崔兆海，趙衛(wèi)忠，馬 磊，高菁霞，朱文勇，李衛(wèi)東，廖國陽

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所， 昆明 650018)

甲型H7N9禽流感是一種人畜共患病，且死亡率高[1]。2013年在中國首次報道流感病毒H7N9感染人，隨后H7N9流感病毒共引起5波流感爆發(fā)[2-4]。據(jù)相關報道，截止2018年6月，一共有1 567人感染H7N9禽流感病毒，其中死亡615人[5]。2013年在中國發(fā)現(xiàn)的33例感染者中就有9人死亡[6]。流感病毒是RNA病毒，易出現(xiàn)變異，近年高致病的H7N9毒株的出現(xiàn)，可能會給人類帶來更大的危害[7]。

目前，應對流感大爆發(fā)最有效的手段仍然是疫苗的接種[8，9]。而流感疫苗的生產(chǎn)除了對宿主有一定的要求外，對疫苗株的傳代穩(wěn)定性也有要求[10]。本文將H7N9 Vero細胞適應株(A/Anhui/1/2013Va)在Vero細胞上連續(xù)傳代，并在病毒分子水平和細胞水平進行研究，以確定該毒株是否可以作為Vero細胞生產(chǎn)H7N9流感疫苗的種子，以期為開發(fā)細胞流感疫苗提供前期研究。

1 材料與方法

1.1 細胞及毒株

第145代Vero細胞購自美國ATCC;甲型流感病毒Vero細胞適應株A/Anhui/1/2013Va(H7N9)為本實驗室構(gòu)建及保存，毒株的構(gòu)建在成都軍區(qū)疾病控制中心P3實驗室中完成;MDCK細胞(P18)購自中國科學院昆明動物所細胞庫(KBC2006105YJ)，應用時代次為第30代。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM/F12(Lot8119213)、MEM培養(yǎng)基均購自Gibco公司；TPCK胰酶(Lot39B19083)購自Worthington公司；牛血清白蛋白(Lot.No.913Z0517)購自北京索萊寶科技有限公司；RNA病毒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；H7N9抗原標準品(NIBRG-268)和H7抗血清標準品(Sheep SH644)均購自NIBSC。

1.3 病毒傳代穩(wěn)定性

Vero細胞按照1∶4傳代，顯微鏡下觀察細胞長成致密單層時，將病毒從-70 ℃取出，流水融化后按照病毒感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為0.01的病毒量接種H7N9 病毒，35 ℃吸附2 h后將吸附液棄掉，用PBS洗細胞面2次，再加病毒維持液10 mL繼續(xù)置于35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，72 h時細胞完全被病毒裂解，收取病毒液。病毒連續(xù)傳代15次，每次試驗做2次重復。

1.4 血凝試驗

將新鮮的雞血紅細胞用生理鹽水配成1%的體積濃度，在96孔板的U形板的A1～H12孔中各加入50 μL生理鹽水，具體方法參照郭元吉等[11]。在血凝板的第一行(A1～H1)孔中依次加入待檢測流感病毒樣品50 μL，用8道移液器將第一列的生理鹽水或樣品吹打混勻后，取50 μL到第二列，更換槍尖，再按照同樣的操作依次將樣品進行倍比稀釋，到最后一個稀釋度時，棄掉50 μL液體。同時設立陰性對照孔，在各孔加入新鮮配置的1%雞紅細胞懸液50 μL，輕輕拍打U形板外壁，室溫靜置30 min后觀察并記錄結(jié)果。

1.5 各代病毒收獲液TCID50的檢測

MDCK細胞長成致密單層后，用0.125%的EDTA-胰酶消化后計數(shù)，按照每孔2×104個細胞的量接種到96孔板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)約24 h。用病毒維持液將病毒從10- 4稀釋到10- 9，每個稀釋度接種8孔，每孔接種100 μL病毒，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，血凝試驗檢測病毒效價，Reed-Muench法[12]計算病毒的組織培養(yǎng)半數(shù)感染量(50%tissue culture infection dose，TCID50)。每塊96孔板做1次重復。

1.6 病毒生長曲線

將第16代的病毒按照MOI為 0.01的病毒量接種于Vero細胞。在24、36、48、60、72 h分別取病毒上清，血凝試驗檢測不同時間段的病毒效價，試驗重復3次。觀察細胞接毒后不同時間段的病變狀況。

1.7 單向免疫擴散試驗

在瓊脂糖凝膠中混入抗血清標準品，將其鋪好并在上面打孔?？字屑尤霕藴士乖痛龣z樣品(第1和16代病毒)，室溫進行免疫擴散。若待檢樣品和標準樣品型別一致，則會形成抗原抗體復合物，考馬斯亮藍染色后形成肉眼可見的擴散環(huán)。

