黃金智，洪龍年，陳惠娟，譚曉瑜，張玲莉* （.廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東湛江5400；.廣東醫(yī)科大學，廣東湛江 5403）

腹腔鏡手術因其創(chuàng)傷小、康復快、住院時間短等優(yōu)點，目前已成為婦科最常用的微創(chuàng)手術方式，越來越多地被用于婦科良惡性腫瘤的診斷與治療，但是對于腹腔鏡應用過程中CO2氣腹是否會促進惡性腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移目前仍存在一些爭議。前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CO2氣腹處理的裸鼠，其卵巢癌移植瘤的分布面積更廣、數(shù)量更多、總質(zhì)量更大，且隨著CO2氣腹處理時間的延長該效應更明顯[1]。尿激酶型纖溶酶原激活(uPA)系統(tǒng)在惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。本文采用免疫組化、real-time PCR和western blotting檢測裸鼠卵巢癌移植瘤組織中uPA、uPAR、PAI mRNA和蛋白質(zhì)的表達水平，觀察CO2氣腹對這3個基因表達的影響，以探討CO2氣腹影響卵巢癌生長轉(zhuǎn)移的可能機制。

1 材料和方法

1.1 裸鼠卵巢癌移植瘤組織切片及新鮮組織

裸鼠卵巢癌移植瘤組織切片來自本實驗室前期收集的裸鼠卵巢癌移植瘤組織蠟塊，切片制備；新鮮組織為前期收集，經(jīng)液氮速凍30 min，以錫箔紙包裹凍存于－86 ℃超低溫冰箱的組織。卵巢癌移植瘤模型造模過程簡述如下：7～8周齡，雌性Balb/c裸鼠予腹腔注射0.5 mL的2×106卵巢癌細胞株SKOV3細胞懸液，造模后裸鼠隨機分為對照組、開腹組、CO2氣腹0.5 h組、CO2氣腹1 h組，每組10只。對照組裸鼠僅接受麻醉處理；開腹組裸鼠麻醉后，沿腹中線開2 cm切口，30 min后關閉腹腔；CO2氣腹0.5 h和CO2氣腹1 h組：裸鼠麻醉后，分別給予腹腔CO2通氣30、60 min(將2根鈍頭注射針分別從裸鼠左右下腹插入腹腔，其中一根注射器連接CO2鋼瓶，輸入氣體壓力為5 mmHg，氣流量為0.1 L/min，另一根用于排出CO2，通氣結(jié)束后拔除注射針，以輸液貼覆蓋針孔)。4組裸鼠均于造模后12周處死并取瘤體組織。

1.2 免疫組化

按照二步法免疫組化檢測試劑盒(PV-6002，中杉金橋)的操作說明進行，抗原修復采用高壓修復法，即將脫蠟水化后的組織切片放入煮沸的檸檬酸緩沖液中，高壓鍋加熱噴氣2 min后停止，自然冷卻至室溫； 一抗uPA抗體(sc-14019)、uPAR抗體(sc-13522)和PAI-1抗體(sc-5297)的稀釋度均為1:50，4 ℃孵育過夜；以DAB顯色試劑盒(ZLI-9017，中杉金橋)進行顯色，蘇木素復染2 min，剃度酒精依次脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察；以PBS代替一抗作為陰性對照。免疫組化結(jié)果判斷：陽性蛋白染色因表達強度不同可在鏡下呈現(xiàn)未著色(與背景相近)、淺黃色(略高于背景)、棕黃色(中度著色)和棕褐色(深度著色)，分別計為0、1、2、3分；其中1～3分均為陽性細胞，隨機取5個高倍視野，計算陽性細胞比例，陽性細胞比例<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%分別計為0、1、2、3、4分；兩種計分相加，總分為0～1、2～3、4～5、6～7分分別表示陰性、弱陽性(-/+)、中等陽性(++)和強陽性(+++)。

1.3 總RNA提取

以液氮研磨方式磨碎組織，然后按照RNAiso Plus試劑盒(D9108A，TAKARA)的操作說明提取總RNA，以1%瓊脂糖電泳判斷RNA完整性，并用紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度(OD260/OD280為1.8～2.0)。

