韓易辰 趙桂芝 趙冰凈 肖依寒 申 濤 柯 杰

正畸牙齒移動(Orthodontic Teeth Movement，OMT)是在力的作用下牙周支持組織改建進(jìn)行的，多種蛋白(細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等)參與其中，通過特定蛋白的含量變化可以幫助了解牙周組織對力的反應(yīng)。骨硬化蛋白(Sclerostin)由SOST 基因編碼[1]，是由成熟骨細(xì)胞特異分泌的一種糖蛋白，在骨代謝過程中起到重要作用，能夠抑制由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成[2]。目前慢性牙周炎及種植體周圍齦溝液中骨硬化蛋白的含量受到越來越多的關(guān)注[3-5]，但正畸治療過程中，齦溝液中骨硬化蛋白含量變化鮮有研究，本實(shí)驗(yàn)擬通過檢測下頜擴(kuò)弓牙齒移動過程中齦溝液中骨硬化蛋白濃度變化，初步探究其與骨代謝的關(guān)聯(lián)，以期為監(jiān)測下頜擴(kuò)弓骨改建提供一個可行的生化指標(biāo)，從而提高下頜擴(kuò)弓的安全性。

1. 資料和方法

1.1 研究對象 選取2019 年1 月至2019 年6月來空軍特色醫(yī)學(xué)中心口腔科進(jìn)行上下頜聯(lián)合擴(kuò)弓治療的患者25 例，男11 例，女14 例，年齡11～14 歲，平均年齡12.4±1.1 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)上、下頜輕中度擁擠伴有牙弓狹窄；(2)未做過正畸治療；(3)混合牙列期患者前牙與第一磨牙已萌出；(4)無顱面畸形及綜合癥；(5)無系統(tǒng)性疾病，牙周組織健康。排除標(biāo)準(zhǔn)：有系統(tǒng)性疾病，骨代謝疾病，口腔衛(wèi)生較差，依從性差者。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段：拍攝全口曲面斷層片及頭顱側(cè)位片；分別取上下頜模型，制作上下頜擴(kuò)弓器；對患者及家長進(jìn)行口腔衛(wèi)生宣教；為納入實(shí)驗(yàn)的患者行全口齦上潔治術(shù)；患者家長簽署知情同意書。

固定矯治階段：牙周潔治一周后，將制作好的擴(kuò)弓器帶入患者口內(nèi)，旋轉(zhuǎn)中央螺絲橫向打開擴(kuò)弓器的螺旋擴(kuò)大結(jié)構(gòu)，每次加力旋轉(zhuǎn)1/ 4 圈橫向擴(kuò)大牙弓0.25mm，對患者采取上頜快速擴(kuò)弓，每天通常加力兩次(0.5mm/ 天)，下頜采用中快速擴(kuò)弓技術(shù)，每天通常加力一次(0.25mm/ 天)，一周復(fù)查一次[6];唇側(cè)粘MBT 托槽(3M)，上下頜帶入0.016″熱激活鎳鈦圓絲[6];根據(jù)患者擁擠度及耐受情況采取上頜擴(kuò)弓約20 天，下頜擴(kuò)弓約40 天。擴(kuò)弓器保持6 個月后，拆除擴(kuò)弓器。

臨床數(shù)據(jù)采集階段：帶入擴(kuò)弓器前T0、下頜加力結(jié)束時T1、保持3 個月T2、保持6 個月拆除擴(kuò)弓器后T3四個時間點(diǎn)分別拍攝CBCT，對下頜第一前磨牙和第一磨牙的頰側(cè)進(jìn)行牙周臨床指標(biāo)檢查(牙周探診深度PD、牙齦退縮水平GR、臨床附著喪失CAL、菌斑指數(shù)PLI、牙齦指數(shù)GI)以及齦溝液采集。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 齦溝液的采集 分別選取下頜雙側(cè)第一前磨牙、第一磨牙的頰側(cè)采集齦溝液，先用水流輕柔的沖洗受試牙，并使用棉卷隔離，持無油壓縮氣槍沿牙面輕吹，保持靜置1 分鐘。然后將whatman 濾紙條(2mm×10mm，每個EP 管中1 條，共同用精確電子天平稱重并記錄)插入齦溝內(nèi)1mm，保持30s 后取出，將濾紙條放入原保存的EP 管內(nèi)，精確電子天平再次稱重，取前后重量差值即采集齦溝液的質(zhì)量；觀察濾紙條有無血液污染，若沾及血液即廢棄，10min 后重新收集；按照1mg/ μl的齦溝液比重計算齦溝液體積并記錄后，即刻加入100μl PBS 緩沖液，置- 80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。所有樣本均由同一名?shí)驗(yàn)者采集。

