張萌 羅芳 王敏 武彥澤 王俊奎 和東遷 陳麗堯 陶金忠

（1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2. 內(nèi)蒙古圣牧控股有限公司，巴彥淖爾 015000；3. 寧夏上陵牧業(yè)有限公司，青銅峽 751600）

圍產(chǎn)期是從產(chǎn)前3周到產(chǎn)后3周，這個(gè)階段奶牛機(jī)體代謝發(fā)生巨大的變化［1］。主要體現(xiàn)在隨著分娩的臨近，奶牛干物質(zhì)的攝入不能滿足自身能量消耗，從而導(dǎo)致奶牛負(fù)能量平衡（Negative energy balance，NEB）［2］。NEB 損害奶牛的健康和影響生產(chǎn)，并導(dǎo)致免疫力下降［3］。當(dāng)奶牛發(fā)生NEB時(shí)通常引起脂肪肝和酮?。?］，而這兩種疾病均能造成肝功能的損傷［5-6］。肝臟是能量代謝的主要器官，奶牛體內(nèi)的糖代謝主要來自于肝臟糖異生［7］。天冬氨酸（Aspartic acid，ASP）、組氨酸、蛋氨酸、脯氨酸和絲氨酸的濃度在患有酮癥的奶牛中下降［8］。這些氨基酸的濃度降低，因?yàn)樗鼈冊谔钱惿^程中被大量使用［9-10］。而在分娩后的幾天內(nèi)，乳腺對葡萄糖、氨基酸和脂肪的需求量成倍增加，肝臟糖異生和脂肪動(dòng)員的速度大大加快［11-12］。因此，奶牛分娩后血漿代謝物發(fā)生顯著變化，影響奶牛的健康。代謝組學(xué)是一種高通量、高靈敏度的現(xiàn)代分析技術(shù)。目前，代謝組學(xué)方法已成功地應(yīng)用于奶牛產(chǎn)后血漿生物標(biāo)志物的篩選［13］。

為此，本研究通過對分娩當(dāng)天和產(chǎn)后第7天血漿代謝組學(xué)研究，探究分娩后早期奶牛血漿代謝物的變化情況，探討分娩后血液代謝組變化，旨為了解分娩后血漿代謝物變化對奶牛健康狀況提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)儀器和設(shè)備 超高效液相：1290 UHPLC（美國Agilent公司）；高分辨質(zhì)譜1：QTOF 6550（美國Agilent公司）；高分辨質(zhì)譜2：Triple TOF 6 600（AB Sciex）；天平：BSA124S-CW（Sartorius）；研磨儀：JXFSTPRP-24（上海凈信科技有限公司）；超聲儀：PS-60AL（深圳市雷德邦電子有限公司）；純水儀：明澈D24 UV（Merck Millipore）；色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm 2.1×100 mm（Waters）。

1.1.2 試驗(yàn)材料和試劑 醋酸銨（CNW Technologies）；乙腈（CNW Technologies）；氨水（CNW Technologies）；甲醇（CNW Technologies）；L-2-氯苯丙氨酸（上海恒柏生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組和血液的采集保存 在寧夏某大型集約化奶牛場，選擇15頭2-3胎、預(yù)產(chǎn)期和體況相近（體況評分BCS 3.0-3.5）的健康荷斯坦奶牛，奶牛奶產(chǎn)量（分娩當(dāng)天由于采集初乳無法統(tǒng)計(jì)）和胎次的均值±SD，見表1。分別在分娩當(dāng)天（A組）和產(chǎn)后第7天（B組）晨飼前（5：00-6：00）尾靜脈采集血液10 mL，使用肝素鈉抗凝，并以3 000 r/min離心10 min進(jìn)行分離，收集上層血漿于冷凍管中，標(biāo)記后置于-80℃冰箱冷凍保存，以備后續(xù)分析。

表1 奶牛奶產(chǎn)量和胎次

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 代謝物提取 參照張萌等［14］的代謝物提取方法。

1.2.2.2 上機(jī)檢測 使用的色譜柱為購自Waters的UPLC BEH Amide 色譜柱（1.7 μm×2.1×100 mm）。進(jìn)樣體積為2 μL。按照表2中的流動(dòng)相參數(shù)在安捷倫1290超高效液相控制下進(jìn)行分析。

