李 澳，胡 月，孫 玲，孟 娜，于楠楠

(徐州工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008)

氮、磷污染物是導(dǎo)致眾多內(nèi)陸湖泊、水庫(kù)甚至河流水體富營(yíng)養(yǎng)化的主要因素，它們的協(xié)同去除是污水生物處理的主要目標(biāo)。常規(guī)的生化處理工藝可以有效地降低污水的BOD5和SS，但對(duì)污水中同時(shí)存在的N、P等營(yíng)養(yǎng)物只能去除10%～20%，大量含磷污水直接排入水體。在近30多年里，許多污水廠在設(shè)計(jì)上都考慮到了利用微生物對(duì)N、P的同步去除。然而，由于硝化菌與傳統(tǒng)聚磷菌(PAOs)的菌齡不同及反硝化菌與PAOs在碳源需求上的競(jìng)爭(zhēng)，使得它們?cè)诿摰走^(guò)程中存在著較大矛盾，系統(tǒng)難以達(dá)到最優(yōu)運(yùn)行條件。20世紀(jì)末，人們發(fā)現(xiàn)在厭氧/缺氧交替運(yùn)行的環(huán)境中能夠富集到一類兼有脫氮和除磷特性的PAOs，并把它們單獨(dú)列出，稱為反硝化聚磷菌(Denitrifying phosphorus accumulating organisms，DNPAOs)，它們的發(fā)現(xiàn)為解決碳源利用和泥齡差異的矛盾提供了可能，使得脫氮除磷得以同步進(jìn)行。目前，國(guó)內(nèi)外在反硝化聚磷菌的分離篩選方面的研究已有一定的進(jìn)展：2003年Wauters G等[1]分離到1株叢毛單胞菌屬的DNPAOs；2004年Suguru O等[2]分離到1株紅環(huán)菌屬的DNPAOs；2008年許彥娟[3]分離到1株微小桿菌屬和3株芽孢桿菌屬的DNPAOs；2009年Cao Ngoc Diep等[4]分離到1株假單胞菌屬的DNPAOs；2011年Hui LIU等[5]分離到1株副球菌屬的DNPAOs；2018年謝蔚鵬等[6]分離到24株反硝化聚磷菌，可歸于5個(gè)不同的屬，分別是芽孢桿菌屬、叢毛單胞菌屬、普羅維登斯菌屬、假單胞菌屬和假蒼白桿菌屬。本研究依據(jù)除磷能力、硝酸鹽還原產(chǎn)氣及異染顆粒染色等實(shí)驗(yàn)，對(duì)DNPAOs進(jìn)行分離篩選，得到1株高效同步脫氮除磷的DNPAOs，豐富和補(bǔ)充了生物反硝化除磷理論。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

723C可見(jiàn)分光光度計(jì)；SW-CJ-1F潔凈工作臺(tái)；HZ150L恒溫培養(yǎng)搖床；IXQ-SG46-280A手提式壓力蒸汽滅菌鍋；BCD-212KA海爾冰箱；HH.B11.600-S-II電熱恒溫培養(yǎng)箱；XMTD-204數(shù)顯恒溫水浴鍋；150B生化培養(yǎng)箱等。

試劑除LB為生化試劑外，其余均為分析純，pH的調(diào)節(jié)采用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH。

1.2 培養(yǎng)基

(1)LB培養(yǎng)基：酵母浸膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，雙蒸水1000 mL，pH 7.0～7.2(若為固體則加入瓊脂25 g)。

(2)LB-P培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基添加2.5 g K2HPO4和0.25 g KH2PO4，pH 7.0～7.2。

(3)富集培養(yǎng)基：CH3COONa·3H2O 5 g、丙酸5 mL、KNO32.0 g、MgSO4·7 H2O 0.2 g、K2HPO42.0 g、微量元素2 mL、雙蒸水1000 mL；pH 7.2。

(4)1% BTB-反硝化培養(yǎng)基：CH3COONa·3H2O 5.0 g、KNO32.0 g、MgSO4·7 H2O 0.2 g、瓊脂20 g、1%-BTB 4 mL、H2O 1000 mL；pH 7.6。