1.4 實時熒光定量PCR(real-time PCR)

每個樣本取1 μg提取的總RNA，采用Prime?Script RT reagent kit with gDNA Eraser (RR047A，TAKARA)試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄：37 ℃ 15 min→85 ℃5 s→4 ℃ 1 h。采用實時熒光定量PCR檢測試劑盒SYBR? Premix Ex Taq?II(RR820A，TAKARA)和LightCycler?480 System Real Time PCR擴增儀進行擴增，擴增程序為：95 ℃ 30 s→95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s(40個循環(huán))→95 ℃ 5 s→60 ℃ 1 min→50 ℃ 30 s→4 ℃ 1 h。以2-ΔΔCt計算目的基因mRNA的相對表達量。擴增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如下：

1.5 總蛋白提取

每個樣本取100 mg組織，剪碎放入預冷的玻璃勻漿器，加入500 μL細胞裂解液RIPA(含1 mmol/L的PMSF)，冰上勻漿，將勻漿液吸入離心管，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，然后將上清轉(zhuǎn)移至干凈的離心管，用Bradford蛋白定量試劑(BB-3411，貝博生物)測試蛋白濃度，提取的總蛋白分裝，保存于－80℃冰箱備用。

1.6 western blotting

每組取等量混合蛋白樣本70 μg，用十二烷硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白條帶，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉溶液封閉膜，分別孵育一抗uPA、uPAR和PAI-1抗體和內(nèi)參GAPDH抗體(sc-47724)，二抗(辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠二抗A0216購自碧云天公司)，采用ECL化學發(fā)光法進行檢測，凝膠成像系統(tǒng)采集蛋白條帶發(fā)光圖像信息，經(jīng)灰度掃描分析。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

由圖1所示，uPA和PAI-1蛋白的陽性表達主要定位于卵巢癌細胞質(zhì)中，uPAR蛋白的陽性表達主要定位于卵巢癌細胞膜中。與對照組及開腹組比較，CO2氣腹0.5 h和CO2氣腹1 h組可以增加卵巢癌移植瘤組織中的uPA、uPAR和PAI的陽性表達水平，且CO2氣腹1 h的表達水平更高，但組間比較差異均沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖1 免疫組化圖(200×)

圖2 uPA、 uPA 和PAI在4組卵巢癌組織中表達強度的比較

2.2 Real-time PCR結(jié)果

由圖3所示，與對照組和開腹組相比，CO2氣腹0.5 h和CO2氣腹1 h組均能明顯促進卵巢癌移植瘤組織中的uPA、uPAR和PAI的mRNA表達水平(P<0.05)。CO2氣腹1 h組的uPA、uPAR和PAI mRNA表達水平雖略高于CO2氣腹0.5 h組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 Western blotting結(jié)果

與對照組和開腹組相比，CO2氣腹0.5 h和CO2氣腹1 h組均能明顯促進卵巢癌移植瘤組織中的uPA、uPAR和PAI的蛋白表達(P<0.05)。uPA在CO2氣腹1 h組的蛋白表達水平略低于CO2氣腹0.5 h組，uPAR和PAI則高于CO2氣腹0.5 h組，但兩組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4、5。