1.3.2 齦溝液中骨硬化蛋白含量的測定 采用ELISA 法(海聯(lián)生物人骨硬化蛋白試劑盒)檢測齦溝液中骨硬化蛋白含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，雙側(cè)同一牙位取平均值:

a. 將人骨硬化蛋白試劑盒從冰箱中取出，平衡30 分鐘，使①20×洗滌緩沖液②檢測抗體- HRP③96 孔微孔酶標(biāo)板④樣本稀釋液⑤底物A⑥底物B⑦終止液⑧標(biāo)準(zhǔn)品(6 管)恢復(fù)至室溫(18- 25℃)；

b. 按1 份洗滌緩沖液加19 份蒸餾水的配比(1∶20)稀釋20×洗滌緩沖液；

c. 分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔、待測樣本孔：標(biāo)準(zhǔn)品孔加標(biāo)準(zhǔn)品(分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μl)、空白孔加樣本稀釋液50μl、待測樣本孔加待測樣本各50μl，輕輕震蕩混勻；

d. 標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔、待測樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100μl，覆上封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋恒溫溫育1 小時；

e. 棄去酶標(biāo)板孔內(nèi)液體，并在吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液(350μl)，靜置1 分鐘，甩去洗滌液，吸水紙上拍干。按照以上步驟，重復(fù)洗板5 次；

f. 每孔分別加入底物A、底物B 各50μl，37℃避光恒溫孵育15 分鐘；

g. 每孔加入終止液50μl，在反應(yīng)終止后15分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm 波長依序測量各孔的光密度(OD 值)。

h. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及OD 值計算出樣本濃度- OD 值曲線，代入各孔的OD 值，計算出各孔樣本的濃度；各孔樣本的濃度*樣本體積/ 齦溝液體積即得到相應(yīng)齦溝液中骨硬化蛋白濃度，左右同名牙結(jié)果取平均值。

1.3.3 臨床牙周指標(biāo)檢查 牙周探診深度(Probing Depth，PD): 用Williams 刻度探針沿牙長軸方向插入牙齦溝底，記錄頰、舌側(cè)，近中、遠(yuǎn)中位置的牙齦緣至齦溝底的距離，取最大值作為PD 值。

牙齦退縮水平(Gingival Recession，GR): 用Williams 刻度探針沿牙長軸方向插入齦溝探及釉牙骨質(zhì)界，記錄頰、舌側(cè)，近中、遠(yuǎn)中位置的牙齦緣至釉牙骨質(zhì)界的距離，取最大值作為GR 值。

臨床附著喪失(Clinical Attachment Loss，CAL)：當(dāng)齦緣位于CEJ 根方時，CAL=PD+GR；當(dāng)齦緣位于CEJ 冠方時，CAL=PD- GR；當(dāng)齦緣平齊CEJ 時，PD=GR，CAL=0 值。

菌斑指數(shù)(Plaque Index，PLI): 根據(jù)菌斑的量和厚度來計分，計分標(biāo)準(zhǔn): 0= 無菌斑; 1= 牙面可見薄層菌斑，視診不可見，但探針尖側(cè)面可刮出菌斑; 2= 可見中量菌斑; 3= 可見大量軟垢。

牙齦指數(shù)(Gingival Index，GI)：0= 牙齦健康；1= 牙齦輕度炎癥：牙齦的顏色有輕度改變并輕度水腫，探診不出血；2= 牙齦中等炎癥：牙齦色紅，水腫光亮，探診出血；3= 牙齦嚴(yán)重炎癥：牙齦明顯紅腫或有潰瘍，并有自動出血傾向。

1.3.4 影像學(xué)檢查 患者的全部CBCT 數(shù)據(jù)均由口腔科同一名放射科醫(yī)生使用同一臺設(shè)備進(jìn)行采集，將采集的影像學(xué)資料導(dǎo)入到Invivo 5 軟件中，調(diào)整頭位：使患者在矢狀向上頜面部中線與基準(zhǔn)水平線垂直，在冠狀向上在咬合平面與基準(zhǔn)水平線平行，水平向上雙側(cè)頜骨及牙列基本對稱。之后在水平軸的視圖下，選中剛好通過右側(cè)下頜第一磨牙根分叉的水平面，進(jìn)行頰側(cè)牙槽骨厚度的測量。

