駱麗如，黃昭璇，謝文杰，胡璐曼，唐忠海

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

瓜蔞為葫蘆科植物瓜蔞(TrichosantheskirikrwiiMaxim)或雙邊瓜蔞(TrichosanthesrosthorniiHarms)的干燥成熟果實(shí)，俗稱(chēng)瓜蔞、吊瓜，是一種具有多種藥效的傳統(tǒng)中藥，可用于潤(rùn)腸道、降燥熱、清熱化痰等方面，常常被用于治療由肺熱引起的咳嗽、胸悶氣結(jié)、痰稠不暢、大便不通等病癥[1-2]；含有糖苷類(lèi)、色素等，具有抗心肌缺血、抗心肌纖維化等作用[3-4].

黃酮是一類(lèi)植物次生代謝產(chǎn)物[5-6]，具有抗氧化、防止血管增生、抗炎、抗病毒[7-9]、抗衰老、降血糖、降血脂[10-12]、抗骨質(zhì)疏松[13]等多種生物活性.在人們?nèi)粘＝佑|到的蔬菜和水果中也含有黃酮.研究表明，飲食中黃酮攝入量的增加將降低人們患上結(jié)腸癌、前列腺癌、宮頸癌、乳腺癌等癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[14].不僅如此，不同植物中所含黃酮的生物活性也有著很大的不同.在一些文獻(xiàn)中都是以1 mg/mL的不同植物的黃酮提取液作為最高濃度來(lái)進(jìn)行各種抑菌試驗(yàn).結(jié)果表明在抑制細(xì)菌生長(zhǎng)方面即使是不同的植物其中所含的黃酮都有著不錯(cuò)的效果[15-16].

國(guó)內(nèi)對(duì)瓜蔞的研究多局限于根、籽粒、皮方面，而瓜蔞葉未引起重視，但事實(shí)上其葉容易大量獲得、保存、運(yùn)輸[17]，且其黃酮含量豐富.研究瓜蔞葉的黃酮提取，測(cè)定瓜蔞葉黃酮的抗氧化能力和抑菌能力，可以幫助了解瓜蔞葉是否具備作為天然食品添加劑的條件，為進(jìn)一步研究與瓜蔞葉有關(guān)的產(chǎn)品提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干燥瓜蔞葉；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)；SPL-250型恒溫培養(yǎng)箱(天津市萊玻特瑞設(shè)備有限公司)；SW-CJ-2D型雙人單面垂直凈化工作臺(tái)(蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司)；CP-214型電子天平(上海奧豪斯儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)；722S分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)；甲醇、無(wú)水乙醇、九水合硫酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、酵母浸出膏、氯化鈉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂皆為分析純；馬鈴薯.

1.2 瓜蔞葉黃酮的提取流程及含量的測(cè)定

1.2.1 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

將天平預(yù)熱0.5 h后稱(chēng)取干燥蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg放入50 mL容量瓶中，加入20 mL甲醇溶解搖勻.待蘆丁完全溶解且溶液中無(wú)細(xì)小氣泡后，用移液管移取2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中并標(biāo)記，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組.用乙醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%)稀釋至10.0 mL，移取0.6 mL亞硝酸鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%)，搖勻，放置反應(yīng)8 min，移取0.6 mL硝酸鋁(質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%)于錐形瓶，搖勻，放置反應(yīng)8 min，再用移液管移取8.0 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液加入錐形瓶，蒸餾水定容后搖勻，放置20 min至反應(yīng)完全，測(cè)定A510，記錄數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并計(jì)算回歸方程.

1.2.2 原料處理

將準(zhǔn)備好的瓜蔞葉放入恒溫干燥箱，在50 ℃下直到完全干燥，取出后將莖等其他部位除去，然后放入粉碎機(jī)中，先于40目篩粉碎篩選，再于50目篩篩選，最后將干燥的瓜蔞葉粉末于有干燥劑的保鮮袋中封存.