1.8 不同代次重配H7N9病毒的雞胚半數(shù)感染量試驗

將第1、5、16代的病毒用0.01 mol/L的PBS按照對數(shù)稀釋法從10-1稀釋至10-9，每個稀釋度接種9日齡雞胚4枚，每枚接種病毒液200 μL；35 ℃、65%濕度的孵箱培養(yǎng)3 d后取尿囊液進行血凝試驗檢測病毒的效價，計算病毒的雞胚半數(shù)感染量(egg 50% infectious dose，EID50)。

1.9 測定H7N9重配病毒雞胚半數(shù)致死量

將第1、5、16代的病毒用0.01 mol/L的PBS按照對數(shù)稀釋法稀釋，以107、106、105EID50分別接種9日齡雞胚，每個稀釋度接種雞胚6枚，每枚接種0.2 mL，接種12 h時，檢查雞胚生長狀態(tài)，棄掉死胚，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，統(tǒng)計雞胚死亡數(shù)量。

1.10 重配毒株HA和NA基因穩(wěn)定性的研究

為了檢測病毒在Vero細胞上連續(xù)傳代后血凝素(hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)基因是否發(fā)生變異，我們將培養(yǎng)的第1代和第16代病毒的HA和NA基因分別克隆到pLB載體上，并將構(gòu)建好的質(zhì)粒送往生工測序。測序結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站及DNA STAR軟件分析，確定病毒的HA和NA基因在Vero細胞連續(xù)傳代過程中是否發(fā)生變異。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒連續(xù)傳代每代效價及感染性滴度

重配病毒從第2代在Vero細胞上連續(xù)傳至第16代。每代病毒收獲液的血凝效價變化如圖1a所示：從圖中可以看出，從第8代病毒開始，病毒在Vero細胞上的病毒效價基本趨于穩(wěn)定，而且隨著病毒代次的增高，病毒的效價穩(wěn)定維持在384～448；病毒的感染性滴度從第2代開始均在1×106.75TCID50/mL以上，且隨著病毒代次的增高，病毒感染性滴度維持在1×107TCID50/mL左右。

圖1 各代病毒的效價及感染性滴度Fig.1 Viral titer and infectious titer of each generation of virus

2.2 病毒在Vero細胞的生長曲線

病毒接種Vero細胞后在不同時間段的產(chǎn)量不同，從圖2a可以看出病毒在各個時間段病毒效價的差異。在24 h內(nèi)取病毒維持液上清，血凝試驗結(jié)果為陰性。隨著培養(yǎng)時間的推移，病毒產(chǎn)量逐漸增高，直至細胞完全病變，病毒效價達到最高。顯微鏡下觀察接種病毒后不同時間段的Vero細胞，如圖2b所示的是病毒接種24 h的細胞，細胞的形態(tài)正常；到48 h時病毒的增殖使得部分細胞裂解，細胞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖2c)；72 h時細胞完全裂解，這時病毒效價達到最高，為448(圖2d)。流感病毒為胞外毒，通過對細胞裂解狀態(tài)的觀察及病毒在不同時間段效價的高低可以確定具體的收毒時間。

2.3 單向免疫擴散結(jié)果

如圖3所示：其中1和4是H7N9抗原標準品；2和5是第16代病毒；3和6是第1代病毒。重配病毒H7N9與NIBSC的標準抗H7N9抗血清反應后出現(xiàn)抗原抗體免疫復合物擴散環(huán)，雖然與標準H7N9抗原形成的環(huán)大小有差異，但是足以說明重配病毒H7N9血清型表型屬于H7型。

圖2 病毒生長曲線及病毒感染后不同時間段細胞狀態(tài)Fig.2 Virus growth curve and cell status at different time periods after virus infection(a)病毒在Vero細胞的增長曲線；(b)接種病毒24 h時Vero細胞的狀態(tài)；(c)病毒接種Vero細胞48 h時細胞狀態(tài)；(d)病毒接種Vero細胞72 h時細胞狀態(tài)(a)The growth curve of the virus in Vero cells;(b)The state of Vero cells at 24 hours after virus inoculation;(c)Cell status of Vero cells inoculated with virus at 48 h;(d)Cell status of Vero cells inoculated with virus at 72 h

圖3 單向免疫擴散型別鑒定結(jié)果圖Fig.3 Identification results of unidirectional immune diffusion type1和4：標準抗原；2和5：第16代病毒；3和6：第1代病毒1 and 4:Standard antigen;2 and 5:The 16th generation virus;3 and 6:The firse generation virus

