王暄 陳海霞

（湖南農業(yè)大學園藝學院，長沙 410128）

腺苷三磷酸結合盒轉運蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC轉運蛋白）家族龐大，種類眾多，是現存生物體中發(fā)現的最大的蛋白質家族之一。ABC轉運蛋白廣泛分布于原核及真核生物中，其主要是通過結合并水解ATP釋放能量實現底物的跨膜運輸，其轉運的底物主要包括肽、糖類、氨基酸、金屬離子、生物堿、維生素、無機有機分子、谷胱甘肽和細胞代謝產物等［1］。底物的多樣性促使了ABC轉運體參與植物眾多的生理過程，如維持細胞滲透穩(wěn)態(tài)，對毒物的富集及外排、木栓化的形成、抵抗生物和非生物脅迫以及植物營養(yǎng)攝入、脂質穩(wěn)態(tài)、信號轉導、病毒防御及抗原呈遞等［2］，從而引起國內外研究者的廣泛關注。根據ABC轉運蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析、核苷酸結合區(qū)域（Nucleotidebinding domains，NBDs）序列的相似性及結構域的組織形式，將該家族劃分為ABCA-ABCG 及ABCI 8個亞家族［3］，其中ABCB目前是第二大亞族，僅次于ABCG亞族。盡管通?？梢愿鶕参锏膩喛瞥蓡T預測植物ABC轉運蛋白的功能，但事實上許多植物的能力與其預測的功能存在不同，甚至不同于最相關序列的性質。近年來的研究表明，ABCB亞族參與了許多關鍵生理過程，如氣孔的開合、根的發(fā)育、植物激素的運輸、液泡對毒性物質的富集和次生代謝產物分泌。

1 ABCB轉運蛋白的結構組成

ABC 轉運蛋白因含有 ATP 結合框而得名，即核苷酸結合結構域（Nucleotide-binding domain，NBD）［4］。植物ABCB轉運蛋白具有能夠編碼125-140 kD蛋白質的開放閱讀框［5］，其包含核苷酸結合區(qū)域（Nucleotide-binding domains，NBDs）和跨膜結合區(qū)域（Transmembrane domains，TMDs），其中親水性的NBDs結構和序列在ABC轉運蛋白家族中高度保守，包含3個保守的基序：“Walker A”，“Walker B”和“ABC標簽序列”（又稱Walker C）［5］。其中ABC標簽序列約有120個氨基酸殘基，位于Walker A 序列和Walker B序列之間［6-7］。每一個NBD結構域分為2個子域，分別為核心結構域和α-螺旋結構域，包括上述的Walker A和Walker B序列、ABC蛋白特異位點，以及較不保守的H loop和Q loop［8］。相對于保守的NBDs結構域，ABCB轉運蛋白的TMDs的結構、長度與序列呈現多樣性，B亞族的TMDs是含有6個跨膜α-螺旋的疏水跨膜結構域，形成了溶質跨膜的通道；NBDs結構域負責結合ATP，并水解ATP使其構象發(fā)生改變，從而激活轉運過程，而TMDs結構域則形成通道使得底物通過脂質雙分子層，二者的協調作用最終實現了物質的轉運［9］。

功能表征ABCBs的計算模型已經表明，擬南芥AtABCB4，AtABCB14和AtABCB21具有N端盤繞線圈結構。AtABCB4中第4個跨膜螺旋的疏水區(qū)域位于膜平面之下，它的連接結構域含有另一個卷曲螺旋結構［10］。3種擬南芥ABCB轉運蛋白（AtABCB4，AtABCB14和AtABCB19）的底物對接分析在AtABCB19和AtABCB4 TMD中分別顯示了2個和3個推定的IAA結合位點，以及AtABCB14 TMD中的非特異性IAA對接［11］。