1.2.3 提取并測(cè)定黃酮提取率及含量

將瓜蔞葉粉末按比例加入到一定濃度的乙醇溶液中，放入事先調(diào)整好溫度的水浴中加熱一段時(shí)間.將提取液用原提取溶劑稀釋到100 mL，再依次加入亞硝酸鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%)、硝酸鋁(質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%)和1 mol/L的氫氧化鈉溶液，反應(yīng)一段時(shí)間后測(cè)量A510，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算所得瓜蔞葉提取液中的黃酮濃度，從而確定瓜蔞葉中的黃酮含量及提取率.

提取率(%)=m1/m2×100

式中，m1-黃酮含量(g)，m2-原料重量(g)

1.3 瓜蔞葉黃酮最佳提取條件的確定

1.3.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以瓜蔞葉黃酮提取率為指標(biāo)，分固液比(g/mL)、提取時(shí)間(h)、提取溫度(℃)、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)4組，分別考察4個(gè)因素對(duì)瓜蔞葉黃酮提取率的影響.每組因素平行試驗(yàn)3次，取3次平行試驗(yàn)所得提取率的平均值.

固液比的篩選：提取溶劑選用乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%，提取溫度為60 ℃，提取時(shí)間1.5 h，固液比分別設(shè)定為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70.

提取時(shí)間的篩選：選用乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%，提取溫度為60 ℃，固液比為1∶50，提取時(shí)間分別為0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h.

提取溫度的篩選：選用乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%，提取時(shí)間為1 h，固液比為1∶50，提取溫度分別是40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃.

乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的篩選：提取時(shí)間為1 h，提取溫度為60 ℃，固液比為1∶50，所用乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%.

1.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以固液比( A)、提取時(shí)間( B)、提取溫度( C)、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)(D)4個(gè)因素作考察因素，每個(gè)因素取 3 水平，用 1、2、3 編碼，以瓜蔞葉黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1.

表1 正交試驗(yàn)因素及水平

1.4 黃酮抗氧化能力的測(cè)定

抗氧化試驗(yàn)采用DPPH自由基清除試驗(yàn)的方法[18].以DPPH自由基清除率來(lái)反映各個(gè)濃度的黃酮的抗氧化能力，瓜蔞葉黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率越高，其抗氧化能力越大[19-20].

稱(chēng)DPPH自由基粉末3.9 mg于燒杯中，加入無(wú)水乙醇初步溶解后轉(zhuǎn)移到250 mL容量瓶中，再用無(wú)水乙醇反復(fù)清洗燒杯，并將洗滌液轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，最終將DPPH自由基完全轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中并用無(wú)水乙醇定容至刻度線(xiàn)，配成濃度為2×10-4mol/L的DPPH自由基溶液，備用.用移液管各取2 mL不同濃度的黃酮溶液與2 mL DPPH自由基溶液加入到同一試管中，混勻放置在陰涼處，25 min后測(cè)定517 nm處的吸光度，記錄數(shù)據(jù)標(biāo)記為A樣品.同時(shí)設(shè)置對(duì)照組即測(cè)量2 mL DPPH自由基溶液和2 mL無(wú)水乙醇混合后在517 nm處的吸光值，記錄為A對(duì)照，以及2 mL待測(cè)瓜蔞葉提取液液與2 mL提取液所用溶劑混合后在517 nm處的吸光度，記錄為A空白.

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100%

式中，A1為A樣品，A2為A空白，A3為A對(duì)照.

1.5 黃酮抑菌活性測(cè)定

向含有細(xì)菌濃度相同的液體培養(yǎng)基中加入相同濃度的瓜蔞葉黃酮提取液，培養(yǎng)一段時(shí)間，測(cè)量液體培養(yǎng)基OD600值的變化，以細(xì)菌濃度變化反映黃酮抑菌的能力.

1)菌懸液制備.選取大腸桿菌、黑曲霉、金黃色葡萄球菌等3種菌作為抑菌試驗(yàn)的對(duì)象，將它們分別接種到已滅菌的裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h .用分光光度計(jì)測(cè)定各種菌懸液在OD600時(shí)的吸光度值.再以初始OD600值為基礎(chǔ)，按比例用無(wú)菌水將三種菌懸液的濃度配制成相同的濃度.配制LB液體培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱(chēng)取各成分：蛋白胨2.5 g，酵母提取物1.25 g，氯化鈉2.5 g，加蒸餾水定容至250 mL，攪拌完全溶解后滅菌待用.

