王 道，施曉波，陳建林

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院婦產(chǎn)科， 長(zhǎng)沙 410011)

人髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)屬于調(diào)節(jié)先天免疫的銜接蛋白，在人體內(nèi)病毒和細(xì)菌感染的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的功能[1-4]。Lord等[5]在髓樣前體的鼠骨髓中分析發(fā)現(xiàn)了MyD88基因。以往研究發(fā)現(xiàn)其在免疫細(xì)胞如單核細(xì)胞系、胸腺細(xì)胞系、T 淋巴細(xì)胞系、B淋巴細(xì)胞系、Th1細(xì)胞系和Th2細(xì)胞系中表達(dá)，說(shuō)明人MyD88蛋白具有廣泛分布性[6-8]。而且，大量研究集中關(guān)注人MyD88在炎癥、腫瘤等領(lǐng)域發(fā)揮的作用[9-12]。Chen等[13]發(fā)現(xiàn)MiR-146a通過(guò)TLR4/MyD88信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑能夠減輕急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。Zhu等[14]和Sewastianik等[15]發(fā)現(xiàn)人MyD88影響了癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。Kfoury等[16,17]報(bào)道人MyD88可能具備雙重功能，既發(fā)揮促腫瘤作用，也可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)發(fā)揮抗腫瘤作用。本文對(duì)人MyD88結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析，并闡述其功能，為疾病治療等提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人(Q99836)、大鼠(Q6Y1S1)、小鼠(P22366)、雞(A5HNF6)、豬(A0A140TAK4)的 MyD88 蛋白序列都從UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org)獲取，人MyD88基因的核酸序列Accession(NC_000003.12)從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取。

1.2 方法

對(duì)人MyD88使用多種生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析,具體見(jiàn)表1。

表1 預(yù)測(cè)分析人MyD88結(jié)構(gòu)和功能的生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)Tab.1 Important databases for predictive analysis of human MyD88 structure and function

2 結(jié)果與分析

2.1 人MyD88基因的開(kāi)放閱讀框和染色體定位

人MyD88基因全長(zhǎng)為5 670 bp，位置為38 138 006～38 143 675，共有649個(gè)開(kāi)放閱讀框，如圖1a所示。Ensemble(http://asia.ensembl.org/)顯示該基因位于3號(hào)染色體上(3p22.2)(圖1b)。

圖1 人MyD88基因的開(kāi)放閱讀框(a)和基因的染色體定位信息(b)Fig.1 The open reading frame (a) and chromosome location of human MyD88 gene (b)

2.2 人MyD88蛋白的理化性質(zhì)分析

使用ProtParam預(yù)測(cè)分析了人MyD88蛋白的理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白由296個(gè)氨基酸殘基組成，含有36個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)和38個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)；總分子式為C1 471H2 361N403O437S16，總原子數(shù)為4 691，分子質(zhì)量為33 233.36；半衰期是30 h；等電點(diǎn)是5.89；消光系數(shù)是38 430；疏水值是92.30，平均親水性是-0.174；不穩(wěn)定系數(shù)是45.58，人MyD88為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.3 人 MyD88 蛋白物種同源性分析

把人(Homosapiens)(Q99836)MyD88 的氨基酸序列與大鼠(Rattusnorvegicus) (Q6Y1S1)、 小鼠(Musmusculus)(P22366)、雞(Gallusgallus)(A5HNF6)和豬(Susscrofa)(A0A140TAK4)的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)和構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。比對(duì)結(jié)果如圖2a所示，具有相似性高的氨基酸是從第145位至第295位，5個(gè)物種的氨基酸序列相似性較高，同源性較高。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果如圖2b所示，人與豬、小鼠、大鼠進(jìn)化距離較近，但是與雞相距較遠(yuǎn)，說(shuō)明人MyD88蛋白在哺乳動(dòng)物之間的保守性較高，可推測(cè)其有重要的功能。