2 ABCB轉運蛋白的分類與性質

ABC轉運蛋白結構域組織形式多樣，根據蛋白的大小分為全分子轉運蛋白、半分子轉運蛋白和可溶性轉運蛋白3類［12］。植物ABCB轉運蛋白在此基礎上有幾種根據結構與性質的命名方案，目前通用的是 Sánchez-Fernández subfamily 體系［13］中的 MDR（Multidrug resistance）、TAP（Transporter associated with anatigen processing）和ATM（ABC transporter of the mitochondria）的命名方式。植物ABCB轉運蛋白亞家族目前包括全分子轉運蛋白和半分子轉運蛋白兩大類，以人和酵母中ABCB蛋白的結構域和序列同源性為原型來定義分類［14］，其中全分子轉運蛋白家族（MDR，multidrug resistance protein，多藥耐藥性蛋白，PGP/ p-glycoprotein）的結構域以正向方式TMD-NBD-TMD-NBD形式排列在一條多肽分子上［8］，即（TMD-NBD）2；半分子ABCB轉運蛋白是由1個TMD結構域與1個NBD結構域融合以形成1個（TMD-NBD）單元，并且通過約由60個氨基酸組成的連接肽與另一個同源的TMD-NBD單元連接，單個多肽的4個核心結構域都是連續(xù)的，這種模塊化結構提高了ABCB轉運蛋白結合和運輸不同類別化合物的可能性。值得一提的是相對于ABC轉運蛋白其他亞家族，ABCB亞家族半分子轉運蛋白擁有線粒體ABC轉運蛋白（ABC transporter of the mitochondria，ATM）和抗原肽相關運載蛋白體（Transporter associated with antigen proccssing，TAP）兩種形式，TAP在結構上比ATM多一個雙親信號肽（表1）。ATM可編碼線粒體蛋白是所有ABC轉運蛋白亞家族中成員最少的，目前在擬南芥中僅發(fā)現3個［15］。而對TAP的研究較少，在擬南芥中存在該亞組基因可調節(jié)重金屬抗性［16］。也發(fā)現屬于該亞族的半分子轉運蛋白與細菌基因組中的ABC轉運蛋白具有同源性［17］。近幾年，有研究發(fā)現，植物ABCB亞家族在番茄等作物中也存在除全分子蛋白和半分子蛋白以外的結構，如番茄SLABCB19基因的結構域排列為NBD-TMD-NBD；甚至存在僅有一個NBD結構域（SLABCB27等）的基因［18］。

表1 植物ABCB轉運蛋白亞家族的劃分及結構示意圖

擬南芥［19］、水稻［20］、番茄［18］、油菜［21］、玉米［22］、葡萄［23］及百脈根［24］的全基因組測序結果表明其分別有 29、27、29、69、31、28和 15個 ABCB轉運蛋白（表2）。徐杏等［20］鑒定了水稻中27個B亞族基因，OsABCB23等4個B亞族基因屬于半分子轉運蛋白；其他的ABCB亞族成員屬于全分子轉運蛋白。核苷酸結合域 NBD的5個基序中 Walker A、Walker B和ABC域基序均高度保守，而Q環(huán)和H環(huán)的保守性略差；跨膜結構域TMD在同一蛋白內和不同蛋白之間沒有明顯的保守性，并且水稻ABCB基因在組織器官中具有明顯的表達特異性。擬南芥ABC轉運蛋白B亞家族有22個全分子蛋白和7個半分子蛋白；在組織器官表達主要集中在莖節(jié)的第2節(jié)、吸脹的種子、根、幼嫩的葉片、蓮座葉、花器官的萼片和枯萎的葉片中［25］。此外，通過蛋白相互作用網絡預測發(fā)現亞族蛋白之間有相互作用［26］。McFarlane等［27］也證實了亞族蛋白之間可以形成異源二聚體從而發(fā)揮功能，異源二聚體的形成，不僅存在于各個亞族內部之間，而且更多的是存在于各個亞族之間，使功能更加多元化。