(5)反硝化缺磷培養(yǎng)基：KNO32 g/L、CH3COONa·3H2O 5 g/L、K2HPO40.05 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl20.5 g/L、微量元素2 mL/L。

(6)反硝化富磷培養(yǎng)基：KNO32 g/L、CH3COONa·3H2O 5 g/L、K2HPO40.05 g/L、KH2PO40.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl20.5 g/L、微量元素2 mL/L。

(7)微量元素溶液：FeCl3·6H2O 1.5 g/L、H3BO30.15 g/L、CuSO4·5H2O 0.03 g/L、KI 0.03 g/L、Na2MoO4·2H2O 0.06 g/L、MnCl2·4H2O 0.12 g/L、ZnSO4·7H2O 0.12 g/L、CoCl2·2H2O 0.12 g/L。

1.3 反硝化聚磷菌的富集培養(yǎng)與篩選

1.3.1 菌株富集培養(yǎng)

從徐州市的幾個(gè)污水處理廠采集活性污泥，混合后稱取10 g，加入200 mL富集培養(yǎng)基中，26 ℃、140 r/min搖床厭氧/缺氧間歇培養(yǎng)，每4 d為一周期(每一周期前2 d以乙酸鈉提供碳源，后2 d以丙酸提供碳源，每次置換培養(yǎng)液的50%)，共培養(yǎng)10個(gè)周期。培養(yǎng)結(jié)束后吸取0.5 mL富集液，進(jìn)行10-1～10-9濃度梯度稀釋，從各梯度的稀釋液取0.1 mL分別涂布LB固體培養(yǎng)基，每個(gè)稀釋度2個(gè)重復(fù)，于生化培養(yǎng)箱26 ℃下培養(yǎng)2～3 d。選取形態(tài)清晰的單菌落劃線分離培養(yǎng)，長(zhǎng)成的單菌落再轉(zhuǎn)接，重復(fù)劃線培養(yǎng)6次，即得純菌落。

1.3.2 菌株篩選

①藍(lán)白斑初篩：對(duì)已分離純化的菌株取單菌落，分別點(diǎn)接于1% BTB-反硝化培養(yǎng)基上，于26 ℃培養(yǎng)2 d，選擇顯藍(lán)色的菌株作為初篩菌株。

②Albert顆粒染色復(fù)篩：將上述篩選出的菌株缺氧培養(yǎng)12 h后，進(jìn)行Albert異染顆粒染色，選擇具有異染粒染色的菌株為反硝化聚磷菌。LB培養(yǎng)基斜面接種，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

③將上述篩選出的反硝化聚磷菌分別接入100 mL LB液體培養(yǎng)基中，26 ℃，140 r/min搖床培養(yǎng)24 h，4000 r/min離心20 min收集菌體，調(diào)整OD600=1.0，無(wú)菌生理鹽水保存，即為種子液。

除磷率：η1=(C-Ct)/C×100%

(1)

反硝化率：η2=(A-At-Bt)/A×100%

(2)

式中：η1——除磷率，%

η2——反消化率，%

選取1株反硝化率和除磷率分別大于70%和50%的菌株為實(shí)驗(yàn)菌株。

1.4 分析方法

1.5 菌株特征及生理生化鑒定

參照文獻(xiàn)[7-8]方法進(jìn)行。

1.6 菌株16SrDNA基因片段PCR擴(kuò)增

以細(xì)菌基因組DNA為模板擴(kuò)增16SrDNA，采用一對(duì)通用引物，上游引物(7F)：5-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’；下游引物(1540R)：5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’；PCR反應(yīng)體系：Template 0.5 μL，5×Buffer(with Mg2+)2.5 μL，dNTPs 1 μL，上游和下游引物各0.5 μL，加雙蒸H2O2至25 μL。PCR程序如下：① 98 ℃，預(yù)變性，3 min；② 98 ℃變性25 s；③ 55 ℃復(fù)性25 s；④ 72 ℃延伸1 min；⑤ 72 ℃延伸10 min；⑥ 4 ℃終止反應(yīng)，其中步驟②至④循環(huán)30次。瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，并送中國(guó)上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.7 菌株生長(zhǎng)影響因素(不同因素對(duì)菌株生長(zhǎng)及反硝化除磷性能的影響)

