陶文 何濤 何婭娣 羅量 黃文濤 李科 胡成 李遼源

【摘要】目的 探討尿液外泌體circ_0040507及其聯(lián)合前列腺特異性抗原（PSA）對前列腺癌的診斷價(jià)值。方法 選擇35例前列腺癌患者（前列腺癌組）和27例BPH患者（BPH組），采用第三代微滴數(shù)字PCR檢測尿液外泌體circ_0040507表達(dá)水平，以前列腺活組織檢查（活檢）病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用受試者工作特征（ROC）曲線分析尿液外泌體circ_0040507、PSA及兩者聯(lián)合對前列腺癌的診斷效能。結(jié)果 前列腺癌組和BPH組尿液外泌體circ_0040507表達(dá)量分別為（8.35±5.87） copies/ml和（3.25±2.45）copies/ml，前列腺癌組尿液外泌體circ_0040507表達(dá)量高于BPH組（P < 0.001）;尿液外泌體circ_0040507、PSA及兩者聯(lián)合診斷前列腺癌的ROC曲線下面積分別為0.767（95%CI 0.649 ～ 0.896）、0.782（95%CI 0.668 ～ 0.896）、0.851（95%CI 0.755 ～ 0.946）。結(jié)論 尿液外泌體circ_0040507聯(lián)合PSA診斷前列腺癌具有較好的臨床價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】前列腺癌;診斷;外泌體;前列腺特異性抗原;環(huán)狀核糖核酸

【Abstract】Objective To investigate the diagnostic value of urinary exosomal circ_0040507 combined with prostate-specific antigen （PSA） for prostate cancer. Methods Digital droplet polymerase chain reaction （ddPCR） was employed to detect the expression level of circ_0040507 in the urinary exosomes of 35 patients with prostate cancer and 27 patients with benign prostatic hyperplasia. The pathological results of prostate biopsy were regarded as the gold standard. The receiver operating characteristic （ROC） curve was delineated to analyze the sensitivity and specificity of urinary exosomal circ_0040507， PSA and the combination of them for the diagnosis of prostate cancer. Results The expression level of urinary exosomal circ_0040507 in the BPH group was （3.25±2.45） copies/ml， significantly lower compared with （8.35±5.87） copies/ml in the prostate cancer group （P < 0.001）. The area under ROC for circ_0040507， PSA， and the combination was 0.767 （95%CI 0.649-0.896）， 0.782 （95%CI 0.668-0.896） and 0.851（95%CI 0.755-0.946）， respectively. Conclusion The determination of urinary exosomal circ_0040507 combined with PSA is a valuable biomarker for the diagnosis of prostate cancer.?

【Key words】Prostate cancer;Diagnosis;Exosome;Prostate-specific antigen;Circular RNA

前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤， 血清前列腺特異性抗原（PSA）是前列腺癌早期診斷的指標(biāo)之一，但其特異度較低，在部分BPH和前列腺炎患者中也會(huì)增高[1-2]。環(huán)狀RNA （circRNA）是一類特殊的單鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RNA，其可耐受核酸外切酶，因此較傳統(tǒng)的線性RNA穩(wěn)定。目前研究顯示，circRNA廣泛參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程[3-4]。外泌體是一類直徑在30 ～ 100 nm的細(xì)胞外囊泡，其中包含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等物質(zhì)，在細(xì)胞間通訊發(fā)揮著重要作用[5]。有研究顯示，circRNA在外泌體中富集并穩(wěn)定，可作為惡性腫瘤診斷的生物標(biāo)志物[6]。本研究通過微滴數(shù)字PCR （ddPCR）檢測可疑前列腺癌患者尿液外泌體circ_0040507的水平，分析其表達(dá)水平及其聯(lián)合PSA對前列腺癌診斷的臨床價(jià)值。

對象與方法

一、研究對象

將2018年1月至2019年6月中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院泌尿外科收治的、經(jīng)穿刺活組織檢查（活檢） 確診的35例前列腺癌患者納入前列腺癌組，并將同期收集的27例經(jīng)穿刺活檢確診的BPH患者納入BPH組。排除標(biāo)準(zhǔn)：①此前接受其他任何腫瘤相關(guān)治療;②患有其他腫瘤或嚴(yán)重慢性疾病;③患嚴(yán)重的精神性疾病。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入組患者均已簽署知情同意書。