表2 液相色譜流動(dòng)相條件

控制軟件（Analyst TF 1.7，AB Sciex）控制下AB 6600 Triple TOF & Agilent 6550 QTOF質(zhì)譜儀基于IDA功能進(jìn)行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。每個(gè)數(shù)據(jù)循環(huán)采集中，篩選出強(qiáng)度最強(qiáng)且大于100的分子離子進(jìn)行采集對應(yīng)的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。轟擊能量：30 eV，每50 ms15張二級譜圖。ESI離子源參數(shù)設(shè)置如下：溫度：650℃，輔助氣壓：60 Psi，氣簾氣壓：35 Psi，霧化氣壓（GS1）：60 Psi，噴霧電壓：5 000 V（正離子模式）或-4 000 V（負(fù)離子模式）。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件處理，將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成mzXML格式。采用XCMS程序?qū)D(zhuǎn)化后數(shù)據(jù)進(jìn)行峰對齊、提取峰面積和峰積分等處理工作。檢查數(shù)據(jù)的完整性和缺失值狀況，補(bǔ)充或刪除數(shù)據(jù)中的極值和數(shù)據(jù)中組內(nèi)缺失值大于50%的離子峰。內(nèi)標(biāo)校正和歸一化處理數(shù)據(jù)，使得代謝物之間和各樣本之間均可以進(jìn)行平行比較。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SIMCA軟件對處理后數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識別和Pareto-scaling預(yù)處理。對處理后數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，無監(jiān)督主成分分析（Principal component analysis，PCA），正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。構(gòu)建表達(dá)模型，并對模型中的數(shù)據(jù)進(jìn)行置換檢驗(yàn)（Permutation test），計(jì)算根據(jù)OPLSDA模型得到變量投影重要度（Variable importance in the projection，VIP）。對數(shù)據(jù)進(jìn)行單變量統(tǒng)計(jì)分析包括：變異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）和Students t-test分析。

1.2.5 差異代謝物鑒定和生物學(xué)信息學(xué)分析 經(jīng)過多元統(tǒng)計(jì)分析得到VIP大于1的值，用產(chǎn)后第7天均值比上分娩當(dāng)天均值得到FC值，結(jié)合P值。以VIP>1初步篩選出各組間的差異物，單變量統(tǒng)計(jì)分析P<0.05和FC>1.3或FC<0.77進(jìn)一步篩選顯著性差異代謝物。顯著性差異代謝物使用Origin 8.0進(jìn)行ROC Curve分析得到AUC面積大于0.8的代謝物。將篩選出的顯著性差異代謝物在線分析平臺MetaboAnalyst進(jìn)行聚類分析和代謝通路分析。

2 結(jié)果

2.1 代謝譜分析

由圖1可知，QC樣本TIC出峰保留時(shí)間和峰面積都重疊很好，表明在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中儀器穩(wěn)定性很好。由圖2可知，QC樣本相關(guān)性越接近于1，說明整個(gè)方法穩(wěn)定性越好數(shù)據(jù)質(zhì)量越高。QC樣本相關(guān)性很高，表明數(shù)據(jù)質(zhì)量很高。

2.2 多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、

由圖3可知，對分娩當(dāng)天（A組）和產(chǎn)后第7天（B組）的PCA分析，觀察所有樣本之間的總體分布趨勢，表明正、負(fù)離子模式數(shù)據(jù)下A組和B組有一定的分離趨勢。由圖4可知，建立A組和B組的OPLS-DA模型，得到的模型評價(jià)參數(shù)正離子模式R2Y=0.959和負(fù)離子模式R2Y=0.973。R2越接近1表明模型越穩(wěn)定可靠，本試驗(yàn)正負(fù)離子均R2Y≥0.95，表明模型穩(wěn)定可靠。由圖5可知，顯示了基于正、負(fù)離子模式數(shù)據(jù)兩組OPLS-DA模型的置換檢驗(yàn)圖，正、負(fù)離子模式數(shù)據(jù)置換檢驗(yàn)截距，分別是Q2=-

0.340（正離子模式）和Q2=-0.329（負(fù)離子模式）。Q2intercept<0說明本試驗(yàn)正、負(fù)離子模式數(shù)據(jù)建立的OPLS-DA模型均未發(fā)生過度擬合。