1.7.1 不同 pH 值

1.7.2 不同溫度

1.7.3 不同碳源

1.8 菌株脫氮除磷性能

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的富集與篩選

取混合物樣品10 g置于200 mL乙酸鈉/丙酸為交替碳源的富集培養(yǎng)基中，26 ℃下，140 r/min搖床培養(yǎng)40 d后，涂布LB固體培養(yǎng)基，共挑出形態(tài)、大小、顏色不同的菌落48株。分別挑單菌落接種于1%BTB-反硝化培養(yǎng)基進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，顯藍(lán)斑的共有23個(gè)菌落，為反硝化菌，命名為N1-N23。對(duì)N1-N23厭氧吸磷培養(yǎng)后進(jìn)行Albert異染粒染色，染色結(jié)果表明有8株菌體(N2、N3、N6、N9、N11、N13、N14、N23)含有poly-P顆粒，結(jié)合藍(lán)白斑篩選與異染粒染色結(jié)果確定這8株菌為反硝化聚磷菌。

表1 好氧培養(yǎng)24 h菌株反硝化除磷結(jié)果

由表1可知，菌株N6、N11、N13、N14、N23的反硝化率均大于70%，除磷率均大于50%，對(duì)這5株菌株進(jìn)行硝酸鹽還原產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)，結(jié)果N6、N13為陰性，N11、N14、N23為陽(yáng)性，選取反硝化率和除磷率均較高的N14為進(jìn)一步研究的高效反硝化聚磷菌。

2.2 N14特征

N14菌落奶白色，大小為0.5 μm×1.0 μm，邊緣整齊、光滑，表面濕潤(rùn)，中間凸起，半透明，易挑起。顯微鏡下可見(jiàn)菌株粗短桿狀，多數(shù)單個(gè)，極少數(shù)呈短鏈狀。菌體Albert 異染粒染色結(jié)果見(jiàn)圖1，從圖1可知，菌體內(nèi)含有poly-P顆粒。

圖1 菌株N14的poly-P染色

2.3 N14鑒定

N14為革蘭氏陰性菌，無(wú)芽孢，有厚莢膜，有運(yùn)動(dòng)性；硝酸鹽還原、硝酸鹽還原產(chǎn)氣、淀粉水解、檸檬酸鹽利用、過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性；產(chǎn)氨、產(chǎn)H2S、V-P、甲基紅、產(chǎn)吲哚陰性，初步鑒定菌株為克雷伯氏菌。以菌株總DNA為模版，經(jīng)PCR擴(kuò)增及16SrDNA測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其于已知的克雷伯氏屬Klebsiellasp. DAP24(登錄號(hào)：EU302849)的相似性達(dá)98%。因此經(jīng)鑒定菌株N14為克雷伯氏菌Klebsiellasp.，命名為Klebsiellasp. N14。

2.4 不同因素對(duì)N14脫氮除磷性能的影響

2.4.1 pH值

pH值影響細(xì)胞在培養(yǎng)基中的帶電狀態(tài)和氧化還原電位，從而影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和酶促反應(yīng)的進(jìn)行，因此pH變化對(duì)菌株脫氮除磷產(chǎn)生較大影響。由圖2可知，菌株在pH為5～8范圍內(nèi)OD600、脫氮率、除磷率逐步上升，在pH為8時(shí)生長(zhǎng)最好，此時(shí)OD600為1.26，脫氮除磷效能最佳，除磷率為81.6%，脫氮率為87.9%；但pH為5時(shí)OD600僅為0.28，脫氮除磷率最低，脫氮率為20.5%，除磷率為32.8%，顯示此條件下菌株生長(zhǎng)緩慢，脫氮除磷效果不理想；菌株在pH為9的條件下也能較好的生長(zhǎng)，此時(shí)OD600為0.95，脫氮率除磷率依然保持在71%、65%左右?？梢?jiàn)反硝化聚磷菌N14脫氮除磷最適宜的pH為中性及弱堿性，這與胡筱敏等[9]研究結(jié)果相一致。菌株在pH為5～9范圍內(nèi)生長(zhǎng)吸光度與脫氮除磷率呈簡(jiǎn)單的正態(tài)分布，表明菌株脫氮除磷效能與生長(zhǎng)代謝呈正相關(guān)。全程沒(méi)有檢測(cè)到氨氮濃度，這與生理生化鑒定時(shí)產(chǎn)氨反應(yīng)陰性相一致，也進(jìn)一步驗(yàn)證了硝酸鹽還原產(chǎn)氣生成的氣體為N2。