圖2 人MyD88氨基酸序列比對(duì)(a)和進(jìn)化樹(shù)分析(b)Fig.2 Sequence alignment analysis (a) of human MyD88 and phylogenetic tree (b)

2.4 人MyD88蛋白在正常組織的表達(dá)分布

通過(guò)GEDS在線分析數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/GEDS/)分析，結(jié)果顯示，人MyD88蛋白在血液中表達(dá)量最高，其次是脾臟和肺，心臟、腦的含量處于較低水平，在肌肉中的表達(dá)量是最低的，可推測(cè)其在血液中的表達(dá)量對(duì)發(fā)揮生物學(xué)作用是至關(guān)重要的(圖3)。

2.5 人MyD88蛋白的信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析

利用SignalP 4.1 Server網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP- 4.1/)進(jìn)行信號(hào)肽分析，Cut-off default=0.450。結(jié)果顯示，C-Max Position、Y-Max Position、S-Max Position 分別為 46、46、44，其中C-Max Value、Y-Max Value、S-Max Value 分別為0.185、0.182、0.500，S-mean(1～ 45)和D (1～ 45)分別為0.182、0.182，得分值Score<0.450，提示人MyD88不存在信號(hào)肽，屬于非分泌性蛋白(圖4)。采用Genecards網(wǎng)站(https://www.genecards.org/)進(jìn)行人MyD88蛋白的亞細(xì)胞定位分析，根據(jù)Confidence(0～5)對(duì)應(yīng)顏色的深淺，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要分布在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和囊泡中，而且在質(zhì)膜、線粒體、溶酶體中也有分布，表明人MyD88參與了維持細(xì)胞正常形態(tài)和骨架結(jié)構(gòu)的過(guò)程(圖5)。

2.6 人MyD88蛋白的磷酸化位點(diǎn)和蘇木化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析

提交人MyD88蛋白的氨基酸序列到NetPhosK 2.0和SUMOPLOT進(jìn)行軟件預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示,有25個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中磷酸化絲氨酸位點(diǎn)15個(gè)(氨基酸位置分別為 15、16、18、19、34、85、108、137、194、224、230、242、244、266、294位)，磷酸化蘇氨酸位點(diǎn)6個(gè)(氨基酸位置分別為 17、66、149、202、237、272位)，磷酸化酪氨酸位點(diǎn)4個(gè)(氨基酸位置分別為 58、116、227、276位)(圖6)。人MyD88蛋白上存在一些容易發(fā)生蘇木化修飾的位點(diǎn)，其中K261位點(diǎn)發(fā)生概率最高(Score=0.80>0.50)，K262位點(diǎn)概率較小(Score=0.13<0.50)(圖7)。結(jié)果表明，人MyD88可能發(fā)生絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸激酶磷酸化以及K261位點(diǎn)的蘇木化修飾發(fā)揮調(diào)控機(jī)制。

圖3 人MyD88在正常組織的表達(dá)量分析Fig.3 Analysis of normal tissues expression of human MyD88

圖4 人MyD88信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.4 Signal peptide prediction of human MyD88

圖5 人MyD88亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Fig.5 Subcellular location prediction of human MyD88

圖6 人MyD88蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.6 Phosphorylation sites prediction of human MyD88

圖7 人MyD88蛋白SUMO化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.7 Sumolation sites prediction of human MyD88

2.7 人MyD88蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

運(yùn)用Jpred 4.0蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)在線分析網(wǎng)站(http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)人MyD88蛋白存在145個(gè)α-螺旋，其占55.07%(163/296),存在 30個(gè)β-折疊，其占38.18%(113/296)，剩余的是無(wú)規(guī)則卷曲。說(shuō)明該蛋白是以α螺旋為主，具有超過(guò)50%氨基酸的有序空間構(gòu)象(圖8)。

