陳幸 丁成 傅淑蕾 張鵬濤 張遠 鐘良軍

牙周炎是由菌斑微生物引起的一種慢性感染性疾病，影響世界上約20%～50%的人口［1］。該病是由細菌入侵牙周組織，激活宿主免疫炎癥反應(yīng)和持續(xù)的免疫反應(yīng)不平衡，導(dǎo)致漸進性牙周組織損傷［2］。研究表明，遺傳因素在決定宿主的免疫反應(yīng)方面可能起一定的作用［3］，此外，吸煙、性別以及糖尿病和冠心病等全身系統(tǒng)性疾病也會造成疾病易感性的個體差異。NLRP3是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族含熱蛋白結(jié)構(gòu)域亞成員，被證明參與慢性感染炎癥性疾病的先天免疫反應(yīng)［4］。在牙周炎患者中觀察到牙齦組織中NLRP3的過表達和唾液水平NLRP3的增加［5］?；谝种芅LRP3炎性小體的治療方法在實驗性糖尿病牙周炎的治療中也取得了顯著的療效［6］。一項基于哥倫比亞人群的研究表明，NLRP3（rs4612666）基因型與老齡和吸煙習慣的協(xié)同作用可能影響慢性牙周炎（Chronic Periodontitis，CP）的發(fā)病［7］。但不同種族群體牙周炎的遺傳易感性存在差異，而目前國內(nèi)尚未見該基因座位的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與牙周炎易感性相關(guān)性研究的報道。因此，本研究擬探索NLRP3（rs4612666）基因多態(tài)性對中國人群CP發(fā)病的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年12月至2018年12月本院牙周病診療中心就診的236例中重度CP患者（病例組，CP組），根據(jù)美國牙周病學會（AAP，1999）的牙周炎診斷標準，使用牙周刻度探針（Hu-Friedy，UNC-15）分別在每顆牙齒頰舌面的遠中、中央、近中進行測量，并沿著牙周袋底提插式行走，記錄的臨床參數(shù)包括：牙周探診深度（Periodontal Probing Depth，PD）、臨床附著喪失（Clinical Attachment Loss，CAL）和全口探診出血指數(shù)（Full-Mouth Bleeding Score，F(xiàn)MBS）。中 度 CP為 PD 5～6mm，CAL 3～4mm；重 度 CP為PD≥7mm，CAL≥5mm。排除標準：吸煙者或戒煙時間＜10年者；糖尿病、風濕病等全身系統(tǒng)性疾病者；近1年內(nèi)有牙周治療史者；錯頜畸形者；孕婦或哺乳期者。對照組通過多階段隨機抽樣方法從本院體檢中心抽取患有局部牙齦炎或牙周健康的對照，并且按年齡、性別與病例組進行匹配。所有對照組經(jīng)過牙周檢查無PD≥4mm的牙周袋且FMBS＜20%。本研究得到了杭州師范大學附屬醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 樣本收集 所有觀察對象均簽署知情同意書，均抽取前臂外周血5ml保存于EDTA抗凝管中。在-20℃下放置過夜后保存于-80℃冰箱，留待提取DNA。

1.3 DNA提取和基因分型 采用DNA提取試劑盒 提 取 DNA（TIANGEN，TIANamp Geomic DNA Kit）。使用聚合酶鏈反應(yīng)-限制片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP） 方 法 對 NLRP3 rs4612666基因多態(tài)性進行基因分型。引物序列為上 游：5'-TGCTTAAGGCCATTAATTGTG-3'， 下 游5'-CTCCACCATGGACAAGGAAG-3'，擴增長度為260bp。PCR反應(yīng)體系：混合物總反應(yīng)體積為15μl，包含1μl DNA、上下游引物各 0.5μl、DreamTaq Green PCR Master Mix（2X）（Thermo Fisher）8μl和 5μl滅菌雙蒸水。酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察條帶。PCR和酶切反應(yīng)設(shè)置空白對照項，基因多態(tài)性的分型檢測均在盲法原則下完成，并隨機抽取10%樣本進行重復(fù)性測試2次，驗證結(jié)果的可靠性。

