡、競爭與協(xié)作共存等問題，相互作用關(guān)系錯綜復(fù)雜。采用模塊化構(gòu)建的方法，可針對性地設(shè)計和重構(gòu)各個功能菌種，構(gòu)建菌株間的協(xié)作關(guān)系，使其有利于多細(xì)胞體系的高效性和穩(wěn)定性［163-164］。

在互利共生體系中，菌株之間共享或者交換營養(yǎng)物質(zhì)，彼此之間可共同完成某一種化合物的徹底代謝，并分別從中獲益。通過構(gòu)建了營養(yǎng)缺陷型菌株，可以構(gòu)建互利共生的多細(xì)胞系統(tǒng)，使菌株促進(jìn)彼此的生長［165］。研究者利用雙向通訊在兩株大腸桿菌中構(gòu)建了共生系統(tǒng)［166］。在偏利或偏害關(guān)系的體系中，對一方菌株有益/有害，另一方則不受影響。菌株間對環(huán)境資源（如營養(yǎng)物質(zhì)、空間等）的爭奪則形成了菌株間的競爭關(guān)系。在構(gòu)建人工多細(xì)胞體系時，也應(yīng)充分考慮菌株間競爭、偏利或偏害等關(guān)系存在的可能性。部分菌株可能加速對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，并對這些物質(zhì)進(jìn)行與構(gòu)建目標(biāo)不相關(guān)的無效轉(zhuǎn)化，或者產(chǎn)生對其他菌株有抑制作用的物質(zhì)，這必然會影響菌群的高效和穩(wěn)定。通過對混菌體系中菌株關(guān)系的重構(gòu)，可解除競爭抑制，使菌株間偏利共生和競爭關(guān)系轉(zhuǎn)變?yōu)榛ダ采?67］。通過人工構(gòu)建和調(diào)控菌株間的互利共生關(guān)系，使人工多細(xì)胞體系對復(fù)雜功能網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行有效的分工協(xié)作，可實現(xiàn)混菌系統(tǒng)的高效、穩(wěn)定、可控。此外，研究者還設(shè)計構(gòu)建了多種菌群相互作用關(guān)系，為構(gòu)建人工多細(xì)胞體系提供新的思路。例如：在兩株大腸桿菌中分別構(gòu)建群體感應(yīng)信號調(diào)控下的細(xì)胞自殺基因表達(dá)及其抑制途徑，可形成捕食者與被捕食者的關(guān)系［30］。

依據(jù)勞動分工原則構(gòu)建人工多細(xì)胞體系，可將復(fù)雜的任務(wù)合理分配給不同的菌株，在一定程度上避免單菌中細(xì)胞代謝負(fù)荷重等問題，在提高效率等方面具有顯著優(yōu)勢［168］。依據(jù)“勞動分工合作”的原則，構(gòu)建出大腸桿菌-枯草芽孢桿菌-希瓦氏菌人工三菌產(chǎn)電體系，顯著提高了化學(xué)能到電能的轉(zhuǎn)化效率［169］；通過將紫杉醇前體（5α-乙?；?10β-羥化紫杉二烯）的合成途徑分工構(gòu)建到大腸桿菌-釀酒酵母人工兩菌體系中，實現(xiàn)了目標(biāo)產(chǎn)物的高效合成［170］；為實現(xiàn)黃酮類化合物的合成，研究者設(shè)計構(gòu)建大腸桿菌-大腸桿菌雙菌體系，顯著降低了單菌的代謝負(fù)擔(dān)，使黃烷-3-醇的產(chǎn)量比單菌體系提高970倍［171］。

圖4 人工多細(xì)胞體系的構(gòu)建與調(diào)控Fig.4 Construction and regulation of synthetic microbial consortia