2.3 差異代謝物的篩選

以 VIP>1、P<0.05、FC>1.3或FC<0.77進(jìn)一步篩選顯著性差異代謝物。分娩當(dāng)天和產(chǎn)后第7天兩組共篩選出17種顯著性代謝物。正離子模式下篩選出9個(gè)顯著性差異代謝物，其中4個(gè)代謝物產(chǎn)后第7天顯著低于分娩當(dāng)天組，5個(gè)代謝物產(chǎn)后第7天顯著高于分娩當(dāng)天組（P<0.05）。負(fù)離子模式下篩選出8個(gè)顯著性差異代謝物，其中2個(gè)代謝物產(chǎn)后第7天顯著低于分娩當(dāng)天組，6個(gè)代謝物產(chǎn)后第7天顯著高于分娩當(dāng)天組（P<0.05）。正、負(fù)離子模式下鑒定出的差異代謝物見表3。

2.4 生物信息學(xué)分析和生物標(biāo)記物篩選

利用ROC曲線對顯著性差異代謝物進(jìn)行分析篩選，考察這些顯著性差異代謝物的分類識別能力。當(dāng)ROC曲線下的面積（Area under curve，AUC）大于0.5識別能力較好，AUC值越接近于1，識別效果越好。如圖6，結(jié)果顯示A組和B組共有11個(gè)代謝物AUC面積在0.8以上。篩選出11個(gè)代謝物產(chǎn)后第7天比分娩當(dāng)天全部上調(diào)：磷脂酰膽堿（16∶0/16∶0）、二醇膽酸、脯氨酸-絲氨酸、脯氨酸-甘氨酸、1-硬脂?；?sn-甘油3-磷酸膽堿、乳清、L-天冬氨酸、N-乙酰基-L-天冬氨酸、異戊酰甘氨酸、L-肉堿和苯甲酸。

利用MetaboAnalyst分析平臺對ROC曲線篩選出的顯著性差異代謝物進(jìn)行聚類分析和KEGG代謝通路分析。圖7顯示了正負(fù)離子模式A組和B組顯著性差異代謝物層次聚類結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)同組樣品很好聚類在同一簇中，聚在同一簇內(nèi)的代謝物具有相似的表達(dá)模式，表明篩選的顯著性差異代謝物合理且準(zhǔn)確。由圖8可知，A組和B組兩組11個(gè)顯著性差異代謝物共參與11種不同代謝通路。11個(gè)代謝通路分別是：丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝、亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、精氨酸生物合成、組氨酸代謝、泛酸和CoA生物合成、β-丙氨酸代謝、甘油磷脂代謝、花生四烯酸代謝、嘧啶代謝和氨基?；?tRNA生物合成。主要代謝通路以影響力大于0.2（Pathway impact>0.2）為篩選標(biāo)準(zhǔn)，Pathway impact>0.2代謝通路丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝。甘油磷脂代謝和嘧啶代謝兩組影響力相對較小（Pathway impact>0.05）。

圖1 QC樣本TIC圖

圖2 正離子和負(fù)離子QC樣本相關(guān)性分析

3 討論

3.1 丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝

N-乙酰 -L-天冬氨酸（N-acetyl-aspartic acid，NAA）是存在于哺乳動(dòng)物大腦中的游離氨基酸［15］，在線粒體由游離ASP乙?；砸阴］o酶A（CoA）為輔助因子合成［16］。NAA被認(rèn)為是多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的生物標(biāo)志物［17］。ASP是一種重要的非必需氨基酸，主要參與尿素循環(huán)、糖異生和蘋果酸-天門冬氨酸穿梭等多種生化過程［18］。這些生化過程主要發(fā)生在肝臟，當(dāng)ASP含量降低時(shí)導(dǎo)致氨積累，且引起肝臟損傷［19-20］。ASP含量的增加表明通過糖異生等過程產(chǎn)生的能量增加［19］。ASP的乙?；梢源龠M(jìn)其從線粒體中去除，有利于谷氨酸轉(zhuǎn)化為酮戊二酸，從而進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)行能量生產(chǎn)［16］。有研究表明丙氨酸、ASP和谷氨酸代謝在淋巴細(xì)胞再生和免疫過程中起著重要作用［21］。在本研究中NAA和ASP在產(chǎn)后第7天相對分娩當(dāng)天上調(diào)，可能是在丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝中參與能量代謝，維持分娩后泌乳需要大量的能量。這可能是為了增加機(jī)體能量的產(chǎn)生，減輕對肝臟的影響，維持奶牛分娩后的機(jī)體健康。