2)瓜蔞葉黃酮抑菌能力測(cè)定.將濃度為0.12 mg/mL的瓜蔞葉黃酮溶液用已滅菌的移液管吸取4 mL，分別移至50 mL已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，以4 mL無(wú)菌水做對(duì)照.在各培養(yǎng)基中接種1 mL待用菌懸液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 h.由于細(xì)菌在LB培養(yǎng)基中37 ℃的條件下培養(yǎng)會(huì)在6 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，在12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，所以選定在15 h時(shí)進(jìn)行測(cè)定以獲得穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù).用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定上述菌懸液在OD600時(shí)的吸光度值，以細(xì)菌前后兩次測(cè)量值的差值計(jì)算細(xì)菌濃度減少的百分比，以此反映一定濃度的瓜蔞葉黃酮溶液在相同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)對(duì)不同細(xì)菌的抑制作用.

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=11.219X+0.002 9，R2=0.997 8(圖1).

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Rutin standard curve

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 固液比對(duì)瓜蔞葉黃酮提取率的影響

由圖2可知，在1∶30到1∶50之間，隨著溶劑比例的增加，黃酮的浸出率迅速上升，當(dāng)固液比為1∶50 時(shí)瓜蔞葉黃酮得率最大.

圖2 固液比對(duì)瓜蔞葉黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of flavonoids from Trichosanthes

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)瓜蔞葉黃酮提取率的影響

由圖3可知，隨著提取時(shí)間的增加，提取率先增加后減少，在1.5 h時(shí)最高.這因?yàn)榉肿訜徇\(yùn)動(dòng)的逐漸劇烈而使黃酮浸出率增加，而后過(guò)于劇烈的分子熱運(yùn)動(dòng)又會(huì)使黃酮類(lèi)化合物逐漸分解，同時(shí)各種雜質(zhì)也相繼加速被溶解出來(lái)導(dǎo)致黃酮的提取率迅速降低.

2.2.3 提取溫度對(duì)瓜蔞葉黃酮提取率的影響

由圖4可知，隨著溫度升高，提取率先增加后慢慢減少，在70 ℃的時(shí)候達(dá)到最佳提取效果，過(guò)高的溫度導(dǎo)致黃酮發(fā)生變化和分解使得提取率下降.

圖3 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of heating time on the extraction rate of flavonoids

圖4 提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of flavonoids

2.2.4 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)瓜蔞葉黃酮提取率的影響

由圖5可知，隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，瓜蔞葉黃酮提取率先增后減，這是由于黃酮與乙醇的極性相近，增大乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)進(jìn)一步增大瓜蔞葉黃酮的浸出率，在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)提取率最高，繼續(xù)增大乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)使?jié)B透壓增大，引發(fā)其他雜質(zhì)的進(jìn)一步溶解，使黃酮提取率下降.

圖5 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of ethanol mass fraction on the extraction rate of flavonoids

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取固液比、提取時(shí)間、提取溫度、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)4個(gè)因素，以瓜蔞葉黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、表3.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表3 方差分析表

*為差異顯著(P<0.05)；**為差異極顯著(P<0.01)

如表2所示，由正交試驗(yàn)后得出的黃酮提取率可知，對(duì)瓜蔞葉黃酮提取率影響程度：提取溫度>乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)>固液比>提取時(shí)間.

由極差分析得到的最優(yōu)組合是A3、B3、C3、D2，即固液比1∶60、提取時(shí)間2 h、提取溫度70 ℃、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%，在此條件下的提取率達(dá)到最大值.

2.4 瓜蔞葉黃酮的抗氧化活性

由圖6可知，瓜蔞葉黃酮的DPPH自由基清除能力與濃度有關(guān)，在試驗(yàn)濃度梯度范圍內(nèi)DPPH自由基清除能力隨黃酮濃度上升而增強(qiáng)，在黃酮濃度達(dá)到0.124 8 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到了74.8%.