4.1.2 菌株間的互作方式

人工多細(xì)胞體系中菌株間的互作交流主要有兩種方式：一種是依賴于微生物細(xì)胞與細(xì)胞間的直接接觸作用方式，主要包括膜囊泡、納米管和瞬時融合外膜。如通過構(gòu)建不動桿菌-大腸桿菌互利共生混菌體系研究兩菌的代謝交流，發(fā)現(xiàn)兩菌通過細(xì)菌納米管進(jìn)行物質(zhì)交換和信息交流［172］。另一種是菌株可通過間接接觸進(jìn)行物質(zhì)和能量交換，以維持菌群的生態(tài)穩(wěn)定性［173］。間接接觸主要依賴于釋放到環(huán)境中的化學(xué)分子（蛋白質(zhì)、代謝物等）和電子等。如可利用乙醛的揮發(fā)特性作為信號分子，構(gòu)建不同菌株的共生關(guān)系［174］等。

4.1.3 人工兩菌體系到人工多菌體系

人工多細(xì)胞體系的設(shè)計構(gòu)建已經(jīng)從兩菌體系擴(kuò)展到多菌體系［圖4（b）］。隨著菌群中菌株種類的增加，菌株的互作關(guān)系愈加復(fù)雜，體系的高效性和穩(wěn)定性會受影響。人工多細(xì)胞體系在復(fù)雜環(huán)境中的魯棒性研究也是關(guān)鍵問題之一。在構(gòu)建人工多細(xì)胞體系時，更要關(guān)注對菌株關(guān)系的解析和調(diào)控，使多菌分工明確，高效協(xié)作。通過控制代謝流分配、減少能量轉(zhuǎn)化過程中的損失、增加功能冗余等策略，使體系內(nèi)的每一個個體都能夠在生產(chǎn)能力、穩(wěn)定性和魯棒性方面體現(xiàn)出最優(yōu)性能。

近年來，人工三菌、四菌體系的構(gòu)建和應(yīng)用研究也取得重要進(jìn)展。通過調(diào)控電子載體的合成、碳源的優(yōu)化分配和利用，構(gòu)建了高效穩(wěn)定的人工三菌產(chǎn)電體系，能夠利用0.28g 葡萄糖穩(wěn)定產(chǎn)電超過15 天［169］。通過構(gòu)建和調(diào)控大腸桿菌三菌體系，減少副產(chǎn)物的形成，實現(xiàn)了木質(zhì)素單體的高效合成［175］。通過在四株大腸桿菌中表達(dá)15 個外源基因，將天然產(chǎn)物花青素的合成途徑分工構(gòu)建到大腸桿菌四菌體系，首次實現(xiàn)了以葡萄糖、甘油和木糖為底物合成花青素［176］。

4.2 人工多細(xì)胞體系的應(yīng)用

近年來，人工合成多細(xì)胞體系的設(shè)計構(gòu)建取得了重要研究進(jìn)展，微生物混菌體系在資源能源、環(huán)境和人類健康領(lǐng)域等表現(xiàn)出強(qiáng)大的應(yīng)用前景［163，177-178］。

在合成化學(xué)品、高附加值產(chǎn)品等方面，研究者通過構(gòu)建大腸桿菌混菌體系，實現(xiàn)了黏康酸［179］、紅景天苷［180］、丁醇［181］、吡喃花青素［182］、黃酮類化合物［171］、苯酚［183］等高效合成。如人工構(gòu)建的大腸桿菌-大腸桿菌“營養(yǎng)互補(bǔ)”體系可以代謝葡萄糖和木糖生產(chǎn)紅景天苷，通過兩菌株的分工合成，紅景天苷的混菌發(fā)酵單位達(dá)到6.03g/L，是單菌產(chǎn)量的20倍［180］。

在纖維素等復(fù)雜化合物的降解方面，通過調(diào)控兩菌體系的菌群關(guān)系和菌群結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了高效轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素生產(chǎn)丁醇［184］和富馬酸［185］；通過在酵母表面展示纖維小體形成四菌體系，有效利用纖維素生產(chǎn)乙醇［186］；通過增強(qiáng)“營養(yǎng)-解毒”關(guān)系，構(gòu)建了雙梭菌互利共生體系，可將玉米芯轉(zhuǎn)化為丁醇，溶劑終濃度達(dá)到22g/L［187］。