1.4 統(tǒng)計學方法 SNP Stats軟件用于評估哈迪溫-伯格平衡（Hardy-Weiberg，HWE，P＞0.05）。使用SPSS 25.0分析實驗數(shù)據(jù)。NLRP3 rs4612666位點的基因型和等位基因頻率的分布比較計算比值比（OR）及95%可信區(qū)間（95% CI），當可信區(qū)間不包括1.0時存在相關(guān)性，采用χ2檢驗統(tǒng)計實驗結(jié)果，所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CP組和正常對照組（HC組）臨床資料比較 見表1。

表1 CP組和HC組臨床資料比較（）

表1 CP組和HC組臨床資料比較（）

CP組（n=236） HC組（n=191） P值性別（n） 男性 107 101 0.12女性 129 90 -年齡（歲） 均數(shù) 48.31±9.65 46.57±8.59 0.53范圍 33～65 31～62 -探診深度（mm） 4.36±0.52 2.37±0.31 ＜0.001臨床附著喪失（mm） 4.92±0.78 2.51±0.25 ＜0.001程度（n） 中度CP 85 - -重度CP 151 - -

2.2 NLRP3基因rs4612666位點的基因型和等位基因頻率分布 CP組和HC組的NLRP3（rs4612666）最小等位基因頻率（Minor Allele Frequency，MAF）和基因型分布見表2。經(jīng)HWE檢驗，基因型和等位基因分布頻率符合HWE（χ2=2.87，P=0.09）。二次隨機選擇的重復(fù)試驗結(jié)果與對應(yīng)原始結(jié)果比較的符合率為100%。根據(jù)性別和CP嚴重程度分組的rs4612666位點的基因型分布情況見圖1。

表2 NLRP3（rs4612666）C/T基因型分布及最小等位基因頻率［n（%）］

圖1 rs4612666位點的基因型分布情況。A：NLRP3（rs4612666）位點各基因型在中度和重度慢性牙周炎患者中的分布；B：NLRP3（rs4612666）位點各基因型在男性和女性慢性牙周炎患者中的分布

2.3 NLRP3基因rs4612666位點的基因型和等位基因頻率分布比較 所有CP患者和對照組之間進行各基因型和等位基因的頻率對比分析，表3顯示NLRP3 rs4612666位點攜帶T等位基因的人群，患CP的風險顯著增高（CT vs. CC：OR=2.09，95% CI=1.09～4.03，P=0.026；TT vs. CC ：OR=2.86，95% CI=1.24～6.59，P=0.013；CT/TT vs. CC：OR=2.27，95% CI=1.21～4.25，P=0.010；T等位基因 vs. C等位基因：OR=1.50，95%CI=1.14～1.97，P=0.003）。當單獨對男性 進 行 分析時，CP組 NLRP3 rs4612666位 點 的 CT、TT及 CT/TT基因型與CC基因型攜帶者比較，患CP的風險均 增 高（OR=2.09，95% CI=1.09～4.03，P=0.026；OR=2.86，95% CI=1.24～6.59，P=0.013；OR=2.27，95% CI=1.21～4.25，P=0.010），且T等位基因與C等位基因比較（OR=1.64，95% CI=1.11～2.43，P=0.012）患病風險顯著增加。在女性組未觀察到任何基因型和等位基因頻率分布的差異。當根據(jù)患者CP的嚴重程度（中度和重度）進行分組分析時，未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學意義（見表3）。

表3 NLRP3（rs4612666）C/T位點各基因型與慢性牙周炎風險的相關(guān)系分析結(jié)果

3 討論

為了更好了解牙周炎復(fù)雜的免疫發(fā)病機制，本病例對照研究分析了炎性小體NLRP3 rs4612666基因多態(tài)性與牙周炎易感性的相關(guān)性。雖然已經(jīng)有研究報道非亞洲人種NLRP3 rs4612666基因多態(tài)性與CP的關(guān)系［7］，本文是第一次針對此SNP在中國人群中牙周炎易感性的病例對照研究。作者進行了嚴格的觀察對象篩選和基因分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NLRP3（rs4612666）位點CT和TT基因型與CP的遺傳易感性有關(guān)，尤其在男性人群中相關(guān)性顯著，但與牙周炎的嚴重程度無關(guān)。