牙齒頰側(cè)牙槽骨厚度BB[29]：下頜第一前磨牙取牙根頰側(cè)最外側(cè)點(diǎn)到頰側(cè)皮質(zhì)骨外側(cè)面的距離，下頜第一磨牙取近遠(yuǎn)中根頰側(cè)最外側(cè)點(diǎn)連線的中點(diǎn)到頰側(cè)皮質(zhì)骨外側(cè)面的距離，雙側(cè)同名牙測得數(shù)據(jù)取平均值，分別記作BB 4，BB 6。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均由同一人重復(fù)三次(每次間隔一周)完成，測量結(jié)果取其平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 18. 0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以x±s 表示，治療前后比較采用配對t 檢驗(yàn)，以P≤0. 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，同名牙(第一前磨牙與第一磨牙)齦溝液體積T0～T3沒有明顯差異，但是相同時間點(diǎn)第一磨牙采集到的齦溝液體積多于第一前磨牙，且具有統(tǒng)計學(xué)意義；同名牙齦溝液骨硬化蛋白GCF Scl濃度T0～T1顯著升高，T1～T2顯著下降，T2～T3顯著下降，但T3較T0沒有明顯差異，且GCF Scl濃度在T0和T3階段第一前磨牙與第一磨牙之間未見明顯差異(表1，2)；

牙周探診深度PD、牙齦退縮水平GR、臨床附著喪失CAL T0～T3之間的變化并無統(tǒng)計學(xué)差異；牙齦指數(shù)GI、菌斑指數(shù)PLI T1較T0都有顯著升高，但T1～T3之間的變化并無統(tǒng)計學(xué)差異，實(shí)驗(yàn)過程中未見明顯的探診出血(表3)；

同名牙頰側(cè)牙槽骨厚度BB T0～T1顯著下降，T1～T2未見明顯差異，T2～T3略有上升，有統(tǒng)計學(xué)意義，但T3較T0仍有顯著下降(表4)；T0～T3相同時間點(diǎn)第一前磨牙頰側(cè)牙槽骨厚度BB 4 與第一前磨牙頰側(cè)牙槽骨厚度BB 6 未見顯著差異。

表1 檢驗(yàn)指標(biāo)—第一前磨牙

表2 檢驗(yàn)指標(biāo)—第一磨牙

表3 牙周臨床指標(biāo)

表4 影像學(xué)指標(biāo).頰側(cè)牙槽骨厚度

3. 討論

齦溝液是一種血漿衍生滲出物[7]，分析齦溝液中特定成分的含量能夠?yàn)樵u估局部細(xì)胞代謝提供指導(dǎo)[8]，骨硬化蛋白作為骨形成抑制劑參與牙槽骨的吸收與改建[9]，在人及大鼠的成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙周組織和牙槽骨骨細(xì)胞中均有表達(dá)[10-12]，并存在于在齦溝液中[3,9]。以往的研究主要集中在牙周組織炎性對GCF Scl 濃度的影響，但在正畸治療中機(jī)械力對其影響則鮮有研究。下頜擴(kuò)弓主要依靠機(jī)械力使牙齒頰向移動，排除了腭中縫效應(yīng)對骨硬化蛋白含量的影響，所以本研究選取患者的下頜齦溝液作為研究對象，研究下頜擴(kuò)弓對GCF Scl濃度的影響，探究其作為檢測下頜擴(kuò)弓安全性的生化指標(biāo)的可行性。

本研究測量下頜擴(kuò)弓開始到保持結(jié)束4 個時間點(diǎn)(帶入擴(kuò)弓器前T0、下頜加力結(jié)束時T1、保持3個月T2、保持6 個月拆除擴(kuò)弓器后T3)頰側(cè)GCF Scl 的含量，從結(jié)果可知：下頜擴(kuò)弓機(jī)械力的加載可以使GCF Scl 濃度產(chǎn)生變化。以往的研究[4,7,13,14]已經(jīng)證實(shí)慢性牙周炎患者GCF Scl 含量較健康患者顯著上升，但是，通過對牙周臨床指標(biāo)的檢測，可以發(fā)現(xiàn)在佩戴下頜擴(kuò)弓器后，由于托槽及擴(kuò)弓器增加了患者牙齒清潔的難度，PLI 和GI 均有明顯的上升，但是在治療過程中，未見明顯變化，而且牙周檢查過程中也未見到明顯的探診出血及顯著探診深度PD 的變化，T2PD 的增加可能是由于牙齒清潔困難導(dǎo)致牙齦生長的緣故[15]，而并非炎癥狀態(tài)下的附著喪失，以上說明下頜擴(kuò)弓并未造成牙周的明顯炎癥，本實(shí)驗(yàn)中GCF Scl 的含量變化主要是下頜擴(kuò)弓過程中機(jī)械力的作用。結(jié)合GCF Scl 的變化與CBCT 結(jié)果，我們可以發(fā)現(xiàn)：