Swiss-Model網(wǎng)站(https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)人MyD88三級(jí)結(jié)構(gòu)存在2種模型。模型A(圖9a)和模型B(圖 9b)對(duì)應(yīng)的模板都不同，其主要重疊分別在第146～296 位氨基酸、第26～117 位氨基酸，序列等同度分別為62%、59%。而且圖9c峰圖波形比圖9d峰圖穩(wěn)定，可推測(cè)模型A更加符合人MyD88蛋白的三級(jí)真實(shí)結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步對(duì)模型A的可靠性進(jìn)行分析，如圖10拉曼圖表明，除160位、188位和269位的精氨酸(Arg)，150位和199位的亮氨酸(Leu) 以及244位的絲氨酸(Ser)和202位的蘇氨酸(Thr)以外, 大于90%的氨基酸位于紅色核心區(qū)域，其中黃和紅色區(qū)域形成二面角合理, 有較好的三級(jí)構(gòu)象空間，深入證明了模型A的三級(jí)結(jié)構(gòu)的可靠性。

圖8 人類MyD88二級(jí)蛋白結(jié)構(gòu)分析Fig.8 Secondary protein structure analysis of human MyD88 H:α-螺旋；E:β-折疊H:α-helix; E:β-sheet

圖9 人類MyD88的三級(jí)蛋白結(jié)構(gòu)構(gòu)象圖Fig.9 Tertiary protein structure model prediction of human MyD88(a)人類MyD88三級(jí)結(jié)構(gòu)模型A； (b)人類MyD88三級(jí)結(jié)構(gòu)模型B； (c)與模型A的模板相似性峰圖； (d)與模型B的模板相似性峰圖(a)The tertiary structure model A of human MyD88; (b)The tertiary structure model B of human MyD88; (c)Peak map of template similarity to the model A; (d)Peak map of template similarity to the model B

圖10 人類MyD88模型A的拉曼構(gòu)象圖分析Fig.10 Ramachandran map analysis model A of human MyD88

2.8 人MyD88蛋白String分析和GO分析

通過(guò) String 數(shù)據(jù)庫(kù)分析預(yù)測(cè)與人MyD88發(fā)生相互作用的蛋白，發(fā)現(xiàn)與人MyD88 相互作用前10的蛋白質(zhì)為IL1R1、IRAK4、IRAK1、TRAF6、IRAK2、TLR3、IRAK3、IRF7、TLR7、MAP3K7，具體如圖11所示。其中IL1R1、IRAK1、IRAK4、IRF7 等蛋白在先天免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用，TLR3和TLR7蛋白屬于先天和適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵組成部分，表明該蛋白在先天性免疫反應(yīng)中起核心作用。

GO(gene ontoloty)注釋分析的細(xì)胞組分結(jié)果提示:人MyD88蛋白主要定位在核內(nèi)體，在胞質(zhì)內(nèi)大量分布；分子功能結(jié)果表明，人MyD88蛋白屬于Toll樣受體(TIR)，具有TIR結(jié)構(gòu)域，能夠與白介素-1受體和凋亡受體等其他蛋白受體結(jié)合且形成二聚體結(jié)構(gòu)；生物學(xué)過(guò)程表明，人MyD88 參與調(diào)控趨化因子的生物合成、誘導(dǎo)機(jī)體抵抗、調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等過(guò)程，分析結(jié)果和人 MyD88 互相作用蛋白參與免疫反應(yīng)相一致(圖12)。

圖11 預(yù)測(cè)與人類MyD88發(fā)生相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)Fig.11 Protein network interacted with human MyD88(a)相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)圖；(b)蛋白相互作用連線說(shuō)明(a)Interacting protein prediction;(b)Instructions with protein interaction lines

圖12 人類MyD88的GO注釋分析Fig.12 GO analysis of human MyD88綠色表示細(xì)胞組分；紅色表示分子功能；黃色表示生物學(xué)過(guò)程Green means cellular component;Red means molecular function;Orange means biological processes