NLRP3突變等位基因C是1q44號染色體內(nèi)含子7上的一個單核苷酸突變，與野生等位基因T比較，該等位基因的轉(zhuǎn)錄活性更高。NLRP3的激活取決于通過模式識別受體PRRs識別病原相關(guān)分子模式PAMPs提供的信號，如微生物脂多糖（LPS）。為了證實這一生物學機制，大量體外研究表明牙齦卟啉單胞菌（Pg）、伴放線聚集桿菌（Aa）和聚核梭桿菌（Fn）等牙周致病菌參與了NLRP3的表達增加［8］。NLRP3的高表達刺激IL-1β和IL-18的分泌和成熟。NLRP3的誘導(dǎo)還涉及細胞死亡或損傷釋放的內(nèi)源性宿主因子，如ATP等。因此，除了病原體引起的NLRP3激活信號外，還應(yīng)考慮與NLRP3基因轉(zhuǎn)錄活性增高相關(guān)的基因多態(tài)性在牙周炎發(fā)病炎癥相關(guān)信號通路中的作用。

環(huán)境危險因素與CP的發(fā)生發(fā)展密切有關(guān)，如吸煙習慣和性別等。與從不吸煙的人比較，吸煙人群患CP的風險更高，因吸煙會引起免疫抑制和細胞功能受損，如成纖維細胞促進的組織修復(fù)，因此吸煙人群通常CP的嚴重程度更重，對牙周治療的反應(yīng)也較差［10］。本資料中，為了最大可能的避免偏倚，僅納入了非吸煙人群，以降低吸煙混雜因素的影響。此外，由于激素水平、口腔衛(wèi)生和不良的健康預(yù)防習慣等因素的性別差異，許多免疫基因遺傳變異被認為是男性CP發(fā)生的易感因素，因此，按1∶1進行性別匹配病例組和對照組。

本資料中，作者發(fā)現(xiàn)NLRP3 rs4612666位點CT和TT基因型與增高的男性CP的風險相關(guān)。截止目前，有兩項研究調(diào)查了NLRP3基因多態(tài)性對牙周炎的影響［7，9］。其結(jié)果與作者相似，本研究考慮到性別差異，也按性別進行了亞組分析，發(fā)現(xiàn)與女性比較，非吸煙男性CP患者的CT、TT基因型分布頻率更高（P＜0.05）。此外，作者又按照CP嚴重程度進行了亞組分析，以研究NLRP3 rs4612666位點與牙周炎發(fā)展階段的關(guān)系，與健康對照組比較，中度CP和重度CP患者中均未觀察到相關(guān)性，提示NLRP3 rs4612666基因多態(tài)性可能與牙周炎的發(fā)病關(guān)系更為密切，而與牙周炎的進展相關(guān)性不大。

本研究尚存在一些不足。首先，本研究納入樣本量相對較小，CP是多因素疾病，單基因SNP對牙周炎易感性的影響相對較小，可能需要大樣本量的病例對照研究才可以發(fā)現(xiàn)潛在的相關(guān)性。同時，協(xié)同相互作用在CP的致病途徑中發(fā)揮重要作用，因此多基因多SNP的基因-基因研究以及環(huán)境-基因協(xié)同作用研究可以更好的發(fā)現(xiàn)遺傳因素在CP發(fā)病中的作用。

綜上所述，男性NLRP3 rs4612666位點CT或TT基因型者可能罹患牙周炎的風險增高。將來，有必要在獨立的大樣本人群中對我們的結(jié)果進行重復(fù)研究以驗證這些關(guān)聯(lián)。