2.4 病毒雞胚半數(shù)感染量及致死量

第1、5、16代病毒在9日齡雞胚半數(shù)感染量結(jié)果如表1所示。其中第1代病毒的EID50是106/0.2 mL，第5代病毒的EID50是106.25/0.2 mL，第16代病毒的EID50是106.25/0.2 mL。從以下結(jié)果可以看出病毒在傳代的過程中，不同代次的病毒雖然雞胚半數(shù)感染量存在差異，但是差異不顯著。107、106、105EID50分別接種9日齡雞胚孵育72 h，檢蛋后并未發(fā)現(xiàn)死胚的存在, 說明病毒在傳代過程中，其毒力并未發(fā)生改變。

表1 不同代次的病毒雞胚半數(shù)感染量Tab.1 Half infection of viral chicken embryos in different generations

2.5 病毒連續(xù)傳代的HA和NA基因穩(wěn)定性

提取第1代和第16代H7N9病毒的基因，陽性克隆PCR結(jié)果如圖4所示。HA和NA核苷酸大約在1 500 bp左右，挑選出陽性克隆菌落，通過測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),病毒在Vero細胞上連續(xù)傳代過程中，第1代病毒中NA的核苷酸序列與第16代病毒的一致，并未出現(xiàn)基因位點的改變。序列對比如圖4e所示，HA的核苷酸序列編碼框內(nèi)A12G發(fā)生了同義突變，但并未造成編碼氨基酸的改變。從基因序列水平上驗證病毒的型別并未發(fā)生改變，這進一步說明病毒在Vero細胞上傳代后基因是相對穩(wěn)定的。

圖4 第1和第16代H7N9陽性克隆PCR鑒定及序列對比Fig.4 PCR identification and sequence comparison of P1 and P16 generation H7N9 positive clones(a)第1代病毒HA；(b)第16代病毒HA；(c)第1代病毒NA；(d)第16代病毒NA；(e)HA對比序列。紅色圓內(nèi)是同義突變位點(a)The HA gene of the first generation virus;(b)The HA gene of the 16th generation virus;(c)The NA gene of the first generation virus;(d)The NA gene of the 16th generation virus(e)HA alignment sequence. Synonymous mutation sites are inside the red circle

3 討論

雖然流感病毒對雞胚較敏感，但是雞胚作為生產(chǎn)流感病毒的基質(zhì)，不僅存在流感流行時雞胚供不應求的問題，且在疫苗生產(chǎn)過程中，存在雞胚易污染、病毒在雞胚中增殖時HA基因易變異等問題[13]。以MDCK細胞作為基質(zhì)生產(chǎn)的流感疫苗雖然已有產(chǎn)品上市，但是MDCK致瘤性問題一直存在爭議。現(xiàn)有多項研究表明Vero細胞可以作為流感疫苗的生產(chǎn)基質(zhì)[14-16]。

流感病毒感染早期奧司他韋等藥物可控制病情，奧司他韋主要通過抑制流感病毒的神經(jīng)氨酸酶進而抑制病毒的增殖。但是近年相關研究報道NA的R294K的突變使得NA阻斷劑的效果降低[17]。基質(zhì)蛋白2(matrix protein，M2)S31N的突變使得病毒對金剛烷胺不敏感[18]。耐藥株的出現(xiàn)使得免疫保護策略顯得尤為重要。目前H7N9禽流感疫苗的免疫效果及安全性研究仍處于臨床試驗階段，未有成品上市[19，20]，這也意味著H7N9 Vero細胞適應疫苗株地開發(fā)仍有著重要意義。

本研究將重配病毒在Vero細胞上連續(xù)傳15代，從第8代開始病毒的血凝效價趨于穩(wěn)定，血凝效價維持在384～448。病毒的感染性滴度Log10TCID50/mL維持在7左右，均達藥典要求。從第7代到第8代，病毒血凝效價有一個上升峰，可能是由于除HA和NA基因，病毒外內(nèi)部6個基因中某些位點的改變使得病毒在Vero細胞上的適應性進一步增強，病毒產(chǎn)量從而升高的結(jié)果。通過對第1和16代的病毒基因測序分析發(fā)現(xiàn)，病毒在傳代過程中型別均未發(fā)生改變，基因編碼的HA和NA蛋白氨基酸序列也未發(fā)生改變。以上試驗結(jié)果證明，該重配病毒不僅在Vero細胞上高產(chǎn)，其在傳代過程中HA和NA抗原基因序列也是穩(wěn)定的。通過病毒生長曲線的繪制及細胞接種病毒后不同時間段細胞病變的狀況得知，最佳收毒時間為72 h左右?？傊?，本研究證明該H7N9毒株具備疫苗供體株生產(chǎn)疫苗的能力，為H7N9疫苗的開發(fā)及H7N9流感的防控奠定了物質(zhì)及技術基礎。