人工多細(xì)胞體系在環(huán)境污染物降解、土壤修復(fù)等方面也表現(xiàn)出巨大潛力。人工構(gòu)建的由兩株工程化大腸桿菌構(gòu)成的混菌體系，實現(xiàn)了降解有機(jī)磷殺蟲劑［188］。人工構(gòu)建的大腸桿菌-蒼白桿菌混菌體系，可實現(xiàn)對二甲基有機(jī)磷的完全礦化［189］。通過構(gòu)建兩株假單胞菌人工混菌體系，可提高對石油硫化物的脫硫作用［190］。人工構(gòu)建的四菌體系可用于降解碳?xì)浠衔铮?91］，如常見的原料（橄欖油、石蠟油等）和多芳烴污染物（萘和蒽）等，同時生產(chǎn)表面活性劑。

5 合成生物學(xué)與其他學(xué)科交叉融合

合成生物學(xué)從誕生起始就具有多學(xué)科交叉的特點，隨著近年合成生物學(xué)的發(fā)展，與其他學(xué)科交叉融合又產(chǎn)生了一些新的方向，如DNA 信息存儲、DNA折紙、非天然氨基酸、非天然核酸等。

5.1 DNA信息存儲

手指、石頭、刻痕、繩結(jié)在古代被用來記錄數(shù)據(jù)和信息，現(xiàn)在大量的信息主要存儲于基于電、光和磁的存儲介質(zhì)中。隨著社會發(fā)展，不斷增長的數(shù)據(jù)存儲需求面臨著密度、功耗、體積等諸多挑戰(zhàn)。受DNA存儲遺傳信息啟發(fā)，人造DNA序列被認(rèn)為是信息存儲的新策略。DNA 信息存儲是先將數(shù)據(jù)進(jìn)行編碼轉(zhuǎn)換為DNA序列，借助DNA合成數(shù)據(jù)存入DNA 分子；信息讀取是通過高通量測序和信息處理將DNA 的分子序列轉(zhuǎn)換為原始存儲的數(shù)據(jù)［192-196］。DNA 存儲的核心優(yōu)勢是：①載體特征尺度小，信息存儲密度高。例如2017 年，研究者利用數(shù)字信息傳輸中的噴泉編碼實現(xiàn)了平均千分子DNA 拷貝的數(shù)據(jù)存儲與讀取，實現(xiàn)了218 PB/g（1PB = 1015字節(jié)）的存儲密度［192］。微軟等進(jìn)一步優(yōu)化信息存儲DNA 讀取中PCR 參數(shù)，實現(xiàn)了存儲密度的進(jìn)一步提升［194］。②DNA 可常溫保存，維護(hù)成本顯著降低，且保存時間久。瑞士蘇黎世理工的研究者將DNA 封存在特殊的材料中，有望存儲千年甚至萬年［197-198］。

DNA 存儲作為一種新型數(shù)據(jù)存儲方式，也面臨很多發(fā)展挑戰(zhàn)。一是傳統(tǒng)的DNA 合成技術(shù)主要針對生物學(xué)研究與應(yīng)用建立，合成速度較低，成本較高，合成序列的長度與通量等也與數(shù)據(jù)存儲需求存在很大差距。由于目前序列合成的成本遠(yuǎn)高于測序成本，DNA 存儲特別適合大量冷數(shù)據(jù)的長期存儲。二是存儲在DNA 中的數(shù)據(jù)的讀取靈活性仍有待提升，基于目前測序技術(shù)的讀出方法面臨數(shù)據(jù)恢復(fù)可靠性、儀器形態(tài)、環(huán)境適應(yīng)性等諸多挑戰(zhàn)。2019 年微軟開發(fā)了從寫到讀的端到端原型系統(tǒng)［199］，距離現(xiàn)代信息存儲系統(tǒng)仍有巨大發(fā)展空間。三是DNA 信息存儲與現(xiàn)有電子信息存儲之間的編碼轉(zhuǎn)化尚不成熟。DNA 作為一種物質(zhì)介質(zhì)具有各種自身的特點，如有斷裂、突變、缺失等風(fēng)險，近年來各種編碼方法在DNA 存儲的密度、可靠性等方面有所突破［200-202］。最后，DNA 存儲的技術(shù)鏈條較長，亟需生物、信息、儀器、機(jī)械和工程等領(lǐng)域的整合。