圖3 A組和B組兩兩比較正、負(fù)離子模式下PCA圖譜

3.2 甘油磷脂代謝

圖4 A組和B組兩兩比較正、負(fù)離子模式下OPLS-DA圖譜

圖5 A組和B組正、負(fù)離子模式下OPLS-DA模型置換檢驗(yàn)圖

表3 A組和B組正、負(fù)離子模式下鑒定的差異代謝物

磷 脂 酰 膽 堿（Phosphatidyl cholines，PC） 是細(xì)胞膜的主要磷脂成分和生產(chǎn)脂質(zhì)第二信使的底物［22］，也是肝臟三酰甘油（Triacylglyceride，TAG）分泌所必需的甘油磷脂［23］。PC主要參與甘油磷脂代謝，甘油磷脂是比較復(fù)雜的代謝，代謝中主要有PC和磷脂酰乙醇胺（PE）兩種甘油磷脂［24］。而PE轉(zhuǎn)化為PC是肝臟特異性的PC合成途徑［25］。PC是促進(jìn)肝臟中極低密度脂蛋白（Very low density lipoprotein，VLDL）轉(zhuǎn)運(yùn)甘油三酯必需的物質(zhì)［26］。血液中PC水平的升高會(huì)導(dǎo)致奶牛肝臟中VLDL的分泌增加［27］。從妊娠到哺乳期血漿PC減少與產(chǎn)后脂肪肝的發(fā)展有關(guān)［28］。血漿中PC從泌乳早期到泌乳后期增加了10倍［29］。奶牛血漿中PC的濃度從分娩前2周開始下降，分娩后開始上升到第4周達(dá)到高濃度［30］。有研究表明PC可以作為產(chǎn)后奶牛脂肪肝血漿脂質(zhì)評價(jià)生物標(biāo)志物［31］。本研究從分娩當(dāng)天到產(chǎn)后第7天血漿PC濃度升高，與前人研究結(jié)果一致。說明分娩后PC濃度增加，使得奶牛肝臟中VLDL的分泌增加，增強(qiáng)了TAG從肝臟中轉(zhuǎn)運(yùn)出來的速度，降低了產(chǎn)后奶牛患脂肪肝的幾率，降低了奶牛分娩后負(fù)能量平衡的發(fā)生機(jī)率。

圖6 11個(gè)顯著性差異代謝物的ROC曲線

圖7 A組和B組顯著性差異代謝物聚類熱圖

圖8 A組和B組差異代謝物的代謝通路分析

3.3 嘧啶代謝

乳清酸（Orotic acid，OA）是核酸堿基的前體，也是嘧啶合成的中間體。OA的多少與奶牛的來源、飲食和泌乳期有關(guān)［32］。比較泌乳奶牛和非泌乳奶牛乳腺組織表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，OA是奶牛泌乳關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，泌乳組奶牛OA顯著高于非泌乳組奶牛［33］。OA的再循環(huán)通?？梢栽诟闻K中發(fā)生，肝細(xì)胞將其吸收并轉(zhuǎn)化為尿苷，用于嘧啶循環(huán)途徑［34］。嘧啶核苷酸合成的最后一步將OA轉(zhuǎn)化為有活性的尿酶［35］。當(dāng)腎臟受到嚴(yán)重?fù)p害時(shí)，尿酶活性較低［36］。本研究產(chǎn)后第7天OA相比分娩當(dāng)天濃度上調(diào)，增加的OA可能是和泌乳密切相關(guān)，升高的OA可能在嘧啶代謝中轉(zhuǎn)化為尿酶，從而降低對腎臟損傷，有利于維持奶牛分娩后機(jī)體健康。

4 結(jié)論

本研究通過分析分娩當(dāng)天和產(chǎn)后第7天奶牛血漿代謝物，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)后第7天與分娩當(dāng)天相比NAA、天冬氨酸、PC和OA上調(diào)。這些代謝物變化有利維持奶牛分娩后機(jī)體健康。