曲線(xiàn)前段隨濃度增加清除能力的增強(qiáng)較為緩慢，在曲線(xiàn)的后半段清除能力迅速上升，說(shuō)明高濃度的瓜蔞葉黃酮在抗氧化能力上要比低濃度的效果要好.

圖6 黃酮濃度對(duì)黃酮抗氧化能力的影響Fig.6 Effect of concentration on antioxidant capacity of flavonoids

2.5 瓜蔞葉黃酮抑菌試驗(yàn)

選用最佳組合條件提取的瓜蔞葉黃酮溶液稀釋至100 mL后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，將其濃度固定在0.12 mg/mL左右，探究瓜蔞葉中所含的低濃度黃酮對(duì)于食品中常見(jiàn)的細(xì)菌的抑制作用.從表4的數(shù)據(jù)來(lái)看，該濃度的黃酮溶液對(duì)3種細(xì)菌沒(méi)有明顯的抑制效果，要想達(dá)到理想的抑菌效果或達(dá)到能夠明顯減緩食品因氧化而變質(zhì)的速度的效果，可能還需要大幅度提高黃酮的濃度.

表4 固定濃度黃酮溶液的抑菌效果

3 討論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的結(jié)果可知，提取溫度是決定提取率的最重要因素之一，隨著溫度升高，分子擴(kuò)散速度加快，提取率不斷升高.分析正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)得出的最佳提取溫度在70 ℃，與單因素試驗(yàn)相符.而在提取過(guò)程中，提取時(shí)間對(duì)提取率也有一定影響，根據(jù)正交試驗(yàn)分析，提取時(shí)間為2 h時(shí)提取率最佳.同時(shí)，增大乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)進(jìn)一步增大瓜蔞葉黃酮的浸出率，但當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)到達(dá)60%后，過(guò)高的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)的溶解，使提取率降低.因此，在實(shí)際的工業(yè)化生產(chǎn)中選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的乙醇.由極差分析得到的最優(yōu)固液比為1∶60，而在單因素試驗(yàn)中，最佳固液比1∶50.這可能是由于單因素試驗(yàn)未在其余條件的最佳情況下進(jìn)行，導(dǎo)致固液比升高后提取率降低.所以在實(shí)際的工業(yè)化生產(chǎn)中，采用固液比為1∶60進(jìn)行提取.以上得到的提取瓜蔞中黃酮的最佳提取工藝為后續(xù)瓜蔞葉黃酮生物活性的初步研究提供參考.

目前相較于瓜蔞根、皮、籽粒等，瓜蔞葉的研究與開(kāi)發(fā)尚未引起重視.而事實(shí)上瓜蔞葉具有資源豐富、易于運(yùn)輸保存等優(yōu)勢(shì)，有很大的研究?jī)r(jià)值.本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定抗氧化能力和抑菌能力探究瓜蔞葉在初步物理處理后能否作為天然食品添加劑加入到食品中，使得食品能夠保藏更久.從結(jié)果來(lái)看，瓜蔞葉中黃酮的抗氧化能力較強(qiáng)，作為食品添加劑能夠給食品提供一定的抗氧化能力.但是在抑菌方面，抑菌試驗(yàn)反映出天然的瓜蔞葉黃酮溶液對(duì)3種菌的抑制效果并不理想，還未達(dá)到減緩食品氧化變質(zhì)的效果，想要了解有效抑制濃度或半致死劑量，仍需加大黃酮濃度進(jìn)行下一步研究.要想成功地將瓜蔞葉變?yōu)橐环N天然食品添加劑還需要更多的、更專(zhuān)業(yè)地研究.

4 結(jié)論

以瓜蔞葉黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素結(jié)合正交試驗(yàn)，得到的最佳工藝為：固液比1∶60、提取時(shí)間2 h、提取溫度70 ℃、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%.抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)黃酮濃度達(dá)到0.124 8 mg/mL時(shí)對(duì)2×10-4mol/L的DPPH自由基溶液的清除率達(dá)到了74.8%.在抑菌試驗(yàn)中，天然的瓜蔞葉黃酮溶液對(duì)金黃色葡萄球菌、黑曲霉菌、大腸桿菌的抑菌率分別為22.5%、17.1%、36.3%.