表2 部分植物ABCB轉運蛋白亞家族成員比較

3 ABCB轉運蛋白的功能

3.1 提高植物重金屬耐性

植株體內的重金屬離子會導致植物膜細胞膜脂分子變化，在脅迫下積累滲透調節(jié)物脯氨酸，產生膜脂過氧化產物丙二醛［28］，影響植物正常代謝活動，甚至導致植物死亡。在模式植物擬南芥中已經陸續(xù)發(fā)現一些半分子ABCB轉運蛋白基因，它們表現出對重金屬鎘、鋁及鐵的耐受性。Kim等［29］通過基因表達分析發(fā)現半分子轉運蛋白AtATM3在用鎘處理后的植物的根中上調表達，從而驗證了該基因涉及重金屬耐受性?？傊?，該研究顯示AtATM3有助于鎘抗性，并表明它可能介導線粒體膜上鎘的轉運。植物積累的金屬離子會破壞細胞的離子穩(wěn)態(tài)，為了盡量減少重金屬暴露及其積累的有害影響，植物進化出了解毒機制，這些機制主要基于螯合和亞細胞區(qū)域化，而重金屬螯合是一種普遍存在于多種植物中的解毒策略［30］。此后，Larsen等［31］運用圖位克隆等方法，也從擬南芥als1-1突變體分離鑒定出另一個半分子ABCB轉運蛋白AtABCB27/AtTAP2，并且在鋁（Al3+）處理條件下，該基因根部的表達量明顯上調；als1-1突變體則生長受抑，根長顯著低于野生型；另外利用ICP-OES分析經過25 μm AlCl3處理的野生型和als1-1突變體根部的Al3+累積量，結果表明這兩者之間并無顯著差異；亞細胞定位顯示該蛋白定位于植物的根尖液泡膜及脈管系統(tǒng)，進而推測其可能將Al以螯合肽結合物的形式轉運至液泡中，并區(qū)隔起來，提高植物重金屬耐性。

研究發(fā)現了半分子ABCB轉運蛋白基因AtATM1，AtATM2和AtATM3與酵母線粒體膜蛋白ATM1（ScATM1）同源，所以推斷其涉及線粒體合成的鐵/硫簇合物的輸出［32］。在3種擬南芥ATM型的ABCB轉運蛋白中，AtATM3與ScATM1功能最接近。異源表達的AtATM3能夠消除線粒體中的鐵超累積并恢復線粒體呼吸功能以及細胞色素c的水平。相比之下，AtATM1只是輕微抑制，而AtATM2幾乎沒有抑制作用，在該系統(tǒng)中表達時甚至具有毒性。隨著研究的深入，Teschner等［33］研究又發(fā)現ABCB轉運蛋白AtABCB25/ATM3還存在涉及線粒體鐵硫蛋白成熟以外的新功能。分析數據表明，該基因在鉬輔因子（Moco）的生物合成中具有關鍵作用。Moco是多數酶（如硝酸還原酶、亞硫酸鹽氧化酶、黃嘌呤脫氫酶和醛氧化酶）所需要的一個基團。在擬南芥ATM3插入突變體中，硝酸還原酶和亞硫酸鹽氧化酶的活性降低到了50%。試驗證明了在擬南芥ATM3減少突變體中，鉬酶活性和蛋白水平下降。還有研究表明苦蕎FtABCB1基因在重金屬鉛的脅迫下在根、莖和葉中均上調表達［34］。

3.2 參與植物生長素調控

生長素主要在幼嫩的葉片和根系中合成，它極性運輸對植物的正常生長發(fā)育至關重要。生長素合成量或運輸異常，都會引起植株發(fā)育受阻甚至矮化［35］。1992年，Dudler等［36］克隆出了植物中的第一個MDR型基因AtABCB1/AtPGP1，證實其在植物的生命活動中發(fā)揮作用。Ma等［37］首次對蘋果進行ABCB家族基因的鑒定與表達分析，確定了ABCB1及ABCB19是兩個生長素輸出載體基因，可以參加蘋果的生長素運輸和植株高度調控。在M106的嫩枝中，它們的表達水平高于M9（蘋果矮化砧木）的嫰枝，推測 ABCB19 參與了抑制矮化砧木 M9 生長素的向基運輸進而導致的矮化過程。隨后，宋春暉等［38］以蘋果矮化砧木為材料克隆出與梨、油菜和擬南芥的ABCB19基因高度同源的基因，名為 MdABCB19。該基因在頂梢中表達量最高，在喬化砧木各器官的表達量顯著高于矮化砧木M9。MdABCB19啟動子的活性在光照環(huán)境下高于黑暗環(huán)境，表明MdABCB19的轉錄受光調控。在地上部，光形態(tài)建成基因COP1通過控制生長素運輸基因PIN1的轉錄來調節(jié)生長素的運輸，從而適當地調節(jié)根部生長素的水平［39］。鑒于ABCB19和PIN1的蛋白互作關系，MdABCB19可能也參與光照條件下生長素的運輸。后來隨著粟酒裂殖酵母系統(tǒng)的開發(fā)［11］，可以實現重組蛋白的功能分析和亞細胞定位?？烧T導nmt41啟動子下的mam1pdr1宿主系中表達了擬南芥ABCB1和ABCB19，且ABCB19顯示出比ABCB1更高的3H-IAA外排活動。隨后研究表明了擬南芥生長素轉運體ATABCB19在NPA（通過抑制植物生長素極性轉運，引起植物的異常生長發(fā)育）抑制生長素誘導的下胚軸向性中起重要作用［40］。通過突變ABCB19，證明了生長素運輸對核內循環(huán)的影響，與弱光下擬南芥幼苗下胚軸伸長速率有定量關系［41］。AtABCB19是AtABCB1最相似的基因并且存在功能冗余性，因為擬南芥atabcb1/abcb19雙突變體中出現了因為生長素運輸缺陷而植株矮化的現象［42］。對ABCB19和綠色熒光蛋白的轉錄和翻譯融合的檢測表明，切除根部，誘導了ABCB19的積累，使生長素聚集，從而導致不定根的形成［43］。水稻OsABCB14與擬南芥AtABCB19是同源基因［20］，該基因受生長素誘導在維管組織中強烈表達，證實參與生長素極性運輸［44］。