二、尿液采集

所有患者在前列腺穿刺前行前列腺按摩，自前列腺底部至尖部，側(cè)葉外側(cè)至中線;自上而下按壓側(cè)葉各3次，重復(fù)1次，最后按摩前列腺中央溝3次。采集初始尿液80 ～ 100 ml，置于-80℃冰箱保存。

三、外泌體分離

尿液樣品在4℃解凍過夜，4℃、3000×g離心15 min以去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片，取上清液至2支38.5 ml薄壁多聚異體離心管（美國Beckman Coulter），天平配平之后，置超速離心機(jī)，4℃、100 000×g離心120 min，棄上清，用5 ml磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解沉淀。取1 ml ExoQuick-TC試劑與上一步得到的液體按照1∶5比例混合，在4℃孵育過夜后，4℃、1500×g離心30 min，棄上清再離心5 min去除殘留液體。得到的外泌體用PBS溶解用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)或者置-80℃冰箱保存。

四、總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄

使用miRNeasy Mini試劑盒（德國Qiagen）提取尿液外泌體中總RNA，使用美國Agilent 2100生物分析儀檢測RNA的濃度和完整性。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Perfect Real Time （日本TaKaRa），采用隨機(jī)引物將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為模板DNA。

五、數(shù)字PCR檢測

ddPCR實(shí)驗(yàn)使用ddPCR EvaGreen Supermix試劑（美國Bio-Rad）在QX200微滴數(shù)字PCR系統(tǒng)上進(jìn)行。Circ_0040507上游引物為5-CGCTGGGAGAGCTGTACATA-3，下游引物為5-GCTGAGAGAGATCTGGACAA-3，產(chǎn)物長度為113 bp。配制20 μl反應(yīng)體系（2 μl模板DNA，10 μl QX200 EvaGreen ddPCR Supermix，4 μmol/L上下游引物，無核酸酶水補(bǔ)足20 μl體積），并用無核酸酶水替代反應(yīng)模板設(shè)置陰性對照。將20 μl反應(yīng)體系和70 μl微滴生成油轉(zhuǎn)移至微滴生成卡生成微滴，并取40 μl至96孔PCR板;PX1熱封儀封膜后在T100TM PCR 儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃ 5 min;95℃ 30 s，64℃ 60 s，循環(huán)45次;4℃ 5 min，90℃ 5 min穩(wěn)定信號;4℃保存。檢測微滴：通過微滴分析儀使用QuantaSoft軟件計(jì)算結(jié)果，并換算為copies/ml。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以描述，組間比較采用t檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征（ROC） 曲線，分析尿液外泌體circ_0040507表達(dá)水平和PSA對前列腺癌診斷的臨床價(jià)值。ROC曲線與散點(diǎn)圖繪制分別使用SPSS 25.0和GraphPad Prism 8.0。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、前列腺癌組和BPH組患者的一般情況

2組患者的年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 1.636，P = 0.107），2組患者的其他一般資料詳見表1。

二、前列腺癌組和BPH組患者的尿液外泌體circ_0040507表達(dá)情況

前列腺癌組患者尿液外泌體circ_0040507表達(dá)水平為（8.35±5.87）copies/ml，高于BPH組的（3.25±2.45）copies/ml（t = 4.165，P < 0.001），見圖1。前列腺癌患者中，Gleason評分< 8分與≥8分者、臨床病理分期T1 ～ T2與T3 ～ T4者尿液外泌體circ_0040507表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），見表2。

三、尿液外泌體circ_0040507診斷前列腺癌的ROC曲線分析

ROC曲線分析顯示，尿液外泌體circ_0040507鑒別前列腺癌與BPH的曲線下面積為0.767（95% CI 0.649 ～ 0.884），當(dāng)前列腺癌的診斷臨界值為4.12 copies/ml時(shí)，其靈敏度和特異度分別為68.6%和77.8%;當(dāng)診斷臨界值為6.55 copies/ml時(shí)，其靈敏度和特異度分別為57.1%和88.9%;同時(shí)兼顧到靈敏度和特異度，4.12 copies/ml可作為尿液外泌體circ_0040507診斷前列腺癌最佳臨界值，見圖2。

四、尿液外泌體circ_0040507、PSA及兩者聯(lián)合診斷前列腺癌的ROC曲線分析

尿液外泌體circ_0040507、PSA及兩者聯(lián)合診斷前列腺癌[Logit（P） = -1.631+0.037×PSA+ 0.194×circ_0040507]的ROC曲線下面積分別為0.767（95% CI 0.649 ～ 0.884）、0.782 （95% CI 0.668 ～ 0.896）、0.851 （95% CI 0.755 ～ 0.946）。兩者聯(lián)合診斷的曲線下面積高于尿液外泌體circ_0040507單一診斷（P = 0.021）。PSA診斷前列腺癌的靈敏度和特異度分別為74.3%和74.1%，尿液外泌體circ_0040507和PSA聯(lián)合診斷前列腺癌時(shí)，其靈敏度和特異度分別為82.9%和77.8%，見圖2。兩者聯(lián)合診斷較PSA單一診斷的靈敏度和特異度有所提高，但曲線下面積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.160）。