5.2 DNA折紙

DNA 作為納米分子還可以被當(dāng)作材料的構(gòu)筑單元。DNA 本身的特異性堿基互補(bǔ)配對為特異性組裝材料提供了基礎(chǔ)，可以構(gòu)筑出以DNA 作為框架的精細(xì)納米結(jié)構(gòu)。DNA 折紙就是利用DNA 的折疊和自組裝形成復(fù)雜結(jié)構(gòu)的技術(shù)，人工設(shè)計一系列DNA 片段，借助堿基互補(bǔ)配對原則，可以折疊形成不同的預(yù)期幾何結(jié)構(gòu)，如三角形、矩形、菱形、五角星及笑臉等精細(xì)二維結(jié)構(gòu)［203］。我國學(xué)者利用人工設(shè)計DNA構(gòu)建了微型的中國地圖［204］。其后，研究者還采用DNA 折紙技術(shù)制造了齒輪、納米盒子和花瓶等精細(xì)三維結(jié)構(gòu)［205-207］。由于采用了“自下而上”的理性組裝方式，DNA 折紙技術(shù)在納米材料、分析科學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、納米機(jī)器人和信息加密等方面均有不同的創(chuàng)新性應(yīng)用。特殊的DNA折紙結(jié)構(gòu)載體可以用于包裹納米金造影劑，顯著提高成像質(zhì)量，實現(xiàn)對腫瘤內(nèi)部結(jié)構(gòu)成像，極大減少造影劑的用量［208］。DNA 折紙技術(shù)還可以用于分子加密系統(tǒng)，性能可以超越基于硅基計算機(jī)的常規(guī)加密體系，且同時具有保護(hù)信息完整性和訪問控制的功能［209］。研究人員利用DNA折紙技術(shù)的精細(xì)可控性能，創(chuàng)建了迄今為止最快、最持久的DNA納米馬達(dá)［210］。

5.3 非天然氨基酸

天然蛋白質(zhì)由20 種天然氨基酸組成，迄今已有超過150種非天然氨基酸可以引入生物體內(nèi)，其中大多數(shù)非天然氨基酸是天然氨基酸的衍生物。非天然氨基酸中根據(jù)目的需求可以引入烯基、酮基、醛基、酰氨基等功能基團(tuán)，調(diào)控蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能［211］。非天然氨基酸通過對特定蛋白質(zhì)的修飾，可在生物催化、人工生物防逃逸、蛋白質(zhì)藥物、生物檢測等方面有重要的應(yīng)用。氟色氨酸的引入不僅可以提升轉(zhuǎn)氨酶的活性，還提升了酶的溶劑耐受性和熱穩(wěn)定性［212］。對氨基苯丙氨酸引入到轉(zhuǎn)錄因子蛋白LmrR 可以將其改變?yōu)榫哂写呋钚缘碾旰碗亢铣擅福?13］。此外，將非天然氨基酸引入大腸桿菌的必需蛋白，可以使大腸桿菌依賴于非天然氨基酸存活，從而達(dá)到人工生物體的生物安全防逃逸控制［214-215］。鹵代酪氨酸引入肌紅蛋白氧化酶，可以形成光譜探針，為研究酶的催化機(jī)制提供了便捷手段［216］。