擬南芥ABCB轉運蛋白B4ABCB4是細胞生長素水平的底物活化調節(jié)劑，是一種根本定位的生長素外排轉運蛋白，其生物素攝取活性低，生物素濃度低［45］。ABCB4對根尖的生長素運動的作用隨著生長素濃度的增加而增加，但是在根毛長度測定中，發(fā)現ABCB4的表達對生長素濃度的變化相對不敏感，在低濃度生長素下也是明顯表達。AtABCB4被認為是底物激活的細胞生長素水平調節(jié)因子，調控細胞內的生長素水平［46］。同樣，與AtABCB4相似的同源蛋白AtABCB21，在子葉的背軸側和地上部位的交界處有較強的表達，而在根中主要在周細胞中表達。ABCB21作為兼性的輸入/輸出蛋白，控制植物細胞中生長素的濃度［47］。越來越多的報告證實更多的ABCB轉運蛋白，如AtABCB11/MDR8、AtABCB14/MDR12和AtABCB15/MDR13都存在相似功能［12，45］。

3.3 參與調節(jié)植物氣孔開合

ABCB轉運蛋白AtABCB14在向高濃度的二氧化碳（CO2）過渡時會調節(jié)氣孔閉合。在AtABCB14缺乏的植物中，高二氧化碳水平導致氣孔關閉加快［48］。在只含有保衛(wèi)細胞的分離表皮條帶中，缺失AtABCB14的植株與過表達AtABCB14的植株相比，蘋果酸依賴的氣孔閉合速度更快，而過表達AtABCB14的植株比野生型植株慢，這表明AtABCB14催化蘋果酸鹽從質外體轉運到保衛(wèi)細胞。當AtABCB14在大腸桿菌和HeLa細胞中異源表達時，觀察到蘋果酸轉運活性的增加。因此推測AtABCB14通過將蘋果酸從質外體轉運到保衛(wèi)細胞中調節(jié)氣孔運動，從而增加其滲透壓。

4 總結與展望

隨著對于ABC轉運蛋白家族的不斷深入研究，也發(fā)現了許多植物中存在ABCB轉運蛋白。從水生植物到陸生植物的一些遺傳學研究表明，ABC轉運蛋白家族的復雜性是隨著生長素調控的發(fā)展而出現的［49］。其中ABCB轉運蛋白參與植物的多種生理代謝活動，但由于其家族的龐大，轉運機制復雜多樣，成員間存在同源或異源互作，尚有很多ABCB轉運蛋白未能深度探索。需要我們進一步深入分析在植物生命活動中發(fā)揮作用的ABCB轉運蛋白。未來隨著更多的植物完成基因組測序，我們可以有更廣泛的植物類型作為研究對象，結合分子生物學技術揭示其在不同生命活動和逆境生理中的重要作用。在過去的研究中，關于ABC轉運蛋白的研究主要集中在其特異性底物的鑒定，日后可以利用蛋白質組學和細胞生物學等方法深入解析ABCB轉運蛋白的跨膜運輸機制，并進一步確定其轉運的底物類型。最終我們運用基因工程的方法將具有重要應用價值的ABCB蛋白基因轉入受體中，從轉化細胞中篩選新類型，培育新品種來攻克一些遺傳缺陷難題，充分利用這類轉運蛋白以提高植物生產力和質量。