討論

前列腺癌是男性常見腫瘤之一，其發(fā)病率逐年增高，且大多數(shù)患者在確診腫瘤時(shí)已是中晚期，失去了根治性手術(shù)治療的時(shí)機(jī)[7]。因此，尋找新的檢測指標(biāo)對于前列腺癌的篩查和診治有著重要意義。液體活檢通過采集血液、尿液及唾液等檢測其中攜帶的包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞、外泌體RNA 和循環(huán)腫瘤DNA等在內(nèi)的多種腫瘤標(biāo)志物，是一種非侵入性或微侵入性體液檢測技術(shù)[8]。與組織活檢相比，其可減少操作過程中出血、感染等幾率，且有動(dòng)態(tài)監(jiān)測的優(yōu)勢。

近來，關(guān)于circRNA與腫瘤的研究報(bào)道越來越多，有報(bào)道circCSNK1G3通過miR-181b/d作用于前列腺癌，且與其線性mRNA無關(guān)[4]。circ-AURKA在神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌（NEPC）細(xì)胞系NCI-H660中的表達(dá)比在非NEPC前列腺細(xì)胞LNCaP和VCaP中的表達(dá)較高[3]。因其獨(dú)特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，circRNA可穩(wěn)定存在于組織或體液中，被廣泛作為腫瘤診斷和預(yù)后的標(biāo)志物[9-10]。外泌體通過傳遞信號、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等方式參與腫瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程[11]。據(jù)報(bào)道，circRNA可在外泌體中富集，并與腫瘤微環(huán)境、轉(zhuǎn)移灶形成及藥物耐藥性相關(guān)[12]。尿液中存在外泌體，且樣本收集、保存方便，更重要的是可跟蹤疾病進(jìn)程，實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測。本研究使用微滴數(shù)字PCR檢測尿液外泌體circ_0040507表達(dá)水平，與傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比，其使用油包水液滴技術(shù)，使每個(gè)反應(yīng)單元中至多包含一個(gè)拷貝的模版，并通過泊松分布的原理，實(shí)現(xiàn)檢測分子的絕對定量，具有更好的重復(fù)性和更高的靈敏度[13]。本研究中前列癌組與BPH組相比，前者尿液外泌體circ_0040507水平高于后者，提示檢測尿液外泌體circ_0040507可作為診斷前列腺癌的一種新方法。

本研究以組織穿刺活檢為金標(biāo)準(zhǔn)，探索尿液外泌體circ_0040507及其聯(lián)合PSA診斷前列腺癌的價(jià)值。目前前列腺癌的主要臨床指標(biāo)是血清PSA， 但存在特異度不高的缺點(diǎn)，其在部分BPH和前列腺炎患者中也升高，且易受各種因素干擾，包括泌尿系統(tǒng)感染、前列腺按摩等。本研究中，與PSA單一診斷前列腺癌相比，尿液外泌體circ_0040507與PSA兩者聯(lián)合診斷的靈敏度和特異度均提高。本研究中，兩者聯(lián)合診斷與PSA單一診斷曲線下面積分別為0.851、0.782，兩者曲線下面積相近，可能與樣本量偏小有關(guān)，有待后續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。我們認(rèn)為，血清PSA水平是臨床最常見的檢測指標(biāo)，而尿液樣品也是較容易獲得的臨床標(biāo)本，通過將兩指標(biāo)聯(lián)合，提高了單一診斷的效能。本研究的不足之處是樣本量偏小，我們正在收集更多的病例進(jìn)行前瞻性驗(yàn)證。

綜上所述，本研究初步分析了尿液外泌體circ_0040507在前列腺癌診斷中的價(jià)值，并進(jìn)一步探討了其聯(lián)合血清PSA的診斷意義。鑒于尿液樣本收集簡單易行及circRNA的穩(wěn)定性，我們認(rèn)為檢測尿液外泌體circ_0040507并結(jié)合血清PSA診斷前列腺癌具有較好的臨床價(jià)值。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-02-10）

（本文編輯：林燕薇）