圖3 CO2氣腹對裸鼠卵巢癌移植瘤中uPA、uPAR、PAI-1 mRNA表達水平的影響

圖4 CO2氣腹對裸鼠卵巢癌移植瘤中uPA、uPAR、PAI-1蛋白表達水平的影響

圖5 不同組間uPA、uPAR、PAI-1蛋白表達水平的比較

3 討論、論

近20年來，腹腔鏡手術因其手術損傷小出血量少、術中視野開闊清晰、患者恢復快、痛苦少、住院時間短等優(yōu)點，越來越多地被用于婦科良惡性腫瘤的診治，如子宮肌瘤、早期子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、早期卵巢癌等，但是有研究表明，腹腔鏡手術用于惡性腫瘤診治時，會增加腫瘤轉(zhuǎn)移的風險，與開腹手術組相比，腹腔鏡手術組早期宮頸癌患者的無病生存率和總生存率均低，且研究認為這與腹腔鏡手術過程中使用的CO2氣腹相關[2]。在前期研究中，我們用卵巢癌移植瘤裸鼠模擬CO2氣腹，發(fā)現(xiàn)同對照組與開腹組相比，CO2氣腹處理組裸鼠的腫瘤數(shù)量更多、腫瘤體積更大、分布部位更廣[1]，但其機制并不清楚。研究顯示CO2氣腹可能通過對腹腔產(chǎn)生的機械壓力，局部干冷、缺氧的環(huán)境導致腹腔pH降低，進而抑制腹腔巨噬細胞功能，下調(diào)免疫功能，對腫瘤細胞的殺傷力大為減弱,從而導致腫瘤細胞的粘附、增殖，而缺氧環(huán)境又能誘導腫瘤細胞內(nèi)多種細胞因子的表達，從而增加腫瘤細胞的增殖、侵襲能力[3]。

uPA是缺氧誘導產(chǎn)生的一種細胞因子，它是一種絲氨酸蛋白水解酶，主要與細胞分化、遷移、組織重建、細胞周圍基質(zhì)降解有關，通過與uPAR 結(jié)合發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)多種惡性腫瘤細胞，包括卵巢癌細胞，可以分泌uPA。美國一項研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌uPA水平增高與患者預后相關，因而提出uPA可以作為危險評估因子和治療靶點[4]。uPA與uPAR結(jié)合后轉(zhuǎn)化為有活性的uPA-uPAR，從而使纖溶酶原(plasminogen)激活成纖溶酶(plasmin)，可激活前基質(zhì)金屬蛋白酶(proMMP)，從而激活 proMMP 引起膠原的降解；纖溶酶還可以通過增加血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的活性刺激血管的生成。另外，uPA/uPAR不僅能增強蛋白溶解，調(diào)節(jié)細胞黏附，還能促進體內(nèi)腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管生成[5]。

PAI屬絲氨酸抑制因子家族，目前已知有PAI-1、PAI-2、蛋白酶nexin、蛋白酶C抑制劑(PCI)4種。PAI-1是有效的特異性uPA抑制劑，在生理條件下對uPA有極高的親和力。PAI-1不僅能結(jié)合可溶形式的uPA，還可以結(jié)合已與受體結(jié)合形式的uPA，從而抑制纖溶酶原的激活。uPA-PAI-1復合物的水平增高的乳腺癌患者預后不良，并影響患者的存活率[6]?；|(zhì)中uPA/PAI-1蛋白的協(xié)同表達則預示著乳腺癌患者較差的結(jié)局。uPA、uPAR、PAI常以一個相互作用的調(diào)控系統(tǒng)維持了纖溶酶系統(tǒng)的平衡狀態(tài)，維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，參與諸如細胞增殖、粘附、移動等活動。

因此，在本研究中我們采用了免疫組化、realtime PCR和western blotting檢測了裸鼠移植瘤組織中的uPA、uPAR、PAI基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)無論是mRNA水平還是蛋白水平，CO2氣腹處理組均高于開腹組和對照組，提示CO2氣腹處理有可能通過促進uPA、uPAR、PAI的表達促進卵巢癌的生長與轉(zhuǎn)移。

有研究證實在缺氧環(huán)境中uPA的表達會上調(diào)[7]。而CO2氣腹所致的高氣腹壓會導致腹腔暫時缺血、缺氧；同時CO2氣體具有組織低溶性，血液高溶性的特點，易致血液pH值下降，造成高碳酸血癥甚至酸中毒，在酸性環(huán)境中，腹腔局部血供減慢，進一步加重局部缺血缺氧，這可能就是CO2氣腹引起該軸表達上調(diào)的原因。uPA、PAI的表達與缺氧誘導因子1(HIF-1)高度相關，HIF-1是缺氧刺激激活的一種重要的轉(zhuǎn)錄因子[8-9]。這可能也是本研究中CO2氣腹處理組裸鼠移植瘤中uPA、uPAR、PAI表達升高的原因，但是其具體的分子機制還有待進一步的研究。