3 討論

人MyD88是由296個(gè)氨基酸構(gòu)成，以α-螺旋為主的二級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白,本文結(jié)果表明，其在血液、脾臟等淋巴器官中存在高度表達(dá)，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的其在單核細(xì)胞、T、B、NK和樹(shù)突細(xì)胞表達(dá)是相符的[18,19]。以往研究也證實(shí)，由于所有TLR/IL-1R都能與人MyD88發(fā)生相互作用，病原體和宿主的刺激對(duì)TLR/IL-R的異常激活，可以產(chǎn)生一系列炎癥細(xì)胞因子和其他介質(zhì)[20]。當(dāng)前，人MyD88在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用也受到人們的日益關(guān)注。Wu等[21]在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)人MyD88表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān)。我們推斷檢測(cè)人MyD88在腫瘤中的表達(dá)可以預(yù)測(cè)人類癌癥，如脾臟、淋巴、結(jié)腸腫瘤等。最近，Wang等[22]的研究也發(fā)現(xiàn)人MyD88具有雙重功能，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲和自我更新，發(fā)揮促腫瘤作用以及維持腫瘤的抗腫瘤作用，推測(cè)人MyD88可能參與癌癥相關(guān)細(xì)胞信號(hào)通路以外的其它機(jī)制。

為了探究這種可能的機(jī)制，我們首先對(duì)人MyD88基因進(jìn)行分析，結(jié)構(gòu)分析表明，該基因位于3號(hào)染色體上，基因全長(zhǎng)為5 670 bp，同源比對(duì)結(jié)果表明人、豬、小鼠和大鼠均具有較高的相似性。這提示我們?cè)谶M(jìn)行動(dòng)物模型研究中需選取同源性較高的部分序列，研究其在進(jìn)化中保留的重要生物學(xué)作用。而且，人MyD88蛋白是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白，不含信號(hào)肽，亞細(xì)胞定位大量存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，在線粒體和溶酶體內(nèi)也有一些分布，這些都揭示其能夠在胞內(nèi)組裝折疊成相應(yīng)結(jié)構(gòu)并結(jié)合相應(yīng)蛋白質(zhì)，隨后參與線粒體、細(xì)胞核、過(guò)氧化物酶體等免疫應(yīng)激反應(yīng)，與Balaji等[23,24]報(bào)道其可能定位于核內(nèi)并行使較多功能的特點(diǎn)相一致。我們還推測(cè)，人MyD88存在25個(gè)磷酸化位點(diǎn)和2個(gè)蘇木化位點(diǎn)，這與Wu等[25]運(yùn)用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)證實(shí)的磷酸位點(diǎn)和 Lanfranca等[26]證實(shí)的E3泛素連接酶能蘇木化修飾且阻斷人MyD88下游的信號(hào)傳導(dǎo)同時(shí)能降低其表達(dá)的報(bào)道是一致的。

此外，本文預(yù)測(cè)的人MyD88和IRAK、TLR等發(fā)生相互作用也在相關(guān)文獻(xiàn)中有報(bào)道[27,28]。有趣的是，Wang等[29]證實(shí)人MyD88與caspase3介導(dǎo)的凋亡途徑有關(guān)。Huang等[30]發(fā)現(xiàn) TLR4-MyD88-JNK信號(hào)通路促進(jìn)大鼠的炎癥反應(yīng)，從而引起神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。Saxena等[31]發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制人MyD88阻斷IL-1受體信號(hào)，可以減少對(duì)血管損傷的新內(nèi)膜形成，降低平滑肌細(xì)胞的過(guò)度增殖。

綜上所述，生物信息學(xué)是一種新的研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)的重要手段，能夠進(jìn)一步挖掘基因的潛在功能。后續(xù)我們還需進(jìn)行人MyD88蛋白表達(dá)及功能驗(yàn)證試驗(yàn)來(lái)判定預(yù)測(cè)結(jié)果的精準(zhǔn)性，為其今后成為潛在的靶分子用于疾病診斷和治療奠定基礎(chǔ)。