遺傳密碼拓展技術(shù)是非天然氨基酸引入的重要手段，主要是通過控制終止密碼子的讀取，進(jìn)而通過氨酰-tRNA 合成酶/tRNA 對的改造實現(xiàn)［217］。近年來基因組密碼子刪減研究可以為遺傳密碼拓展提供高效的人工底盤細(xì)胞［51，60］，將明顯提升引入非天然氨基酸的數(shù)量、種類和效率。此外，非天然核酸加入基因組的研究也將為更多非天然氨基酸的進(jìn)一步高效加入提供新的方向［218］。

5.4 非天然核酸

針對核酸的堿基、磷酸和五碳糖三個主要組成部分，可以分別進(jìn)行人工修飾或替換，形成非天然核酸（XNA）這樣一類核酸分子類似物［219］。XNA 能夠通過堿基修飾或骨架修飾來拓展遺傳信息的存儲能力，可以具有部分或全部天然核酸的屬性［220］。生物體系引入XNA能夠拓展遺傳信息的多樣性，進(jìn)而拓展生物性能。非天然堿基研究近年來取得了一些重大突破，如八堿基DNA 和具有生命活性的六堿基DNA 等。通過對天然堿基（A、T、C、G）的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，創(chuàng)造出了兩對新的可以互補(bǔ)配對的堿基（S、B、P、Z，其中S和B 配對、P 和Z 配對）。將人工堿基與天然堿基相結(jié)合，可以獲得含有八種堿基的DNA［221］。研究者在探索非天然堿基多樣性的同時，也在嘗試使非天然堿基具有生物活性。美國學(xué)者在大腸桿菌里成功表達(dá)了含有兩個非天然堿基編碼非天然氨基酸的熒光蛋白，實現(xiàn)了非天然堿基的轉(zhuǎn)錄活性，首次實現(xiàn)含六堿基DNA 的半人工合成生命［218］。XNA 種類的增加不僅提升了遺傳信息的密度，還為拓展生物的多樣性奠定了基礎(chǔ)。

目前XNA 主要通過外源添加方式進(jìn)入生物體［218］，將來開發(fā)生物體內(nèi)合成XNA，將進(jìn)一步拓展XNA 在合成生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。由于XNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性和特異性有其自身特點，在合成生物學(xué)的精準(zhǔn)檢測和正交控制等方面具有重要的應(yīng)用潛力［222］。

5.5 生物與材料耦合系統(tǒng)

利用生物酶與人工材料結(jié)合，形成具有部分生命特征的耦合系統(tǒng)是當(dāng)前的一個研究熱點。其中，模擬自然界光合作用，將生物酶與半導(dǎo)體光催化劑結(jié)合，構(gòu)建基于酶-光耦聯(lián)的人工光合系統(tǒng)發(fā)展迅速。與自然界光合作用相比，酶-光耦聯(lián)系統(tǒng)既保留了生物酶的催化能力，又結(jié)合了半導(dǎo)體的光吸收能力，通過二者體外靈活組合，打破了自然進(jìn)化的限制，實現(xiàn)太陽能驅(qū)動能源化學(xué)品和高附加值化學(xué)品的綠色、可持續(xù)合成。酸脫氫酶、醛脫氫酶和醇脫氫酶與α-Fe2O3/BiFeO3半導(dǎo)體光電極耦合，實現(xiàn)了太陽能驅(qū)動二氧化碳到甲醇還原［223］。光系統(tǒng)（PS Ⅱ）和氫酶與半導(dǎo)體光電極耦合，實現(xiàn)了無偏壓下的全水分解［224］。此外，半導(dǎo)體與生命單元的結(jié)合還可延伸至細(xì)胞，將半導(dǎo)體分別沉積于原核微生物和真核微生物細(xì)胞表面，實現(xiàn)了微生物胞內(nèi)NADPH/NADP+比例及代謝途徑的調(diào)控，突破了天然微生物的生產(chǎn)能力上限［225-226］。為減少納米材料與細(xì)胞膜直接接觸對微生物產(chǎn)生的破壞作用，細(xì)菌生物被膜可用于半導(dǎo)體大規(guī)模錨定，構(gòu)建生物化學(xué)兼容的生物-無機(jī)界面［227］。該體系不僅可以發(fā)展可循環(huán)和可再生的催化反應(yīng)體系，并且能與胞內(nèi)的氫化酶耦合實現(xiàn)穩(wěn)定的光催化產(chǎn)氫［228］。半導(dǎo)體材料與不同酶及不同細(xì)胞的兼容組合，打破了自然界進(jìn)化的限制，極大促進(jìn)了人工光合領(lǐng)域的發(fā)展。