圖2 pH對(duì)菌株N14生長(zhǎng)及脫氮除磷性能的影響

2.4.2 溫 度

通常情況下，溫度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和代謝有如下影響：在溫度低至一定值時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞膜呈凝膠狀，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸受阻，細(xì)胞停止生長(zhǎng)；隨著溫度的升高，細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)加快，生長(zhǎng)加速；當(dāng)溫度升高超過(guò)上限溫度后，對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì)和核酸變性加劇，細(xì)菌生長(zhǎng)停止，甚至死亡。因此，在其它條件不變情況下，細(xì)菌生長(zhǎng)有最適生長(zhǎng)溫度區(qū)間。由圖3可知，菌株在好氧培養(yǎng)24 h后，在20～30 ℃范圍內(nèi)OD600、脫氮率、除磷率逐步上升，20 ℃時(shí)OD600為0.89，脫氮率、除磷率分別為70.5%、50.2%，可見(jiàn)此溫度下菌株能較好的生長(zhǎng)，且維持較高的脫氮除磷率，暗示N14可能耐受低溫生長(zhǎng)，可作為耐冷反硝化聚磷菌備選菌種；25 ℃時(shí)除磷率最高，為86.2%；30 ℃時(shí)OD600、脫氮率達(dá)最高值，OD600為1.28，脫氮率為88.2%，除磷率為82.7%；35 ℃時(shí)OD600、脫氮除磷率略有下降，40℃時(shí)明顯降低，OD600為0.47，脫氮除磷率分別為40.8%、37.6%。菌株適宜生長(zhǎng)的溫度范圍是20～30 ℃。

圖3 溫度對(duì)菌株N14生長(zhǎng)及脫氮除磷性能的影響

2.4.3 碳 源

圖4 碳源對(duì)菌株N14生長(zhǎng)及脫氮除磷性能的影響

2.5 N14脫氮除磷效果

圖5 N14脫氮除磷性能

3 結(jié) 論

(1)以乙酸鈉/丙酸為交替碳源，對(duì)活性污泥進(jìn)行為期40 d厭氧/缺氧培養(yǎng)，通過(guò)藍(lán)白斑篩選、poly-P染色、硝酸鹽還原產(chǎn)氣及脫氮吸磷效能實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，篩選到1株高效反硝化聚磷菌N14，經(jīng)16SrDNA基因序列分析及生理生化實(shí)驗(yàn)，初步鑒定菌株N14為Klebsiellasp.，命名為Klebsiellasp.N14。

(2)菌株N14對(duì)pH的耐受范圍較廣，其脫氮除磷的適宜pH是中性偏堿，最適pH是8；適宜生長(zhǎng)的溫度范圍在20～35 ℃之間，脫氮除磷的最適溫度是30 ℃；當(dāng)碳源為乙酸鈉時(shí)，菌株生長(zhǎng)及脫氮除磷效能最佳，碳源為檸檬酸鈉時(shí)，菌株脫氮除磷效果最差。

(3)菌株在pH為8，溫度為30 ℃條件下好氧培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)液上清液中磷濃度從81 mg/L降到12.4 mg/L，除磷率為88.5%，硝酸鹽氮濃度從180 mg/L降到15 mg/L，亞硝酸鹽氮濃度從94 mg/L降到6.7 mg/L，脫氮率為84.7%。