(1)T0～T1時，隨著機(jī)械力的刺激，使牙周組織中骨硬化蛋白表達(dá)增加，此時骨形成受抑制，骨吸收作用明顯，所以表現(xiàn)為頰側(cè)牙槽骨厚度降低；

(2)T1～T2時，由于擴(kuò)弓器停止加力，牙周組織中骨硬化蛋白表達(dá)逐漸降低，但仍然高于正常水平，此時骨吸收作用仍然顯著，但是頰側(cè)牙槽骨厚度并沒有顯著變化，可能是由于此時骨形成作用也逐漸加強(qiáng)，并與骨吸收作用達(dá)到一個平衡。King GJ 等[16]通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)力的作用下的壓力側(cè)骨改建會首先經(jīng)歷3 到5 天的骨吸收作用，隨后經(jīng)過5 到7 天的逆轉(zhuǎn)期，之后的7 到14 天將以骨形成為主要過程；Rober 等[17]對骨代謝生化指標(biāo)的綜述中也提到在力的作用下骨改建過程，骨吸收的相關(guān)指標(biāo)會在力的刺激后1 到3 個月率先升高，骨形成的相關(guān)生化指標(biāo)會在隨后6 到9 個月升高。Giuseppe Perinetti[18]等測量上頜擴(kuò)弓時頰側(cè)齦溝液中ALP的含量，發(fā)現(xiàn)在擴(kuò)弓結(jié)束保持3 個月到6 個月時，其含量顯著性的持續(xù)升高，ALP 作為骨形成的生物學(xué)標(biāo)記物，其含量的增加可以說明從擴(kuò)弓結(jié)束保持3 個月到6 個月的時間里，骨形成作用在不斷加強(qiáng)，并且相同的過程可能也發(fā)生在下頜擴(kuò)弓治療過程中。所以隨著骨吸收作用不斷減弱和骨形成作用不斷加強(qiáng)，在T1～T2時，二者可能維持一個相對平衡，導(dǎo)致CBCT 數(shù)據(jù)測量上未見到頰側(cè)牙槽骨厚度的顯著變化，但是，此時GCF Scl 表達(dá)仍高于初始水平，骨吸收作用應(yīng)該仍處于活躍狀態(tài)；

(3)T2～T3時，牙周組織中骨硬化蛋白表達(dá)逐漸降低至初始水平，骨吸收作用逐漸恢復(fù)到正常狀態(tài)，這個過程中，骨形成作用仍然顯著，進(jìn)而使得頰側(cè)牙槽骨厚度逐漸增加。但是此時牙槽骨厚度依舊低于初始狀態(tài)，結(jié)合Rober 等人的研究，提示在擴(kuò)弓加力結(jié)束6 個月后，骨形成作用可能仍會持續(xù)，所以頰側(cè)牙槽骨厚度可能T3在之后仍會有進(jìn)一步增加的可能，需要進(jìn)一步的研究觀察。

下頜擴(kuò)弓加力過程中，齦溝液中骨硬化蛋白含量的變化能夠一定程度上提示加力過程中骨吸收的狀態(tài)和趨勢，但是結(jié)合相關(guān)的骨形成生物指標(biāo)變化能夠更好的反映骨代謝狀態(tài)，指導(dǎo)下頜擴(kuò)弓過程中對力的控制。

此外，有研究[13,14]使用與本實(shí)驗(yàn)相同的GCF Scl 采集及檢驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)慢性牙周炎患者GCF Scl含量上升，但是與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比較, GCF Scl 的含量變化要遠(yuǎn)大于牙周炎患者，可能是由于GCF Scl 對于力的敏感性要優(yōu)于慢性炎癥，這也為其成為診斷骨吸收有效的生化檢驗(yàn)指標(biāo)提供了可能性。

傳統(tǒng)的診斷手段如牙周探診PD 或X 線診斷等缺乏預(yù)見性，Scl 作為骨形成的抑制劑，GCF Scl可能在影像學(xué)檢查和臨床檢查發(fā)現(xiàn)骨吸收之前便發(fā)生改變，并且GCF 的采集無創(chuàng)、方便，易儲存，并可以在正畸治療的各個階段重復(fù)采集。

由此可見，GCF Scl 以其靈敏度高、采集無創(chuàng)、儲存方便等優(yōu)點(diǎn)有望成為一種監(jiān)測牙槽骨吸收狀態(tài)的臨床上簡單易行的生物指標(biāo)。