5.6 無細(xì)胞蛋白合成

無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)是在試管內(nèi)重現(xiàn)生命中心法則的全部生化反應(yīng)，可以重建自然并超越自然的生物分子系統(tǒng)。無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)（cellfree）有助于實現(xiàn)對蛋白質(zhì)表達(dá)體系的高效優(yōu)化與控制，是合成理化性質(zhì)復(fù)雜的蛋白質(zhì)的重要方法，如生理毒性蛋白［229］、復(fù)雜膜蛋白［230］等。該系統(tǒng)也可以輔助對蛋白質(zhì)功能的篩選與檢測，如將cellfree 合成系統(tǒng)與CRISPR-Cas 系統(tǒng)相結(jié)合來篩選核酸酶［231］。cell-free 合成系統(tǒng)能夠為活性抗體藥物的表達(dá)與篩選提供便利，大大縮短活性抗體的研究周期［232］。利用真核生物無細(xì)胞系統(tǒng)TNTT7快速體外表達(dá)FhSAP2 蛋白，有效保持了其主要的構(gòu)象和抗原性質(zhì)［233］。通過cell-free 系統(tǒng)在天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中插入非天然氨基酸也是近年來各種基礎(chǔ)和應(yīng)用科學(xué)的研究熱點［234］。cell-free 合成系統(tǒng)可以為抗體偶聯(lián)藥物制備偶聯(lián)藥物前體，消除了內(nèi)源性氨基酸殘基隨機(jī)生成的偶聯(lián)物所產(chǎn)生的異質(zhì)性和不穩(wěn)定性［235］。在檢測方面，cell-free 合成系統(tǒng)可以為蛋白質(zhì)共振配位提供多樣性的標(biāo)記策略，制備用于液相核磁共振波譜分析的蛋白質(zhì)樣品［236］。各種cell-free 合成系統(tǒng)的開發(fā)使得廉價和快速的重組蛋白表達(dá)成為可能，并且各種方法之間能夠為表達(dá)來自不同生物體的蛋白質(zhì)進(jìn)行替代和互補(bǔ)［237］。在多樣的cell-free 合成系統(tǒng)中，基于大腸桿菌無細(xì)胞合成系統(tǒng)得到廣泛的研究與應(yīng)用?；诖竽c桿菌RFzero-iy 菌株的S30 無細(xì)胞合成系統(tǒng)實現(xiàn)了高達(dá)90%以上的3-碘-L-酪氨酸的插入效率［238］。鑒于系統(tǒng)的靈活性，無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)已經(jīng)成為合成生物學(xué)的重要工具。

6 結(jié) 語

合成生物學(xué)各個方向的研究日益活躍，對生物學(xué)領(lǐng)域研究的支撐作用日益突出，充分表現(xiàn)出合成生物學(xué)的強(qiáng)大創(chuàng)新力。同時，合成生物學(xué)將生物學(xué)與其他學(xué)科進(jìn)行深度交叉融合，充分發(fā)揮定量、設(shè)計、工程化等特征，正在發(fā)展成為一個基礎(chǔ)性學(xué)科和工具性學(xué)科。將來通過進(jìn)一步借助自動化、信息化的手段，合成生物學(xué)將迎來更快速地發(fā)展，將對更多的領(lǐng)域產(chǎn)生重要影響和推動，對解決人類社會發(fā)展面臨的重大難題提供全新的解決方案。

致謝：在撰寫本文過程中，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院鐘超研究員，天津大學(xué)齊浩教授、陳為剛副教授和石家福副教授提供了幫助和支持，在此一并致謝。